通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪
Rapid Production of Gene-editing Pigs by Identifying Minimum Numbers of Positive Fibroblasts for SCNT
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Keywords:
- pig /
- gene-editing /
- cell selection /
- somatic cell nuclear transfer
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棉花是中国主要的经济作物之一，总种植面积约占中国经济作物的1/3。棉花病虫害种类繁多，高达300多种，常见的害虫有30多种，病害有20多种；棉花常年受病虫害威胁，造成的经济损失达15%~20%[1]。棉蚜是棉花苗期的重要害虫之一，习惯聚集于棉花嫩头或叶片背部刺吸棉花汁液，造成棉花植株矮小、叶片卷曲和萎缩，蚜虫排泄的蜜露容易滋生霉菌，造成煤污病，影响棉花正常生长，严重时造成棉花减产甚至死亡[2]。棉花蚜虫发生频繁，已成为制约棉花生产的重要因素。提高农药对棉蚜的防治效果尤为重要。
长期以来，棉花蚜虫的化学防治主要依赖传统的施药器械，如人工背负式喷雾器和喷杆喷雾机等地面机械，存在劳动强度大、作业成本高和作业效率低等问题。棉蚜属于暴发性害虫，采用传统植保技术施药难以在短期内达到普遍防治的要求[3]。近年来，中国农业航空产业发展迅速，植保无人机(unmanned aerial vehicle，UAV)航空施药成为新型植保作业方式[4]。植保无人机属于低空低量施药，旋翼产生的下压风场有利于增加药液雾滴对作物的穿透性及均匀性，作业效果优于手动植保机械[5-6]。目前，植保无人机施药技术在小麦、玉米和水稻等作物得到了广泛应用，在橡胶、槟榔和柑橘等高大植株的病虫害防治中也发挥了重要作用[7-11]。
大量作业实践结果证明：植保无人机作业效果与无人机机型、作业参数和作物长势等因素有关[12-14]，同时还受药剂类型和助剂等影响[15-16]。植保无人机多采用离心和雾化喷头，喷出的雾滴直径细小；而传统剂型农药分子粒径过大、溶解性差且杂质较多，容易堵塞喷头，不适合植保无人机使用。因此，急需开发粒径更小、渗透更强、适应植保无人机作业的新型农药剂型。纳米农药粒径范围小，具有水溶性好、渗透性强、持效性好、沉降速度快和飘移小等特点[17-18]，适宜植保无人机作业。肖汉祥等[19]分别在水稻分蘖期和破口期采用广州极飞 P20植保无人机喷施南京善思航空专用纳米农药，发现纳米农药对水稻稻飞虱和稻纵卷叶螟的防效均在90%以上，明显优于常规药剂；赵莲英[20]使用大疆 MG-1S植保无人机在水稻田喷施杀虫剂防治水稻病虫害，发现纳米农药水性制剂组合对病虫害的总体防效优于常规药剂组合，对水稻具有一定的增产效果。但在棉花蚜虫植保无人机防治方面，仍以传统农药及助剂的筛选为主[21-22]，目前尚无无人机喷施纳米农药在棉蚜防治方面的报道。本研究通过植保无人机喷施常规药剂和纳米药剂，分析不同类型药剂在棉田的雾滴沉积分布和药液利用情况，验证纳米农药对棉蚜的防治效果，以期为纳米农药的大面积推广应用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 供试药剂
药剂：纳米药剂为3.5%啶虫脒·高效氯氟氰菊酯水性制剂，由南京善思生物科技有限公司提供；常规药剂由5%啶虫脒和2.5%高效氯氟氰菊酯混配而成，其中5%啶虫脒由安阳全丰生物科技有限公司提供，2.5%高效氯氟氰菊酯由济南绿霸农药有限公司提供。采用食品染色剂诱惑红 (西安依诺进出口贸易有限公司生产) 作为雾滴沉积分布的指示剂。
1.2 供试设备
3WQF120-12型智能油动单旋翼农用植保无人机由安阳全丰生物科技有限公司提供，喷头型号为德国 LECHLER公司的LU120-015，无人机主要性能参数如表1所示。人工背负式喷雾器为“没得比(Matabi)”16型喷雾器，由西班牙GOiZPER喷雾器有限公司生产。
表 1 全丰3WQF120-12植保无人机主要参数Table 1. Main parameters of Quanfeng 3WQF120-12 UAV主要参数 main parameter 数值 value 整机尺寸/m overall size 2.13×0.70×0.67 整机质量/kg overall weight 30 药箱容量/L pesticide tank capacity 12 喷洒流量/(L·min−1) spraying flow 0.8~1.6 飞行高度/m flight height 1~3 有效喷幅/m spraying swath 4~6 飞行速度/(m·s−1) flight velocity 2~6 1.3 试验地概况
试验地设在中国农业科学院棉花研究所试验农场(河南省安阳县)。棉花品种为中棉所79，种植密度为5.5万株/hm2，行距0.8 m。棉花处于苗期，平均株高0.1 m。施药期间天气晴朗，南向微风，平均风速1.6 m/s，温度27.6 ℃，相对湿度42.9%。
1.4 试验方法
1.4.1 试验设计与处理
试验共设7个处理(表2)，每处理小区长50 m，宽16.8 m，面积840.0 m2。为避免各小区相互干扰，小区之间设置4 m宽隔离带。
表 2 试验设计Table 2. Test design处理 treatment 施药方式 spray method 药剂 pesticide 飞行高度/m flight height 1 植保无人机喷雾
plant protection UAV spray常规农药 conventional pesticide 1.5 2 常规农药 conventional pesticide 2.5 3 纳米农药 nanopesticide 1.5 4 纳米农药 nanopesticide 2.5 5 人工喷雾
manual spray常规农药 conventional pesticide — 6 纳米农药 nanopesticide — 7 (CK) — 不施药 no pesticide application — 常规药剂和纳米药剂处理中啶虫脒有效成分为30 g/hm2，高效氯氟氰菊酯有效成分为22.5 g/hm2，各处理药液中添加150 g/hm2的诱惑红。前期植保无人机喷雾试验[23-24]结果表明：无人机飞行高度和喷雾量是影响雾滴沉积分布的重要因素，为提高雾滴在棉花叶片上的有效沉积，本研究植保无人机在5 m/s的飞行速度下，采用18 L/hm2的喷液量进行喷雾。为评估飞行高度对植保无人机喷雾效果的影响，设置飞行高度为1.5 和2.5 m。人工喷雾处理喷雾量为450 L/hm2。
1.4.2 雾滴沉积分布的测试布点和测定
以水敏纸为雾滴采集卡，并在无人机喷雾小区内横向15株棉花上进行布设(图1)，每株棉花选取1个叶片用回行针将水敏纸固定到棉花叶片上，每排间距为10 m。喷雾结束后，收集每个采样点的水敏纸，并依次标记各采样点位置 (−7、−6、−5、−4、−3、−2、−1、0、1、2、3、4、5、6、7)，带回室内用扫描仪(Epson Perfection V850 Pro，爱普生中国有限公司生产)扫描，扫描后的图片用Image J 1.38X图像分析软件进行分析，得到覆盖密度和雾滴覆盖率等雾滴沉积分布参数。以雾滴体积累计分布为50%的雾滴直径，即雾滴体积中径 (DV0.5) 比较分析不同处理的雾滴粒径大小。
1.4.3 农药沉积利用率测定
参照石鑫等[25]的方法利用诱惑红作为示踪剂测定农药利用率。喷雾结束后，在布置雾滴测试卡的棉株附近取样，每点取1株棉花，放入自封袋中，带回室内用蒸馏水进行洗涤，总体积为20 mL，振荡洗涤时间为5 min，洗涤液用0.45 μm水系过滤膜过滤后留取5 mL，用酶标仪(Bio-tek SynergyHT型，美国伯腾仪器有限公司生产)测定诱惑红的质量浓度，根据公式计算农药利用率(pesticide utilization，PU)；以农药利用率的变异系数(variable coefficient，VC)衡量无人飞机喷洒的均匀性，变异系数越小表示药液沉积越均匀。
$ {\rm{PU}} = \frac{{{{\rho }}\times {{V}} \times {{n}}}}{{{{S}} \times {{L}}}} \times 100 {\text{%}}； $ \end{array}
$ {\rm{VC}}=\frac{{{{\rm{PU}}_{{\rm{SD}}}}}}{{{\rm{PU}}{_{{\rm{mean}}}}}}\times 100{\text{%}}。$
式中：ρ为洗涤液诱惑红质量浓度，V为洗涤液总体积，n为小区棉花株数，S为小区面积，L为单位面积诱惑红施用量，PUSD为农药利用率标准差，PUmean为农药利用率平均值。
1.4.4 棉蚜防效调查
施药前在每小区随机5点取样，每点标记12株棉花，调查每株棉花上的蚜虫数量，分别于施药后1、3和7 d调查各小区蚜虫的数量，计算各处理棉花蚜虫的防效(control efficacy，CE)。
$ {\rm{CE}}=\frac{1-({{C}}_1 \times {{T}}_2)}{ {{C}}_2 \times {{T}}_1} \times 100{\text{%}} 。$
式中：C1和C2分别为空白对照区药前和药后虫数，T1和T2分别为药剂处理区药前和药后虫数。
1.5 数据处理与分析
试验数据采用Microsoft Excel 2016进行整理，通过SPSS 20.0 单因素方差分析，选择Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 雾滴密度及雾滴覆盖率
由图2可知：飞行高度为1.5和2.5 m时，植保无人机喷施常规农药的雾滴密度分别为108.57和116.59 个/cm2，覆盖率分别为3.86%和4.08%，两处理间差异不显著(P>0.05)；植保无人机喷施纳米农药时，1.5和2.5 m飞行高度下雾滴密度分别为95.12和73.84个/cm2，覆盖率分别为3.22%和1.92%，两处理间差异也不显著(P>0.05)。说明无人机喷施同种农药制剂时，飞行高度对雾滴密度和雾滴覆盖率的影响不明显。飞行高度为1.5 m时，常规农药与纳米农药的雾滴密度及覆盖率差异不显著；但当飞行高度上升到2.5 m时，常规农药喷雾的雾滴密度和覆盖率均显著大于纳米农药(P<0.05)。
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图 2 雾滴密度和雾滴覆盖率注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。Figure 2. Droplet density and droplet coverage rateNote: Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05); the same as below.2.2 雾滴粒径分布
由图3可知：飞行高度为1.5 m时，植保无人机喷施常规农药和纳米农药在各个采样点的雾滴粒径变化趋势一致，均表现为在航线下方 (采样点−4和采样点4)雾滴粒径较大，远离航线的两侧雾滴粒径较小。总体来看，喷施常规农药的雾滴粒径较大，DV0.5变化范围是150~238 μm；喷施纳米农药的雾滴粒径较小，DV0.5变化范围在105~197 μm。飞行高度增加至2.5 m时，无人机喷施2种类型药剂后多数采样点雾滴DV0.5在150 μm上下浮动。喷施常规农药的雾滴DV0.5变化范围为123~248 μm，平均为161 μm；纳米农药的雾滴DV0.5变化范围为72~204 μm，平均为142 μm。
2.3 农药沉积利用率
由表3可知：2种飞行高度下植保无人机喷施常规农药的利用率分别为3.89% 和4.09%，两者利用率相当且与人工喷雾(处理5)的利用率 (5.40%) 差异不显著(P>0.05)；2种飞行高度下喷施纳米农药的利用率分别为2.39%和2.75%，两者间无显著差异(P>0.05)，但均显著低于人工喷雾(处理6，6.28%) (P<0.05)。飞行高度为1.5和2.5 m时，常规农药处理的利用率均显著高于纳米农药处理(P<0.05)。
表 3 不同处理的农药利用率Table 3. Pesticide utilization of different treatments处理
treatment农药利用率/%
pesticide utilization变异系数/%
variable coefficient1 3.89±0.68 bc 38.83 2 4.09±0.50 b 27.36 3 2.39±0.50 d 46.74 4 2.75±0.41 cd 33.00 5 5.40±0.47 ab 19.62 6 6.28±0.21 a 7.64 注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Note: Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).2.4 棉蚜防治效果
由图4可知：施药后1 d，各处理对棉蚜表现出较好的防治效果，在1.5和2.5 m飞行高度下，植保无人机喷施常规农药对棉蚜的防效分别为57.36%和45.17%，喷施纳米农药的防效达到76.24%和66.49%，显著高于喷施常规农药处理的防效，但均显著低于人工喷施纳米农药的防效(P<0.05)。施药后3和7 d，各处理对棉蚜的防效上升，植保无人机在1.5和2.5 m飞行高度下喷施纳米农药的防效均显著高于喷施常规制剂处理的防效(P<0.05)，其中，在1.5 m高度下喷施纳米农药的防效最高，与人工喷雾防效相当。
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图 4 棉蚜的防治效果注：图例CF1和CF2分别为植保无人机 (UAV)在飞行高度1.5和2.5 m时喷施常规农药；NF1和NF2分别为UAV在飞行高度1.5和2.5 m时喷施纳米农药；CM和NM分别为人工喷施常规农药和纳米农药。Figure 4. Control efficacy on cotton aphidsNote: Legend CF1 and CF2 mean plant protection unmanned aerial vehicles (UAV) spray conventional pesticide at flight height 1.5 and 2.5 m, respectively; NF1 and NF2 mean UAV spray nanopesticide at flight height 1.5 and 2.5 m, respectively; CM and NM mean manual spray conventional pesticide and nanopesticide, respectively.3. 讨论
本研究中，在棉花叶片正面布设了雾滴测试卡，分析不同施药参数下的雾滴沉积分布情况，结果显示：植保无人机在1.5和2.5 m飞行高度下喷施常规农药或纳米农药，在棉花上的雾滴沉积密度和覆盖率均无显著差异，表明在喷施药剂相同时，飞行高度对雾滴沉积的影响不大。课题组前期研究了3WQFTX-10电动植保无人机在棉花苗期施药，结果表明：无人机飞行高度影响棉花叶片背面的雾滴沉积，而对叶片正面的雾滴沉积影响较小[24]，与本研究结果一致。
雾滴粒径是评价喷雾效果的指标之一，其大小影响雾滴沉积及漂移[26]。本研究表明：飞行高度为1.5 m时，植保无人机喷施常规农药与纳米农药的雾滴密度及覆盖率差异不大；而飞行高度为2.5 m时，纳米农药的雾滴密度和覆盖率均低于常规农药。这可能是由于纳米农药雾滴粒径更小，随着飞行高度的增加，其更容易受环境风速的影响而发生漂移[27]，减少药液在棉花植株上的有效沉积。
施药技术是影响农药利用率的重要因素。常规施药器械采用大容量和大雾滴喷雾技术，往往造成农药流失严重和利用率低；植保无人机施药采用低容量和细雾滴喷雾技术，有利于提高农药雾滴分布均匀性及农药利用率[28]。作物生育期和植株冠层结构也是影响农药利用率的因素之一，研究认为作物苗期所施农药的利用率低于其他生育期[29]。本研究结果显示：无论采用哪种施药器械施药，棉花苗期对农药的利用率均较低 (不足7%)，且植保无人机喷施的农药利用率低于人工背负式喷雾器施药，这可能与棉花生育期及2种施药器械的喷雾方式有关。本研究在棉花苗期进行，棉花植株小、叶面积覆盖度低、地面裸露大，无人机喷雾属于全覆盖式喷雾，施药过程中大量药液沉积在地面上，造成药液流失严重，而人工喷雾是对准棉苗进行喷雾，因此，其农药利用率略高于无人机喷雾。另外，植保无人机喷雾雾滴粒径小，作业过程中更易受到环境风速的影响而发生飘移[27]，这也可能是造成农药利用率偏低的原因之一。
与传统农药制剂相比，纳米农药制剂有利于改善难溶农药的分散性，提高活性成分的生物活性，同时具有较强的抗雨水冲刷能力，可以延长在作物上的持效期，且对作物安全[19-20]。本研究中植保无人机无论在哪种飞行高度下作业，喷施纳米农药对棉蚜的防治效果均高于常规农药，其原因可能是纳米农药粒径较传统农药更小，具有更大的分散度，提高了啶虫脒和高效氯氟氰菊酯的生物活性，因此，其对棉蚜的防治效果比常规农药更高。
4. 结论
棉花苗期植保无人机喷施同种农药制剂时，飞行高度对雾滴沉积分布及农药利用率的影响不明显；1.5 m飞行高度下，植保无人机喷施常规农药与纳米农药雾滴在棉花上沉积密度和覆盖率差异不明显，但纳米农药的雾滴粒径更小；纳米农药的利用率低于常规农药，但对棉蚜的防治效果优于常规农药。植保无人机喷施3.5%啶虫脒·高效氯氟氰菊酯纳米农药可以有效防治棉蚜，因此可在棉花苗期大面积推广应用。
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图 1 已知不同细胞量的基因编辑阳性细胞基因型鉴定结果
注：a) 同梯度细胞量的GHRKO细胞计数结果；b) 不同梯度细胞量的GHRKO细胞扩增出的靶向GHR的PCR产物；c) 不同梯度细胞量GHRKO细胞T7EN1酶切结果；d~e) 不同数量GHRKO细胞PCR及T7EN1酶切条带量化结果，“**”和“***”分别表示在0.01和0.001水平上差异显著；f) 50个GHRKO细胞GHR基因型Sanger测序结果。
Figure 1. Genotype identification results of gene editing positive cells with different cell mass
Note: a) count results of GHRKO cells with different gradients; b) PCR products harboring the targeted GHR region amplified from GHRKO cells with different gradients; c) results of T7EN1 clearage from GHRKO cells with gradients; d-e) quantification of the gray value analysis of the PCR products and T7EN1 cleavage in GHRKO cells with different gradients, “**” and “***” mean significant diffrences at 0.01 and 0.001 level, respectively; f) sanger sequencing of GHR genotype from 50 GHRKO cells.
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图 2 猪IPO13KO基因编辑阳性单细胞克隆的筛选
注：a) 猪IPO13基因打靶示意图；b) 20个IPO13基因编辑单细胞克隆50个细胞PCR结果；c) 20个IPO13基因编辑单细胞克隆50个细胞T7EN1酶切结果；d~e) IPO13KO阳性克隆点Sanger测序结果。
Figure 2. Selection of porcine IPO13KO positive single-cell colonies
Note: a) schematic diagram of result of T7EN1 cleavage from 50 IPO13 gene-editing cells in 20 single-cell colonies; b) PCR products harboring the targeted IPO13 region amplified from 50 cells of pig single-cell colonies; c) result of T7EN1 cleavage from 50 IPO13 gene-editing cells in 20 single cell colonies; d-e) snger sequencing of IPO13KO positive colonies
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图 3 克隆胎儿及仔猪IPO13KO基因型鉴定
注：a) 8个活的IPO13KO克隆胎儿；b) 8个克隆胎儿IPO13基因PCR结果；c) 8个克隆胎儿IPO13基因T7EN1酶切检测结果；d) 6头成活的IPO13KO克隆猪；e) 8个克隆胎儿及9头出生IPO13KO克隆仔猪测序结果。
Figure 3. Detection of IPO13KO genotypes in fetuses and piglets
Note: a) eight IPO13KO cloned live fetuses; b) PCR products harboring the targeted region of IPO13 amplified from 8 live fetuses; c) result of T7EN1 cleavage of IPO13 gene from eight cloned fetuses. d) 6 live IPO13KO cloned pigs; e) sequencing result of eight IPO13KO cloned fetuses and IPO13KO cloned piglets.
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图 4 新筛选方法与普通筛选方法的筛选周期与筛选成功率比较
注/Note：**P<0.01，***P<0.001。
Figure 4. Comparison of screening cycle and success rate between new screening method and general screening method
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图 5 基因编辑猪阳性成纤维细胞筛选示意图
注： a) 普通筛选方法示意图；b) 新筛选方法示意图。
Figure 5. Diagram of selection of positive porcine gene-editing fibroblasts
Note: a) diagram of general selecting method; b) diagram of new selecting method.
表 1 猪IPO13KO克隆胚胎移植至代孕母猪中的发育情况
Table 1 Development of reconstructed IPO13KO cloned embryos after transfer to recipients
代孕母猪
recipients体细胞核移植
time of SCNT胚胎移植数
transferred embryos number妊娠头数
pregnancy妊娠时间/d
time of pregnancy获得胎儿数
fetuses (alive) number仔猪出生数(成活数)
offspring (alive) number1 第1轮体细胞核移植
the first round of SCNT510 − − − − 2 320 / 35 8 − 3 310 / − − − 4 305 − − − − 5 308 − − − − 合计 total 1753 2 − 8 − 1 第2轮体细胞核移植
the second round of SCNT360 / − − − 2 250 − − − − 3 252 − − − − 4 255 / 118 − 2(2) 5 253 − − − − 6 350 / 115 − 2(0) 7 300 − − − − 8 300 − − − − 9 300 / − − − 10 330 / 116 − 3(2) 11 310 / 116 − 2(2) 合计 total 3260 6 − − 9(6) 
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