外源NO对铅胁迫下雌雄美洲黑杨生理特征的影响
The Effects of an Exogenous Nitric Oxide on the Physiological Characteristics in Females and Males of Populus deltoides Exposed to Pb Stress
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Keywords:
- nitric oxide /
- Populus deltoides /
- lead stress /
- antioxidant enzymes /
- osmoregulation
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辣木(Moringa oleiferam Lam.)是营养丰富且“药食同源”的热带多功能植物，全株各部分均可食用[1]。其中，辣木籽富含蛋白质、油脂、维生素、矿物元素等营养成分，辣木籽含有丰富的维生素E，含量高达7.52 mg/g[2]。辣木籽油中含有70%化学稳定性高的油酸，是理想的食用植物油及化妆品用油品种[3]。
在辣木籽的药理功效研究中，SINGH等[4]发现辣木籽多酚具有通过清除氧自由基而抗氧化的活性。AL-MALKI等[5]发现小剂量的辣木籽提取物对大鼠诱导型Ⅰ型糖尿病和胰岛素抵抗Ⅱ型糖尿病有改善作用。HAMZA等[6]发现辣木籽提取物通过抗炎机制以减少大鼠诱导型肝损伤和纤维化症状。辣木籽中含量在9%左右的硫代葡萄糖苷[7]，其酶解产物4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯(4-[(α-L-rhamnosyloxy) benzyl] isothiocyanate，GMG-ITC)具有广泛且显著的生物活性。GMG-ITC对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有显著的抗菌效果[8]。BRUNELLI等[9]发现GMG-ITC通过抑制NF-B表达能够减少裸鼠体内骨髓瘤细胞繁殖。WATERMAN等[10]发现GMG-ITC在巨噬细胞中通过下调炎症因子iNOS及IL-1β的产生而发挥抗炎活性。GIACOPPO等[11]还发现GMG-ITC通过上述抗氧化机制对小鼠脊髓损伤后继发性损伤具有保护作用。
目前对GMG-ITC的酶解提取及分离纯化步骤较为烦琐，主要通过黑芥子酶对辣木籽中硫代葡萄糖苷进行水解，并通过阴离子交换树脂、大孔树脂分离获得GMG-ITC及其他3种乙酰化衍生混合物[10]。由于此类异硫氰酸酯对热不稳定，所以在上述柱色谱分离中水、醇等溶剂浓缩过程中，造成异硫氰酸酯的降解变质，产率仅为1.66%左右。该混合物经高效液相色谱分离后，仅能制备痕量GMG-ITC纯品。本研究通过高效液相色谱法检测辣木籽酶解提取液中GMG-ITC的产率为评价标准，以酶解过程中料液比、酶解温度、pH值和酶解时间为考察因素，通过单因素和正交试验法优化该成分的酶解提取工艺参数。首次通过简化的脱油、酶解、二氯甲烷萃取及重结晶4个步骤制备高纯度GMG-ITC，为辣木籽中异硫氰酸酯类功效成分的制备及活性研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
辣木籽产自云南德宏，购于天佑科技开发有限公司，常温避光储藏。将辣木籽去壳并粉碎后，过30目筛备用。4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯(尚无供应厂商)为云南省生物大数据实验室自行制备，经1H、13C核磁共振波谱及HR-MS数据与文献[7]对照一致，且HPLC分析纯度达98%。试验用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇均为分析纯级。所用水为去离子水。
1.2 方法
1.2.1 4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯(GMG-ITC)的含量测定
GMG-ITC的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)分析法(Agilent 1220高效液相色谱仪)。色谱柱：Hypersil C18 (4.6 mm×150 mm，10μm)；流动相：乙腈(A)—水(B)；采用梯度洗脱：0→10 min (5%~100%)；流速1 mL/min；进样量20 μL；检测波长：230 nm。
1.2.2 标准曲线的绘制
用电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)精密称取GMG-ITC标准品20 mg，放入10 mL容量瓶中，乙腈溶解至刻度，摇匀，具塞。分别吸取此标准品溶液1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和0.05 mL至1 mL容量瓶中，加入乙腈至刻度，摇匀，得到浓度分别为2.0、1.6、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2和0.1 mg/mL的GMG-ITC溶液。高效液相色谱法测定其峰面积，平行3次取平均值，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得回归方程为：y=16 749x−5 383.8，R2=0.998 3。式中，y为样品液的峰面积；x为样品液中GMG-ITC的含量(mg/mL)。
1.2.3 酶解提取液中GMG-ITC的测定方法
将不同条件下的辣木籽酶解提取液用0.22 m滤膜过滤后，按1.2.1节中HPLC方法测定其峰面积，根据1.2.2节中标准曲线进一步换算出酶解提取液中GMG-ITC的含量及产率。
1.2.4 供试品GMG-ITC酶解提取液制备方法
将辣木籽粉装入索氏提取器，用中药袋密封，以石油醚为脱油溶剂，加热回流，脱油12 h以上，至脱油完全。脱油后辣木籽粉常温晾干后，加入玻璃烧杯中，以1∶50的溶剂倍数加入纯净水，用乙酸调pH值为5，并放入30 ℃水浴锅中，在30 ℃温度下机械搅拌8 h。以离心机4 000 r/min离心该酶解提取液5 min，取出上清液，该上清液用于不同酶解提取条件的GMG-ITC含量分析。
(1) 单因素条件优化试验
准确称量1.0 g脱油辣木籽干燥粉，加入纯净水中。分别考察不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60) (g∶mL)、反应时间(2、4、6、8、10、12、14和16 h)、反应温度(20、25、30、35、40和45 ℃)、pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)对辣木籽酶解提取液中GMG-ITC产率的影响，平行3次操作，取平均值。
(2) 正交试验法优化试验
在单因素试验结果的基础上，选取对GMG-ITC生成量影响较显著的酶解料液比、时间、温度、pH值4个因素进行L9 (34)正交试验设计，确定最佳的GMG-ITC酶解提取工艺，平行3次操作，取平均值。
1.2.5 GMG-ITC的纯化制备
在上述优化条件下制备得到的酶解提取液，用体积为1/3的二氯甲烷对提取液萃取3次。合并二氯甲烷部分，用旋转蒸发仪在30 ℃且避光条件下减压浓缩该萃取液。得到的白色固体GMG-ITC粗产品用二氯甲烷反复重结晶，经5次重结晶后，可得到GMG-ITC纯品，纯度由高效液相色谱法检测。
2. 结果与分析
2.1 不同酶解提取因素对GMG-ITC产量的影响
2.1.1 溶剂倍数对GMG-ITC得率的影响
由图1可知：GMG-ITC的生成量随料液比的增加而增加，在料液比为1∶50时达到最大值，继续增加料液比为1∶60时GMG-ITC得率没有提高，反而稍降。故把料液比1∶50确定为最佳酶解提取的料液比条件。
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图 1 温度、反应时间和pH值对GMG-ITC得率的影响Figure 1. Effects of ratio of material to solvent, temperature, reaction time and pH value on the GMG-ITC yield2.1.2 温度对GMG-ITC得率的影响
由图1可见：30 ℃以下GMG-ITC的产率稳步增长，随温度升高，GMG-ITC酶解及水溶性增加，以致GMG-ITC在酶解提取液中含量的增长。但超过30 ℃，在酶未失活的情况下，如35 ℃，GMG-ITC的产率比30 ℃下降约50%。分析原因是GMG-ITC化学性质不稳定，在超过30 ℃的情况下变得极不稳定导致的。特别是继续增加温度至40 ℃和50 ℃，受到酶失活及GMG-ITC降解变质的双重影响，GMG-ITC的产率急剧下降。因此，GMG-ITC的提取纯化中要严格控制温度低于35 ℃，其中30 ℃为最佳提取温度。
2.1.3 反应时间对GMG-ITC得率的影响
由图1可知：酶解提取8 h GMG-ITC的产率达到最大值。8 h之前，可能由于GMG-ITC酶解率持续增加造成产率不断增加。在8 h酶解完全之后，GMG-ITC产率开始出现下降，也是由于GMG-ITC结构的不稳定性造成的，长时间溶于水中也会导致GMG-ITC的降解变质。特别在反应12 h后，产率下降为8 h的49%，在14 h以后GMG-ITC降解彻底，说明GMG-ITC不能长时间处于溶剂溶解状态。
2.1.4 pH值对GMG-ITC得率的影响
由图1可见：酶解液酸碱度对GMG-ITC得率的影响显著。在强酸(pH=3)或强碱(pH=10、11)的环境中，辣木籽中黑芥子酶处于失活状态，几乎无GMG-ITC产生。当pH=5时，酶活性达到最高值，随pH值的减小或升高，酶的活性都明显下降，GMG-ITC产率也随之降低。
2.2 正交试验结果
根据单因素试验的结果，确定料液比、温度、时间、pH值为影响GMG-ITC酶解提取产率的主要因素，而且确定各个因素的水平，其中料液比(g∶mL)分别为1∶40、1∶50、1∶60，温度分别为25、30和35 ℃，时间分别为7、8和9 h，pH值分别为4、5和6。因此，正交试验采用L9 (34)的方法(表1)进行试验，来确定最佳酶解提取工艺。
表 1 正交试验因素水平表Table 1. The conditions of orthogonal test水平 level 料液比 (g∶mL)
ratio of material to solvent温度/℃
temperature时间/h
timepH 1 1∶40 25 7 4 2 1∶50 30 8 5 3 1∶60 35 9 6 从表2的正交试验极差R值可见：料液比、温度、时间、pH值4个因素对GMG-ITC得率的影响程度依次为：温度>pH值>时间>料液比。正交试验确定最佳GMG-ITC酶解提取工艺为A3B2C3D2，即料液比(g∶mL)为1∶60、温度30 ℃、时间9 h、pH值为5。该项优化条件后被用于3次放大为1 000 g辣木籽的重复酶解提取试验中，平均产率为5.25%，说明该工艺稳定可行。
表 2 正交试验及结果分析Table 2. The schemes and results analysis of orthogonal experiment编号 No. 料液比 (g∶mL) ratio of material to solvent 温度/℃ temperature 时间/h time pH GMG-ITC得率/% GMG-ITC yield 1 1 1 1 1 3.625 2 1 2 2 2 4.706 3 1 3 3 3 2.193 4 2 1 2 3 3.551 5 2 2 3 1 4.264 6 2 3 1 2 2.328 7 3 1 3 2 4.620 8 3 2 1 3 3.793 9 3 3 2 1 2.516 K1 10.524 11.796 9.730 10.405 K2 10.143 12.763 10.763 11.654 K3 10.929 7.037 11.070 9.537 k1 3.508 3.932 3.243 3.468 k2 3.381 4.254 3.588 3.885 k3 3.643 2.346 3.690 3.179 R 0.262 1.909 0.447 0.706 2.3 GMG-ITC的分离纯化
按上述优化条件得到的酶解提取液继续通过有机溶剂萃取得到GMG-ITC粗品，在对比石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮几种溶剂的萃取效果后，发现用二氯甲烷能将GMG-ITC较完全地萃取出来，并且对极性较大的蛋白或多糖类物质萃取率最低。所以本研究选择二氯甲烷为酶解提取液的萃取溶剂，使用提取液1/3倍的二氯甲烷，可通过3次萃取将GMG-ITC完全萃取出来，用薄层层析硅胶板点样检测。
在得到GMG-ITC粗品后，因为其结构不稳定，在柱层析及浓缩过程中都易受加热影响变质。所以本研究采用反复重结晶法纯化得到的粗产品，在多种溶剂的重结晶效果选择中，发现二氯甲烷依然是GMG-ITC重结晶的最佳溶剂，石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂几乎不能产生结晶。使用二氯甲烷在30 ℃下溶解GMG-ITC粗品后缓慢降温，后在−20 ℃保存5 h，可完成重结晶。重结晶纯度随次数而增加，最高可在5次重结晶后得到98%纯度的GMG-ITC，总产率为4.70%。该化合物通过1H、13C核磁共振波谱及高分辨质谱数据与文献[7]对照一致，确定其结构无误。化合物GMG-ITC相关数据为：1H-NMR (DMSO-d6，500 MHz)，δ：7.30 (2H，d，J=8.9 Hz)，7.05 (2H，d，J=8.9 Hz)，5.37 (1H，d，J=1.9 Hz)，4.85 (2H，s)，3.80 (1H，dd，J=3.6，1.8 Hz)，3.62 (1H，dd，J=9.5，3.7 Hz)，3.43 (1H，m)，3.26 (1H，t，J=9.5 Hz)，1.07 (d，J=6.1 Hz)。13C-NMR (DMSO-d6，125 MHz)，δ：155.9，128.8，128.0，116.7，98.3，71.7，70.4，70.21，69.6，47.6，17.9. MS (ESI+) m/z：334 [M+Na]+，HRMS (ESI) calcd for C14H17NO5S[M+Na]+ 334.072 0，found 334.072 2。
3. 讨论
GMG-ITC生物活性显著，但在目前对其进行提取分离[10]或化学全合成[12]的报道中，制备纯化GMG-ITC的工艺均较为复杂，且产率较低，这对辣木籽中有效成分的活性研究及药物开发造成了不利影响。本研究发现：GMG-ITC的稳定性较差，受光照和温度因素影响较大，提取温度高于40 ℃后GMG-ITC的降解变质就非常显著。在辣木籽酶解提取过程中未使用醇类溶剂，避免了后续溶剂浓缩过程的GMG-ITC的降解。这也解释了其他相关研究中，由于常规提取分离过程需经过多次柱色谱分离及溶剂(如高沸点的水、醇等)浓缩过程，造成了GMG-ITC的变质而不易获得的结果。本研究针对GMG-ITC高温易降解，而GMG-ITC酶解的前体硫代葡萄糖苷(glucomoringin)在高温下较稳定的特性[13]，在辣木籽硫代葡萄糖苷酶解生成GMG-ITC前，使用索氏提取脱油法对辣木籽中大量影响GMG-ITC纯化的油脂类杂质进行去除，再进行酶解，并对酶解过程中的温度、料液比、pH值及时间因素进行了优化，使辣木中GMG-ITC得到充分富集。在酶解后规避了常规的柱色谱分离手段，而使用低沸点溶剂二氯甲烷对GMG-ITC进行萃取和反复重结晶，该工艺能够获得产率损失最少、纯度较高的GMG-ITC产品。本研究首创的脱油、酶解、萃取及重结晶四步工艺，为GMG-ITC的大量制备提供了高效制备途径，同时也保障了后续对GMG-ITC动物水平的各项活性研究，为其他类似性质的异硫氰酸酯的制备提供参考。不过，对GMG-ITC进行酶解提取后，萃取和重结晶等纯化方法及具体工艺参数的优化尚可由后续研究完善。
4. 结论
通过单因素试验及正交试验，得到辣木籽内GMG-ITC的最佳酶解提取工艺，即料液比(g∶mL)为1∶60、温度30 ℃、时间9 h、pH值为5。在各个因素中，影响GMG-ITC提取率程度依次为：温度>pH>时间>料液比。对此条件下得到的酶解提取液，首次采用简化高效的萃取、减压浓缩及重结晶步骤，即可获得高纯度且总得率为4.70%的4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯(GMG-ITC)。
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图 1 添加SNP对Pb胁迫下雌雄美洲黑杨叶片Pb含量的影响
注：根据Tukey检验，不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异；CK. 对照；T1. 仅添加SNP处理；T2. 仅进行Pb污染处理；T3. 添加SNP和Pb污染的交互处理；下同。
Figure 1. The effects of SNP on Pb content in the leaves of females and males of P. deltoides exposed to Pb pollution
Note: Different normal letters above the bars denote statistically significant differences between treatments at 0.05 level according to Tukey’s test; CK. the control; T1. SNP+non-Pb polluted; T2. non-SNP+Pb polluted; T3. SNP+Pb polluted; the same as below.
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图 2 添加SNP对Pb胁迫下雌雄美洲黑杨渗透调节物、H2O2和MDA含量(鲜重)的影响
Figure 2. The effects of SNP on the contents of osmotic solutes, H2O2 and MDA (fresh weight, FW) in females and males of P. deltoides exposed to Pb pollution
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图 3 外源NO供体SNP对Pb胁迫下雌雄美洲黑杨抗氧化酶的影响
Figure 3. Effects of exogenous NO on the activities of antioxidative enzymes in leaves of females and males of P. deltoides exposed to Pb pollution
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图 4 外源NO供体SNP对Pb胁迫下雌雄美洲黑杨净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)的影响
Figure 4. Effects of exogenous NO on the net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs), intercellular CO2 concentration (Ci) and transpiration rate (Tr) in females and males of P. deltoides exposed to Pb pollution
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