药用石斛及其混伪品的DNA条形码分子鉴定
Molecular Identification of Medicinal Dendrobium and Its Adulterants Based on DNA Barcoding
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中国是卷烟生产大国，卷烟产量高，生产牌号多。虽然国家采取各种措施，但仍有一些不法分子利用各种手段制造和销售假冒卷烟。而且，随着现代科学技术的高度发展，假冒卷烟的制造者使用较先进的卷包设备，有自己的工艺配方，卷制加工质量与“正宗产品”无明显差别，达到了以假乱真的程度，消费者往往上当受骗[1]。
在卷烟真伪鉴别研究中，其检测方法历经感官鉴别[2-3]、评吸鉴别[1]、物理指标鉴别[4-6]、常规化学指标鉴别[7-8]等发展过程。其中，辅之以评吸鉴别的感官鉴别法仍是目前卷烟真伪鉴别过程中常用的鉴别方法[9]。然而，这种针对样品原材料、生产工艺特征、防伪技术等标准为基础的鉴别方法，在一定程度上较高地依赖于鉴定人员的鉴别技术。对于仿真程度较高的卷烟产品而言，采用此种方法实现卷烟的真伪鉴别具有一定的局限性[9-10]。随着仪器分析技术的发展，基于感官鉴别等的局限性，卷烟真伪鉴别技术逐渐与仪器分析技术相结合。有别于感官鉴别技术，仪器分析技术摆脱了鉴别者的主观因素，应用精密的仪器，通过数据处理，实现对卷烟真伪的鉴别。目前，仪器分析技术中的电子鼻技术[11]、近红外光谱技术[12-14]、气相色谱[15]、气相色谱—质谱技术[16-17]等都在卷烟真伪鉴别中显示出明显的优势。
离子分子反应质谱(IMR-MS)采用离子分子反应技术，利用低离子能的Hg+、Xe+和Kr+ 等把待测分析化合物分子离子化后经过四极杆质量分析器后得到分子计数，由软件系统来采集并处理、保存、传输数据，进行样品的实时分析。为了探讨IMR-MS在卷烟真伪鉴别中的应用可能性，本研究将顶空进样器与IMR-MS串联，使其成为一种集样品采集、进样、分析为一体的挥发性成分分析技术，结合特征质谱指纹图谱分析，以期为卷烟真伪鉴别提供一种操作简便、科学准确的分析方法。
1. 材料与方法
1.1 材料
选取云烟(软珍品)、云烟(紫) 2个牌号(各20个批次，2017年1—8月生产)的真品卷烟，由云南中烟工业有限责任公司提供。选取仿真度较高的冒牌云烟(软珍品)、冒牌云烟(紫)样品各5种，由云南省烟草质量监督监测站提供。
1.2 方法
1.2.1 样品准备
取1整支烟，除去滤嘴，剥去卷烟纸，取中间的烟丝0.5 g (精确到0.001 g)作为分析样品，样品装入20 mL样品瓶，加盖密封，待进行HS-IMR-MS检测。
1.2.2 顶空自动进样器分析条件
打开G1888顶空自动进样器(美国安捷伦公司)，设置样品平衡温度：140 ℃，定量环温度：150 ℃，传输线温度：160 ℃；定量环体积：1 mL；样品平衡时间：10 min；加压时间：0.2 min；环路充装时间：0.2 min；环路平衡时间：0.05 min；进样时间：1 min。
1.2.3 IMR-MS分析条件
IMR-MS是一个软电离过程，有Hg、Xe和Kr三种电离源可选择。AIRSENSE Compact离子分子反应质谱仪(奥地利V&F公司)预热48 h以上，在IMR-MS工作站中设置Single Masses方法，并在该方法中进行如下参数设置。添加质荷比25~200的各扫描离子并设置每种离子：扫描时间100 ms；质谱采样压力25 mbar；电离源：Hg(电离能10.44 eV)，Xe (电离能12.13 eV)，Kr (电离能14.00 eV)；分辨率1 amu；样品循环扫描10次。
因质谱仪内部管道加热温度最高能达150 ℃，为保证受热的连续性，顶空平衡温度优化试验以Xe作电离源，平衡时间10 min，在60、80、100、120和140 ℃ 5个不同顶空平衡温度下进行采样优化选择；为保证检测高效性，顶空平衡时间优化试验以Xe作电离源，平衡温度140 ℃，在5、10、15、20和30 min 5个不同顶空平衡时间下进行采样优化选择。
1.2.4 不同品牌卷烟特征质谱指纹图谱的建立
以卷烟样品的各离子峰强度平均值和相应质荷比作图，即得该批次卷烟的质谱指纹图谱。选取同一牌号20批次中离子峰强度>105的共有离子，作为该牌号卷烟的群体特征离子，计算20批次卷烟的平均质谱指纹图谱，即该牌号卷烟的特征质谱指纹图谱。涉及统计离子数目时，取离子峰强度>105的离子进行计算。
1.2.5 数据处理与分析
相似度的评价方法主要有欧氏距离法、相关系数法、向量夹角余弦法、指数相似系数法等[18-19]。本研究利用Chempattern统计分析软件[科迈恩(北京)科技有限公司]进行数据的处理，以特征质谱指纹图谱为对照，采用皮尔逊相关系数法，计算同一牌号不同批次卷烟、冒牌卷烟的质谱指纹图谱与其特征质谱指纹图谱的相关系数，考察真品卷烟之间相似度的变化范围以及与冒牌卷烟的差异性。另外，本研究也采用ChemPattern软件对云烟(软珍品)和云烟(紫)各20批次卷烟及各5个冒牌卷烟的质谱指纹图谱进行主成分分析(PCA)，以考察卷烟样品之间的相似性和差异性。
2. 结果与分析
2.1 IMR-MS不同电离源对分析效果的影响
当Hg作电离源时，所得质谱离子数和总离子峰强度都较小；Kr作电离源时，能获得最大离子数，但电离源自身会在78~87 m/z出现离子峰，与样品离子峰重叠，产生较大干扰；而选用Xe作电离源，质谱总离子峰强度和离子数都较大，且Xe在128~137 m/z产生离子碎片，与样品离子峰不重叠，因此，选择Xe作为电离源进行质谱分析。
2.2 不同顶空平衡温度对分析效果的影响
由图1可知：以云烟(软珍品)为例，随着温度的升高，质谱图中总离子峰强度和检出离子数持续增加，直至140 ℃，总离子峰强度和离子数都达到最大值。因此，选择140 ℃的平衡温度进行试验。同理，经分析，云烟(紫)也选择140 ℃的平衡温度进行试验。
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图 1 不同顶空平衡温度对采样效果的影响Figure 1. The effect of different headspace balance temperature on the sampling2.3 不同顶空平衡时间对分析效果的影响
由图2可知：以云烟(软珍品)为例，当平衡时间为15 min时，其检出离子数从5 min时的54个大幅增加到73个，之后保持不变；而总离子峰强度随时间一直呈现较缓慢增长，15 min之后基本保持不变，故选取15 min为最佳平衡时间。同理，经分析，云烟(紫)也选择15 min为最佳平衡时间。
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图 2 不同平衡时间对采样效果的影响Figure 2. The effect of different headspace balance time on the sampling2.4 方法学考察
在Xe作电离源、平衡温度140 ℃、平衡时间15 min的最佳试验条件下，任选同一批次样品，连续进样6次，离子峰强度>5×105的离子的相对标准偏差为1.13%~11.54%。每天1次，连续6 d进行分析，离子峰强度>5×105的离子相对标准偏差为2.08%~14.45%，说明HS-IMR-MS法用于卷烟真伪考察，其精密度和稳定性是可以接受的。
2.5 不同牌号卷烟的平均质谱指纹图谱和相似度分析
采用优化后的HS-IMR-MS法对两种牌号的各20批次卷烟进行质谱分析，从所得的质谱指纹图谱上均可观察到近70个峰(电离源Xe在128~137 m/z的离子峰未计入)，它们的离子峰强度占总离子峰强度的95%以上，因此可以作为判别该牌号卷烟的群体特征离子。真品卷烟的特征质谱指纹图谱即是由群体特征离子组成的，同一牌号20批次卷烟的平均质谱指纹图谱(图3)。
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图 3 两种牌号卷烟的特征质谱指纹图谱Figure 3. The representing mass spectrum fingerprints of the two different cigarette brands由表1可知：云烟(软珍品)不同批次卷烟与其特征质谱指纹图谱的最小相关系数为0.990 0，云烟(紫)不同批次卷烟与其特征质谱指纹图谱的最小相关系数为0.993 2。根据相似度评价结果，两个牌号不同批次卷烟与其特征质谱指纹图谱的相关系数均在0.99以上，设定两个牌号真品卷烟的合格阈值比0.99小3%，即合格阈值为0.96。
由表1还可知：仿真度较高的冒牌云烟(软珍品)和冒牌云烟(紫)与特征质谱指纹图谱的相似度范围为0.914 7~0.934 3和0.884 7~0.908 8，均低于真品卷烟合格阈值0.96，确定为假冒或不合格产品。由此可见，构建的两个卷烟牌号的特征质谱指纹图谱体系可以用于卷烟的真伪鉴别。
表 1 两种牌号卷烟的相似度鉴定结果Table 1. The similarity results of two different cigarette brands样品序号
sample No.云烟(软珍品)
Yunyan (Soft Rarity)相关系数
correlation coefficient样品序号
sample No.云烟(紫)
Yunyan (Purple)相关系数
correlation coefficient1 真品 genuine sample 0.997 0 1 真品 genuine sample 0.993 2 2 真品 genuine sample 0.998 0 2 真品 genuine sample 0.994 9 3 真品 genuine sample 0.996 7 3 真品 genuine sample 0.995 4 4 真品 genuine sample 0.998 3 4 真品 genuine sample 0.994 2 5 真品 genuine sample 0.999 0 5 真品 genuine sample 0.995 5 6 真品 genuine sample 0.998 5 6 真品 genuine sample 0.996 1 7 真品 genuine sample 0.999 0 7 真品 genuine sample 0.995 9 8 真品 genuine sample 0.998 9 8 真品 genuine sample 0.997 6 9 真品 genuine sample 0.998 8 9 真品 genuine sample 0.997 4 10 真品 genuine sample 0.997 1 10 真品 genuine sample 0.998 3 11 真品 genuine sample 0.999 5 11 真品 genuine sample 0.994 1 12 真品 genuine sample 0.998 4 12 真品 genuine sample 0.996 6 13 真品 genuine sample 0.997 1 13 真品 genuine sample 0.999 0 14 真品 genuine sample 0.996 9 14 真品 genuine sample 0.998 5 15 真品 genuine sample 0.998 2 15 真品 genuine sample 0.996 3 16 真品 genuine sample 0.997 3 16 真品 genuine sample 0.995 6 17 真品 genuine sample 0.995 0 17 真品 genuine sample 0.994 2 18 真品 genuine sample 0.990 0 18 真品 genuine sample 0.994 4 19 真品 genuine sample 0.991 6 19 真品 genuine sample 0.998 1 20 真品 genuine sample 0.991 1 20 真品 genuine sample 0.998 1 21 伪品counterfeit sample 0.931 2 21 伪品counterfeit sample 0.902 4 22 伪品counterfeit sample 0.932 9 22 伪品counterfeit sample 0.906 9 23 伪品counterfeit sample 0.928 7 23 伪品counterfeit sample 0.893 8 24 伪品counterfeit sample 0.914 7 24 伪品counterfeit sample 0.908 8 25 伪品counterfeit sample 0.934 3 25 伪品counterfeit sample 0.884 7 2.6 不同牌号卷烟的模式识别和真伪鉴别
对云烟(软珍品)和云烟(紫)的不同批次卷烟与冒牌卷烟质谱指纹图谱进行主成分分析，分别求得对应于3个特征值的主成分PC1、PC2、PC3，并以此得到三维投影图(图4)，样品越相似，在投影图上就处在越相近的位置。
由图4可知：主成分分析结果与相关系数法的评价结果一致。同一牌号的卷烟样品较为相似，相互聚集，而不同牌号间则存在着明显差异，在PCA投影图上表现为相互分离的。因此，按牌号可以分成不同的类，且类别间的边界清晰明显。冒牌的云烟(软珍品)和云烟(紫)与真品卷烟间都表现为相互离散，差异较大，冒牌卷烟之间互相混合，无明显区别。
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图 4 卷烟样品的主成分分析投影图Figure 4. The principal component analysis (PCA) projection drawing of cigarette samples3. 讨论
本研究表明：利用HS-IMR-MS进行卷烟挥发性成分分析，结合以相关系数法确定的合格阈值及主成分分析，对真品卷烟与冒牌卷烟的质谱指纹图谱进行比较，可以科学客观地鉴别卷烟的真伪。同一牌号的卷烟，不论是相关系数，还是在PCA投影图上都表现得更为接近，具有明显的集中聚拢趋势。因为每个牌号真品卷烟都有各自固定的叶组配方、加工工艺参数等，能保证质量的稳定性，所以不同批次卷烟间的相似度也很高。不同牌号间，则由于叶组配方、加香加料等工艺参数的整体差异，表现为相互离散。对于冒牌卷烟而言，由于配方参差不齐和加工工艺不规范，即使外观仿真度再高，在分析其挥发性成分时，都表现出了与真品卷烟的较大差距。
目前，仪器分析鉴别法是卷烟真伪鉴别方法的一个重点研究方向。然而，仪器分析一般都需要对样品进行预处理，且分析时间较长，致使整个分析过程复杂耗时。另外，烟草本身较为复杂的化学成分，导致数学建模准确度的降低，也制约了仪器分析在卷烟真伪鉴别中的应用[9]，但这并不意味着放弃新兴分析技术在真伪鉴别中的应用。离子分子反应质谱(IMR-MS)作为一种新型软电离质谱，已被广泛应用于呼吸器气体分析[20]、汽车尾气分析[21]、废弃物焚化挥发性气体分析[22]等，在卷烟主流烟气气相成分分析中也有少量研究[23-24]。本研究将顶空与IMR-MS结合，相较于目前卷烟鉴别的仪器分析方法，具有分析速度快、无须前处理等优势，其分析过程和数据处理过程较简单易行，便于推广，能应用于不同牌号卷烟的识别，也能为卷烟真伪鉴别提供一种新的途径，为打击制售假冒伪劣卷烟产品违法活动提供科学依据。
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图 1 部分样品PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图
注：M. 2 000 bp DNA Marker；a) 剑叶石斛(1~7)和海南石斛(8~14)的ITS序列；b) 梳唇石斛(1~7)和密花石斛(8~14)的ITS2序列；c) 翅梗石斛(1~7)和景洪石斛(8~14)的psbA-trnH序列；d) 金钗石斛(1~7)和流苏石斛(8~14)的matK序列。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis with PCR amplification of some samples
Note: M. 2 000 bp DNA Marker; a) ITS sequence of Dendrobium acinaciforme (1-7) and D. hainanense (8-14); b) ITS2 sequence of D. strongylanthum (1-7) and D. densiflorum (8-14); c) psbA-trnH sequence of D. trigonopus (1-7) and D. exile (8-14); d) matK sequence of D. nobile (1-7) and D. fimbriatum (8-14).
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图 3 基于ITS、ITS2、psbA-trnH和matK单序列构建的NJ系统发育树
注：五角星标记代表在NCBI数据库下载的石斛混伪品。
Figure 3. NJ phylogenetic tree based on ITS, ITS2, psbA-trnH and matK sequences
Note: The five pointed star mark represents the Dendrobium adulterants downloaded from NCBI database.
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图 4 多序列联合构建NJ系统发育树
Figure 4. Construction of NJ phylogenetic tree by multiple sequences.
表 1 石斛属植物样本采集信息
Table 1 Sample information of Dendrobium species
序号
serial number组别
group种名
species name数量
quantity标本号
specimen No.采集地
collection place1 石斛组
Sect. Dendrobium叠鞘石斛
D. aurantiacum Rchb. f. var. denneanum7 DQ 1-7 云南腾冲 Tengchong, Yunnan
云南文山 Wenshan, Yunnan2 石斛组
Sect. Dendrobium双斑叠鞘石斛
D. aurantiacum Rchb. f. var. zhaojuense5 SBDQ 1-5 四川康定 Kangding, Sichuan 3 石斛组
Sect. Dendrobium金钗石斛
D. nobile7 JC 1-7 广西百色 Baise, Guangxi
云南石屏 Shiping, Yunnan4 石斛组
Sect. Dendrobium流苏石斛
D. fimbriatum7 LS 1-7 云南普洱 Pu're, Yunnan 5 基肿组
Sect. Crumenata景洪石斛
D. exile7 JH 1-7 云南勐腊 Mengla, Yunnan 6 草叶组
Sect. Stachyobium梳唇石斛
D. strongylanthum7 SHUC 1-7 云南景洪 Jinghong, Yunnan
云南腾冲 Tengchong, Yunnan7 剑叶组
Sect. Aporum剑叶石斛
D. acinaciforme7 JY 1-7 云南景洪 Jinghong, Yunnan 8 圆柱叶组
Sect. Strongyle海南石斛
D. hainanense7 HN 1-7 海南三亚 Sanya, Hainan 9 黑毛组
Sect. Formosae翅梗石斛
D. trigonopus7 CG 1-7 云南勐海 Menghai, Yunnan 10 顶叶组
Sect. Chrysotoxae密花石斛
D. densiflorum7 MH 1-7 云南红河 Honghe, Yunnan 11 距囊组
Sect. Pedilonum竹枝石斛
D. salaccense7 ZZ 1-7 云南勐腊 Mengla, Yunnan 12 瘦轴组
Sect. Breviflores钩状石斛
D. aduncum7 GZ 1-7 广西百色 Baise, Guangxi 
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表 2 从GenBank中下载序列信息
Table 2 The information of sequences downloaded from GenBank
种名 species name 登录号 GenBank accession No. ITS ITS2 psbA-trnH matK 叠鞘石斛 D. aurantiacum Rchb. f. var. denneanum KF143450.1 KJ658336.1 KF177489.1 — 金钗石斛 D. nobile AB593619.1 MH120176.1 KP412226.1 — 流苏石斛 D. fimbriatum KF143461.1 KY508521.1 — — 景洪石斛 D. exile KF143457.1 KY508520.1 KF177496.1 — 梳唇石斛 D. strongylanthum KJ210499.1 KJ658335.1 KF177553.1 — 剑叶石斛 D. acinaciforme HQ114253.1 KY745818.1 EU887944.1 — 海南石斛 D. hainanense KF143466.1 KJ210451.1 EU887943.1 — 翅梗石斛 D. trigonopus KF143522.1 KY508539.1 FJ216467.1 — 密花石斛 D. densiflorum KJ210438.1 KY966533.1 FJ216487.1 — 竹枝石斛 D. salaccense MK522259.1 KJ210494.1 KF177545.1 — 钩状石斛 D. aduncum KJ210409.1 KY508509.1 — — 金石斛 Flickingeria comata AY240015.1 — KC811575.1 KF361638.1 流苏金石斛 Flickingeria fimbriata KY966573.1 — — KF361639.1 石仙桃 Pholidota chinensis. KY966650.1 KY508583.1 — MK607427.1 云南石仙桃 Pholidota yunnanensis AF362911.1 KY508589.1 — — 密花石豆兰 Bulbophyllum odoratissimum FJ428222.1 — MK177964.1 FJ216638.1
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表 3 序列引物
Table 3 The sequence primers
片段
fragment引物
primer序列 (5′→3′)
sequenceITS 5F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 4R TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS2 ITS2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT psbA-trnH PA GTTATGCATGAACGTAATGCTC TH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC matK 3FMK CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 4RMK ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC
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表 4 4条序列在12种药用石斛中的序列特征
Table 4 The sequence characteristics of four sequences in medicinal Dendrobium species
项目 item ITS ITS2 psbA-trnH matK 序列总数/条 total number of sequences 93 91 93 82 比对后序列长度/bp sequence length after alignment 725 253 815 823 GC平均含量/% GC average content 53.6 51.6 34.2 32.2 变异位点 variant sites 427 (58.9%) 166 (65.6%) 121 (14.9%) 95 (11.5%) 保守位点 conserved sites 291 (40.1%) 87 (34.4%) 694 (85.2%) 728 (88.5%) 简约信息位点 parsimonious information sites 360 (49.7%) 157 (62.1%) 113 (13.7%) 85 (10.3%)
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