亚健康已成为当代突出的社会问题。疲劳是亚健康主要症状之一，导致机体精力或体力减弱和丧失^[1]。疲劳状态的累积和恶化可造成“过劳”现象，已发展成为常见生理、精神、心理和社会问题，其可导致机体内分泌紊乱和免疫抵抗能力的下降，继而发展成慢性疲劳综合征和过度训练综合征等，严重威胁人类健康^[2-3]。长时间或高强度体力活动使肌群处于长时间过度收缩状态，伴随持续能量消耗及氧化代谢产物堆积，因机体代谢失衡，产物随血液运行至全身，刺激中枢神经系统，加重疲劳状态^[4]。能量耗竭—代谢产物堆积—氧自由基和脂质过氧化已成为机体疲劳的主要理论^[5]。传统抗疲劳物质多为营养强化生物制剂以及补益功能提取物^[6]。前者在提高运动能力和延缓疲劳的作用已得到证实，但其不可避免的副作用及兴奋剂成分给机体造成严重危害，且使用存在一定局限性^[7]。

构建恰当动物疲劳模型是研究评估抗疲劳物质作用的前提，如负重游泳试验和转棒试验，可有助于客观反映机体运动耐力^[8]。疲劳作为一种常见但非特异性的生理状态，可通过功能和代谢监测表征，但慢性疲劳的诊断主观性较强。因此，了解其生物学机制并依据相关生物学标志物对运动疲劳诊治具有重要临床意义。

Glu、BUN、Lac、糖原、MDA、T-SOD及GSH-Px等均是研究疲劳发生机制的常见指标，而寻找更为安全有效的抗疲劳物质势在必行。近阶段研究将抗疲劳物质的探索转向传统植物，其温和而毒副作用小。山葵(Eutrema yunnanense)是一种富含维生素和矿物质的乔木，具有多重生物学活性，如防癌、抗炎和抗氧化等，奠定了其在医药和食品领域广泛应用的基础^[9]。鉴于其抗疲劳机制报道较为少见，本研究通过构建小鼠运动性疲劳动物模型对山葵树叶有效成分进行深入研究，验证山葵树叶提取物的抗疲劳功能及作用机制，为新型功能性营养制剂的应用提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   试验动物

动物试验模型共计纳入60只4~5周龄健康清洁级雄性BALB/c小鼠，体质量18~20 g [SCXK (沪) 2016-0006、SYXK (沪) 2015-0011，复旦大学实验动物部]。试验小鼠以普通基础饲料进行分笼，适应性喂养于干洁、通风和温、湿控制(温度20~25 ℃，相对湿度40%~70%)的昼夜节律均衡环境中。小鼠自由饮水进食，适应性喂养1周后体质量达(25.00±1.44) g/只。本试验方案经广西大学实验动物管理和使用委员会(IACUC)审批(2017—015)；动物试验方法和操作程序符合实验动物管理的国家标准以及实验动物管理与使用指南^[10]，并以“3R原则”为指导。

1.1.2   试验用山葵树叶提取物

山葵树叶提取物样品由广元市玺府生物科技有限公司(中国四川)提供，样品原料制备成碎末状，过筛后于低温冰箱避光保存。称取一定量山葵树叶粉末，加入70%乙醇溶液，放入超声波清洗机进行超声震荡提取；3500 r/min离心10 min，取上清液，重复2次，合并上清液；真空浓缩处理；冻干后获取山葵树叶提取物粉末(棕褐色，固体磨细粉)。

1.1.3   试验动物分组

将纳入60只小鼠采用随机数字表法进行分组，共计6个组别，每组10只小鼠。(1) 空白对照组：自由摄入水和常规基础饲料，无转棒及游泳试验；(2) 游泳对照组：自由饮水和常规基础饲料，进行转棒及游泳试验；(3) 阳性对照组：灌胃200 mg/kg红景天(取红景天软胶囊用双蒸水溶解)，进行转棒及游泳试验；(4)~(6)山葵叶高、中、低剂量组：分别灌胃500、1000和2 000 mg/kg山葵树叶(取山葵树叶提取物粉末用双蒸水溶解)，进行转棒及游泳试验。受试物为每日现用现配，每天同一时间灌胃给药，小鼠自由饮水，试验周期为4周。试验用红景天软胶囊购于甘肃阿尔康生物工程有限公司(中国陕西)，双蒸水由南京亿迅生物科技有限公司(中国江苏)提供。

1.2   运动性疲劳试验

1.2.1   转棒试验

于小鼠给药28 d (末次灌胃给药)后1 h，将试验小鼠放于电动转棒(转速40 r/min)上，试验观察5 min，以保持15 s不从转棒上跌落为准，记录各组小鼠的转棒时间(s)。试验完成后将小鼠恢复正常笼养状态。

1.2.2   小鼠力竭游泳试验

转棒试验完成后，继续对小鼠进行灌胃给药5 d。于末次灌胃给药5 h后，进行力竭游泳试验。试验环境为恒温游泳箱(高30 cm，宽1 cm，水深20 cm，水温25.00 ℃±0.50 ℃)。第1周作适应性训练，最初运动时间为20 min/d，每日递增10 min，逐步延长至60 min/d (1~2 d为无负重适应性游泳，后5 d为尾部负重1%体质量的铅丝进行负重适应性游泳)。为达到运动训练时间，若小鼠停留于水面漂浮休息，给予木棍划水驱使，保持游泳状态。试验时，将小鼠尾部负荷铅丝(5%体质量)，记录小鼠开始下水运动至沉入水底不再浮起的时间，即为小鼠力竭游泳时间(min)。使用温度计随时监测游泳箱水温，保持恒温。试验结束，迅速捞出小鼠并吹干，即刻采血。

1.3   小鼠血液样本采集

乙醚吸入式麻醉后，以毛细管伸入小鼠眼球后部静脉丛，旋转式取血。血液样本采集至无菌抗凝采血管中，离心去上层血浆，分装至离心管，−40 ℃冻存备用。血液标本采集后，行脱颈法迅速处死小鼠，暴露小鼠胸腔，迅速取肝脏。生理盐水漂洗后滤纸吸干，冻存备用。称取组织样本，剪成细小组织块，离心并冰浴，采用高通量组织匀浆机获取组织匀浆液。

1.4   指标测定

取低温冻存血浆和组织标本，严格按照试剂盒说明书检测血浆中Glu、BUN和Lac的含量、组织中糖原和MDA的含量以及T-SOD和GSH-Px的活性。所述指标检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5   统计学方法

所有数据结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 18.00软件对数据进行单因素方差分析和t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果与分析

2.1   山葵树叶提取物对小鼠体质量的影响

由表1可知：各组小鼠初始(0 d)体质量组间差异均不显著。与空白对照组相比，游泳对照组和阳性对照组小鼠体质量增加，但组间差异均不显著。与游泳对照组和阳性对照组相比，山葵树叶提取物高、中、低剂量组第7天开始体质量增长，但组间差异不显著。山葵树叶提取物高、中、低剂量组间差异也不显著。

表  1  山葵树叶提取物对小鼠体质量的影响

Table  1.  Effects of the extract of horseradish leaves on the body weight of mice g

组别 groups	试验时间/d experiment time
	0	7	14	28
空白对照组 blank control group (CKb)	25.53±0.94 a	25.65±0.89 a	26.30±0.95 a	26.93±1.01 a
游泳对照组 swimming control group (CKs)	25.75±0.98 a	27.56±1.32 a	28.43±1.30 a	29.20±1.52 a
阳性对照组 positive control group (CKp)	26.00±1.03 a	27.61±1.24 a	28.50±1.42 a	29.11±1.57 a
低剂量组 low dose group (LD)	26.16±1.11 a	27.44±1.30 a	28.61±1.53 a	29.27±1.48 a
中剂量组 moderate dose group (MD)	25.63±0.97 a	28.06±1.40 a	28.57±1.45 a	29.42±1.50 a
高剂量组 high dose group (HD)	25.70±1.06 a	27.55±1.37 a	28.48±1.56 a	29.38±1.47 a
注：不同小写字母表示处理组间差异显著(P<0.05)，n=10；下同。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment groups (P<0.05), n=10; the same as below.

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2.2   山葵树叶提取物对小鼠转棒时间的影响

由表2可知：与游泳对照组相比，阳性对照组以及山葵树叶提取物中剂量组和高剂量组小鼠转棒时间显著延长；而其与低剂量组组间差异不显著。与阳性对照组相比，高剂量组小鼠转棒时间显著延长，而其与中剂量组组间差异不显著；且高剂量组小鼠转棒时间显著长于中剂量组。

表  2  山葵树叶提取物对小鼠转棒时间的影响

Table  2.  Effect of the horseradish leaf extracts on the time of rolling stick in mice

组别 groups	转棒时间/s time of rolling stick
CKb	—
CKs	29.14±1.24 a
CKp	132.65±16.00 b
LD	35.00±5.24 a
MD	129.54±8.12 b
HD	254.88±28.36 c

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2.3   山葵树叶提取物对小鼠运动至力竭时间的影响

由表3可知：与游泳对照组相比，阳性对照组以及山葵树叶提取物中剂量组和高剂量组小鼠运动至力竭时间显著延长；而其与低剂量组组间差异不显著。与阳性对照组相比，高剂量组小鼠运动至力竭时间显著延长；而其与中剂量组组间差异不显著；且高剂量组小鼠运动至力竭时间显著长于中剂量组。

表  3  山葵树叶提取物对小鼠运动至力竭时间的影响

Table  3.  Effect of the horseradish leaf extracts on the time of exercise to exhaustion in mice

组别 groups	运动至力竭时间/min time of exercise to exhaustion
CKb	—
CKs	67.24±6.72 a
CKp	80.33±11.54 b
LD	73.63±7.32 a
MD	86.21±12.46 b
HD	132.44±13.87 c

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2.4   山葵树叶提取物对小鼠血浆中Glu、BUN和Lac含量的影响

由表4可知：与空白对照组相比，游泳对照组Glu含量显著降低，BUN和Lac含量显著升高。与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物低、中、高剂量组小鼠Glu含量显著升高；阳性对照组和山葵树叶提取物低剂量组小鼠BUN和Lac含量降低，但组间差异不显著。与阳性对照组相比，山葵树叶提取物中剂量组和高剂量组Glu含量显著提升，但小鼠BUN和Lac含量均显著降低。

表  4  山葵树叶提取物对小鼠血浆中Glu、BUN和Lac含量的影响

Table  4.  Effect of the horseradish leaf extracts on the contents of Glu, BUN and Lac in plasma in mice mmol/L

组别 groups	Glu 含量 content of Glu	BUN 含量 content of BUN	Lac 含量 content of Lac
CKb	5.76±0.66 e	9.89±1.69 b	4.22±0.76 a
CKs	3.04±0.51 a	13.32±1.87 d	5.61±0.80 c
CKp	3.55±0.49 b	13.10±1.65 d	5.47±0.69 c
LD	3.49±0.43 b	12.73±1.60 d	5.44±0.67 c
MD	4.12±0.58 c	10.22±1.63 c	4.50±0.50 b
HD	4.49±0.50 d	8.96±1.41 a	4.12±0.49 a

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2.5   山葵树叶提取物对小鼠组织糖原和MDA含量以及T-SOD和GSH-Px活性的影响

由表5可知：与空白对照组相比，游泳对照组糖原含量以及T-SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，组间差异显著。而与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物低、中、高剂量组小鼠糖原含量以及T-SOD和GSH-Px 活性均显著升高；与阳性对照组相比，中剂量组和高剂量组糖原含量以及T-SOD和GSH-Px活性显著提升，且高剂量组提升趋势更显著。同时，与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物低剂量组小鼠MDA含量降低，但组间差异不显著；与阳性对照组相比，山葵树叶提取物中剂量组和高剂量组小鼠MDA含量显著降低，且高剂量组含量低于中剂量组，组间差异显著。

表  5  山葵树叶提取物对小鼠糖原和MDA含量以及T-SOD和GSH-Px活性的影响

Table  5.  Effect of the horseradish leaf extracts on the contents of glycogen and MDA, and the activities of T-SOD and GSH-Px in mice

组别 groups	糖原含量/(mg·g−1) glycogen content	MDA含量/(nmol·mg−1) MDA content	T-SOD活性/(U·mg−1) T-SOD activity	GSH-Px活性/(μmol·mg−1) GSH-Px activity
CKb	14.65±4.23 e	0.54±0.23 b	42.42±4.00 d	1 203.47±265.09 e
CKs	4.55±1.02 a	0.73±0.28 c	28.52±3.88 a	842.54±233.95 a
CKp	5.71±1.33 b	0.64±0.24 c	32.40±3.95 b	900.76±240.52 b
LD	5.84±1.28 b	0.62±0.25 c	33.00±3.87 b	912.52±262.00 b
MD	7.76±1.54 c	0.50±0.21 b	38.43±4.03 c	989.76±302.32 c
HD	9.33±1.63 d	0.41±0.19 a	41.02±4.10 d	1 184.63±327.76 d

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3.   讨论

机体生理过程中，若机能不能维持于特定含量或器官不能承受预定运动强度，可出现疲劳。延缓疲劳和促进机体恢复是运动医学、康复医学和保健医学的科研重点。抗疲劳可通过补充能量并改善代谢、提高激素含量、清除代谢产物和提高耐氧能力等途径实现^[11]。一些生物制剂已被证实具有延缓和消除疲劳的作用，但其副作用和所含成分局限了其应用和推广^[7]。本研究目的在于寻找更为安全和有效的抗疲劳物质。

已有研究表明：茶叶提取物(如绿茶和红茶等)均具有一定的抗疲劳功效^[12-14]。屈萍等^[12]研究发现：绿茶提取物可有助于降低肌细胞膜通透性或减少细胞膜结构破坏，增强机体抗氧化酶活性，进而促进氧自由基及其代谢产物的清除，从而降低过量自由基对机体的损伤，增强机体抗氧化能力，促进运动性疲劳的消除。GHOSH等^[13]报道：果蔬中的天然黄酮类化合物有助于清除活性氧，减轻活性氧引起的损伤，维持机体健康，并证实红茶提取物的抗氧化活性。俞发荣等^[14]发现：玛咖提取物可提高游泳大鼠SOD和GSH-Px活性，进而提高机体内源性氧自由基清除能力，最终增强机体运动能力。测定机体维持运动至力竭的时间则可在一定程度上反映机体运动耐力状况及改善程度。在本研究中，试验小鼠在不同干预组别和不同时间下体质量无明显变化，提示山葵树叶提取物补给不会对小鼠生长造成异常影响；转棒试验和游泳至力竭试验均提示：与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物中剂量组和高剂量组小鼠转棒时间和运动至力竭时间明显延长；与阳性对照组相比，高剂量组小鼠转棒时间和运动至力竭时间显著延长；且高剂量组小鼠运动至力竭时间显著长于中剂量组。该结果提示山葵树叶提取物处理延长了小鼠运动耐力并提高了运动强度，直接反映出小鼠运动抗疲劳能力的提升。

为探究山葵树叶提取物对小鼠抗疲劳能力、运动耐力和能量代谢能力作用及潜在机制，本研究采集运动小鼠血浆和肝脏组织标本，测定血浆中Glu、BUN和Lac含量、组织中糖原和MDA含量以及T-SOD和GSH-Px活性。结果发现：与空白对照组相比，游泳对照组Glu含量降低，BUN和Lac含量升高，提示游泳导致Glu的消耗及BUN和Lac的堆积。而与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物低、中、高剂量组小鼠Glu含量升高；与阳性对照组相比，中剂量组和高剂量组Glu含量提升，且高剂量组提升趋势更显著。同时，现有研究已证实红景天在提高运动耐力和抗疲劳方面的作用^[15-16]。因此本研究设立已有明确药效的红景天作为阳性对照，结果发现：与阳性对照组相比，山葵树叶提取物中、高剂量组小鼠BUN和Lac含量降低，且高剂量组含量低于中剂量组，提示山葵树叶提取物作用显著，且优于可增强机体运动耐力和抗疲劳能力的红景天。血糖含量降低是引起疲劳的主要原因，BUN含量与运动耐量呈正相关，Lac作为无氧状态下碳水化合物糖酵解产物，其含量升高导致乳酸堆积，增加器官负荷^[17]。山葵树叶提取物通过上述机制有效延缓疲劳的发生。

糖原是运动过程中的重要燃料，运动过程中糖原的迅速消耗使其储存受限，抑制机体运动耐力^[18]。本研究表明：与游泳对照组相比，阳性对照组和山葵树叶提取物低、中、高剂量组小鼠糖原含量升高；与阳性对照组相比，中剂量组和高剂量组糖原含量提升，且高剂量组提升趋势更显著，提示运动消耗糖原，而山葵树叶提取物补充促进糖原的增加，揭示该提取物对维持糖原含量的积极作用，推测其机制与促进脂肪分解代谢相关。同时，剧烈运动导致氧自由基的过度生成，必然导致机体氧化应激的发生。MDA是脂质氧化降解产物之一；SOD是机体重要抗氧化酶，作为机体垃圾清道夫，可加速氧自由基清除；GSH-Px具有抗氧化功能，可有助于延缓疲劳^[19-20]。本研究测定小鼠肝脏组织中MDA含量以及T-SOD和GSH-Px活性变化提示：MDA含量的升高、糖原含量以及T-SOD和GSH-Px活性的降低导致运动能力下降是产生机体疲劳的主要原因。氧自由基的大量生成及脂质过氧化反应的增强均诱发氧化应激反应，增加神经和心血管系统负荷，导致机体组织器官损伤风险增大。山葵树叶提取物有助于提高游泳训练后T-SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，且高剂量组改善程度更为显著，发挥增强内源性自由基清除功能，提高机体运动能力。该结果提示：山葵树叶提取物的抗氧化能力与调节MDA含量以及T-SOD和GSH-Px活性有关，从而发挥清除氧自由基和代谢产物，进而预防因运动而诱导的氧化应激反应。

4.   结论

本研究证实山葵树叶提取物有助于小鼠抗疲劳能力、运动耐力和能量代谢能力，其与维持Glu和糖原含量、增加BUN和Lac去除速率、降低MDA含量及促进T-SOD和GSH-Px活性的提升密切相关，具有剂量依赖性。山葵树叶提取物具有良好的抗疲劳和抗氧化功效，未来将进一步对其安全性展开探讨，以期为山葵树叶提取相关植物制剂的成果转化提供试验基础。