咖啡豆在烘焙过程中挥发性物质的组成变化及抗氧化活性评价
The Compositions Change and Antioxidant Activity of Volatile Components Coffee Beans (Coffea arabica L.) during the Roasting Process
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咖啡是全世界最受欢迎的饮料之一，在中国云南省广泛种植。云南咖啡(Coffea arabica L.)属阿拉伯原种的变异种，由法国传教士引入云南宾川种植，后经过长期的栽培驯化而成，一般称为云南小粒种咖啡，已有一百多年的栽培历史[1-2]。云南小粒种咖啡多数植于海拔1 100 m左右的干热河谷地区，由于得天独厚的地理环境和气候条件，所以酸味适中，香气浓郁且口感醇和。
咖啡具有醒脑提神、抗忧郁、抗氧化、抗菌以及预防癌症等方面的生物活性，这与其含有的化学成分是密切相关的。自20世纪初以来，对于咖啡的化学成分，特别是对咖啡豆风味化学物质的研究已有很多报道，有将近1 000多种的挥发性化学物质已在咖啡豆提取物中被发现，其发现的化合物有近400种是杂环化合物，其中包括吡咯、呋喃、噻唑、恶唑、噻吩、咪唑和吡嗪类化合物[3-5]。
烘焙温度及烘焙时间决定了咖啡的烘焙程度，烘焙过程对咖啡风味物质的产生及变化有重要影响[6]。本研究对不同烘焙阶段咖啡豆挥发性物质的含量和化学组成进行分析，在成分分析中，采用保留指数与标准谱库检索相结合的方式，对咖啡豆挥发性成分进行定性分析，其分析结果比以往单独使用谱库检索的方式更加准确可靠。本研究通过对不同烘焙阶段咖啡豆挥发性物质的组成及抗氧化活性测定，分析抗氧化活性与主要化学成分的关系，为下一步在咖啡中寻找新的抗氧化剂，以及评估饮用咖啡的优势，提供一定的试验依据。
1. 材料与方法
1.1 不同烘焙时间咖啡豆挥发油样品的制备方法
分别称取云南普洱产小粒生咖啡豆(Coffea arabica L.)200 g，置于250 ℃带旋转烤笼的烘箱中烘焙3、6、9、12、15、18 min，将烘烤后的咖啡豆进行研磨。分别准确称取50.0 g未经烘焙的生豆粉、不同烘焙时间的咖啡豆粉和500 mL蒸馏水置于同时蒸馏萃取设备(上海化科实验器材有限公司)内，用二氯甲烷30 mL提取3 h。萃取液用无水硫酸钠干燥、过滤，35 ℃旋转蒸发挥干溶剂。将得到的挥发油称重，分别进行3次平行试验。挥发油用无水乙醇溶解成5.0 mg/mL的待测液，待测液进行体外抗氧化活性测定，并用Agilent 7890/5975C GC-MS气质联用仪(美国安捷伦公司)进行成分检测。
1.2 挥发性成分分析
1.2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent HP-5 MS色谱柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持15 min；载气(He)流速1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，进样量1 μL；分流比：30:1。
1.2.2 质谱条件
电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；m/z扫描范围40～400；溶剂延迟时间3 min。
1.2.3 定性和定量方法
供试样品根据GC-MS分析得到的各色谱峰，通过计算机谱库检索(2011版NIST库)，结合化合物保留指数进行定性，并根据挥发性成分的峰面积归一化定量。化合物保留指数(retention index，RI)按下式计算：
${\rm{RI = }}100\;{n} + 100 \times \frac{{{{t}} - {{{t}}_{{n}}}}}{{{{{t}}_{{{n + 1}}}} - {{{t}}_{{n}}}}}$
式中：n为目标化合物流出前1个正构烷烃(C8-C20，美国Sigma-Aldrich公司)所含碳原子的数目；t为目标化合物的保留时间；tn为目标化合物流出的前1个正构烷烃的保留时间；tn+1为目标化合物流出后1个正构烷烃的保留时间；tn<t<tn+1。
1.3 抗氧化活性测定
1.3.1 DPPH自由基清除试验
分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL待测液，1.0 mL无水乙醇与2.0 mL (0.2 mmol/L)的DPPH(梯希爱化成工业发展有限公司)乙醇溶液混合，振摇均匀后放于暗处静置30 min，使用Shimadzu UV-260分光光度计(日本岛津公司)于517 nm处测定吸光度(A样品)。同时测定2.0 mL (0.2 mmol/L)的DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇混合液的吸光度(A对照)，以及1.0 mL待测液与3.0 mL无水乙醇混合液的吸光度(A空白)。DPPH自由基清除率=[1−(A样品−A空白)/A对照]×100%，每个样测定3次取平均值。绘制不同烘焙时间下样品的清除率曲线，求出清除率为50%时的质量浓度，即半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，IC50值越小，表明样品对DPPH自由基的清除能力越强。
1.3.2 FRAP测定总抗氧化能力
FeSO4标准曲线的制作：分别取不同质量浓度的FeSO4溶液1.0 mL，各加入2.0 mL配制好的TPTZ (梯希爱化成工业发展有限公司)工作液，37 ℃水浴30 min，使用Shimadzu UV-260分光光度计测定593 nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线。
样品总抗氧化能力的测定：准确吸取样品溶液200 μL，加入2.0 mL配制好的TPTZ工作液，37 ℃水浴30 min，测定593 nm 处的吸光度。
1.4 数据分析
试验采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，并进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 咖啡在烘焙过程中的挥发油分析
2.1.1 咖啡在烘焙过程中的挥发油含量的变化
由图1可知：随着烘焙时间的增加，挥发油含量由生豆的21 μg/g大幅度增加到烘焙9 min的906.7 μg/g，增加了43倍。但烘焙时间超过9 min后，样品挥发油含量又呈现下降趋势，烘焙到18 min后，挥发油的含量约最高含量的1/2。
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图 1 咖啡豆在烘焙过程中挥发油含量的变化Figure 1. Change of volatile oil content of Yunnan Arabica coffee beans during the roasting degree2.1.2 咖啡在烘焙过程中挥发性物质的主要化学成分分析
咖啡的烘焙过程可分为高温脱水、高温反应和常温冷却3个阶段[7]。烘焙开始阶段主要是高温脱水阶段，在这个阶段主要是咖啡豆中的水分散失，随着高温反应的开始，挥发油含量逐渐增加。咖啡在烘焙过程中，芳香物质的组成和含量发生了显著的变化。不同烘焙阶段样品的挥发性成分GC-MS总离子质谱图见图2，主要挥发性香气物质相对百分含量的测定结果见表1。
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图 2 不同烘焙阶段咖啡豆挥发性成分GC-MS总离子质谱图Figure 2. GC-MS total ion chromatogram of Yunnan Arabica coffee beans during the roasting degree表 1 不同烘焙阶段咖啡豆挥发性成分的相对含量(%)及其与抗氧化活性的相关系数(r)Table 1. The correlation coefficients (r) between the antioxidant activity and the aromatic components and GC peak area (%) in coffee beans of different roasting degree保留时间/min
retention time化合物 compounds 保留指数
retention index相对含量/% relative content r 0 min 3 min 6 min 9 min 12 min 15 min 18 min 4.310 己醛 hexanal 769 — 1.10 0.68 0.43 0.37 0.24 — −0.459 4.510 2-甲基四氢呋喃-3-酮
dihydro-2-methyl-3(2H)-furanone772 — 0.03 1.58 1.08 0.72 0.05 — −0.469 4.956 2-甲基吡嗪
2-methylpyrazine825 — 1.45 6.76 4.50 4.67 1.18 0.29 −0.404 5.309 糠醛furfural 831 — 0.68 9.74 4.61 1.86 0.76 0.54 −0.463 5.998 糠醇furfuryl alcohol 849 1.51 8.46 21.16 29.94 27.98 4.16 2.05 −0.351 6.192 3-甲基吡啶
pyridine, 3-methyl-852 — 0.08 0.03 — 0.05 1.32 0.86 0.936** 6.490 对二甲苯
p-xylene862 — 1.23 0.10 0.48 0.45 0.53 — −0.043 由表1可看出：生咖啡豆中仅含有极少量的挥发性物质，相对含量较高的化合物有4-乙烯基愈创木酚和棕榈酸。烘焙3 min的咖啡豆，基本处于脱水、反应开始阶段，其含有的挥发性物质较少，相对含量较高的化合物有4-乙烯基愈创木酚、棕榈酸、糠醇、苯乙醛、2,5-二甲基吡嗪等，其中4-乙烯基愈创木酚的相对含量达到27.64%。随烘焙时间的增加，挥发性成分的含量和组成都发生了显著的变化，产生了大量的杂环化合物，包括吡咯、呋喃、噻唑、吡嗪和酚类化合物等。其中相对含量变化较大的化合物有糠醇、糠醛、2-甲基吡嗪、5-甲基呋喃醛、苯酚、乙酸糠酯、2-乙酰基呋喃、愈创木酚、乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚等。
烘焙15 min以上的咖啡豆属于过度烘焙，产生了大量的酚类化合物，有苯酚、愈创木酚和乙基愈创木酚等。其中烘焙15 min和18 min，苯酚的相对含量分别达到13.34%和26.69%；愈创木酚的相对含量分别达到5.76%和5.21%；乙基愈创木酚的相对含量分别达到6.47%和6.55%，相比烘焙12 min，3种酚类化合物的相对含量都有大幅增加。
2.2 咖啡豆在烘焙过程中挥发性物质的抗氧化活性分析
2.2.1 咖啡豆在烘焙过程中挥发性物质DPPH自由基清除能力
由图3可知：在烘焙6 min后，挥发性物质的自由基清除能力随咖啡豆烘焙程度的加深呈现显著上升趋势，在烘焙15 min的时候达到最高，IC50值为0.373 mg/mL，之后略有下降。而生咖啡豆和烘焙3 min的咖啡豆，挥发性物质的IC50值分别为0.612 mg/mL 和0.576 mg/mL，由于挥发油中所含4-乙烯基愈创木酚的相对含量分别达到26.43%和27.64%，所以应该是其抗氧化能力相对较高的主要原因。
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图 3 不同烘焙程度咖啡豆挥发油的DPPH自由基清除能力比较Figure 3. IC50 of the volatile oil of Yunnan Arabica coffee beans at the roasting degrees2.2.2 咖啡豆在烘焙过程中挥发性物质FRAP值
由图4可知：在烘焙6 min后，挥发性物质的总抗氧化能力随烘焙程度的加深呈现显著上升趋势，在15 min时候达到最高，FRAP值为0.219 mmol/L，之后略有下降，挥发性物质的总抗氧化能力与DPPH自由基清除能力的变化趋势基本一致。
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图 4 咖啡在烘焙过程中挥发性成分的FRAP值变化Figure 4. FRAP value of the volatile oil of Yunnan Arabica coffee beans at the roasting degrees2.2.3 主要成分含量与抗氧化活性相关性分析
由表1可知：咖啡豆挥发性物质的FRAP自由基清除率与吡咯、吡嗪、呋喃和酚类化合物的相对含量显示出显著正相关性。其中相关性较高的吡咯类化合物有3-甲基吲哚和吲哚；相关性较高的吡嗪类化合物有1-甲基乙烯基吡嗪、5H-5-甲基-6,7-二氢环戊并吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪和环己烷并吡嗪；相关性较高的呋喃类化合物为5-甲基-2-糠基呋喃；相关性较高的酚类化合物有愈创木酚、4-乙基苯酚、对烯丙基苯酚、乙基愈创木酚、间甲酚、对甲苯酚和苯酚。
3. 讨论
天然抗氧化剂广泛存在于水果、蔬菜、中草药、茶和咖啡等植物中。咖啡豆中含有丰富的抗氧化成分，并具有比较强的抗氧化和清除自由基能力[8]。在烘焙过程中，咖啡豆的化学成分发生了深刻的变化，从而形成各种各样的具有抗氧化活性的化合物[9-11]。有关咖啡具有抗氧化活性的化合物，如酚类化合物、生物碱、类黑精、绿原酸等已经有很多报道[12-15]，但对于咖啡豆挥发油的抗氧化活性，特别是不同烘焙阶段挥发性油抗氧化活性的变化规律，未见报道。
本研究通过对不同烘焙阶段咖啡豆挥发性物质含量和组成的测定，发现在烘焙过程中，咖啡豆中挥发油的含量开始大幅增加，但随着烘焙时间的增加又开始降低。过度烘焙的咖啡豆，其挥发油中产生大量的苯酚、愈创木酚和乙基愈创木酚等酚类化合物。关于咖啡豆中酚类物质的形成途径，有研究提出了基于两个有关的反应路径[16](图5)：1个路径被称为“低活化能”路径，在烘焙的开始阶段，生咖啡豆中的5-阿魏酰奎尼酸酯水解后的阿魏酸通过脱羧反应，形成4-乙烯基愈创木酚，随着烘焙时间的增加，4-乙烯基愈创木酚的形成逐渐减慢，并开始下降，当咖啡豆到达较高的温度，第2个“高活化能”反应路径开始，4-乙烯基愈创木酚氧化形成愈创木酚；当再继续增加烘焙时间，咖啡豆达到过度烘焙，愈创木酚进一步形成苯酚和乙基愈创木酚，这与本研究的结果一致。本研究进一步证实了过度烘焙的咖啡豆是不适宜饮用的。
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图 5 咖啡豆在烘焙过程中主要酚类化合物的形成途径Figure 5. Pathway for the formation of phenolic compounds during Arabica coffee beans roasting本研究还利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和铁离子还原(FRAP)法对不同烘焙阶段咖啡豆挥发性物质的抗氧化活性进行了测定，揭示了不同烘焙阶段咖啡豆挥发性物质抗氧化活性的变化规律，发现了其挥发性物质具有较好的抗氧化活性，并随烘焙程度的加深呈现显著上升趋势，其中吡啶、吡咯、呋喃、吡嗪和酚类化合物相对含量的大幅增加可能是其抗氧化能力显著上升的主要原因。本研究结果进一步证实了咖啡豆中典型的杂环挥发性化合物吡咯、呋喃、噻吩和噻唑等均具有抗氧化活性[17]。
物质的抗氧化能力是所含化合物不同抗氧化能力的综合表达，由于咖啡豆挥发性物质组成十分复杂，关于咖啡挥发性物质中不同化合物抗氧化能力以及各化合物之间的协同问题，还有待进一步深入分析和研究。
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图 1 咖啡豆在烘焙过程中挥发油含量的变化
Figure 1. Change of volatile oil content of Yunnan Arabica coffee beans during the roasting degree
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图 2 不同烘焙阶段咖啡豆挥发性成分GC-MS总离子质谱图
Figure 2. GC-MS total ion chromatogram of Yunnan Arabica coffee beans during the roasting degree
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图 3 不同烘焙程度咖啡豆挥发油的DPPH自由基清除能力比较
Figure 3. IC50 of the volatile oil of Yunnan Arabica coffee beans at the roasting degrees
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图 4 咖啡在烘焙过程中挥发性成分的FRAP值变化
Figure 4. FRAP value of the volatile oil of Yunnan Arabica coffee beans at the roasting degrees
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图 5 咖啡豆在烘焙过程中主要酚类化合物的形成途径
Figure 5. Pathway for the formation of phenolic compounds during Arabica coffee beans roasting
表 1 不同烘焙阶段咖啡豆挥发性成分的相对含量(%)及其与抗氧化活性的相关系数(r)
Table 1 The correlation coefficients (r) between the antioxidant activity and the aromatic components and GC peak area (%) in coffee beans of different roasting degree
保留时间/min
retention time化合物 compounds 保留指数
retention index相对含量/% relative content r 0 min 3 min 6 min 9 min 12 min 15 min 18 min 4.310 己醛 hexanal 769 — 1.10 0.68 0.43 0.37 0.24 — −0.459 4.510 2-甲基四氢呋喃-3-酮
dihydro-2-methyl-3(2H)-furanone772 — 0.03 1.58 1.08 0.72 0.05 — −0.469 4.956 2-甲基吡嗪
2-methylpyrazine825 — 1.45 6.76 4.50 4.67 1.18 0.29 −0.404 5.309 糠醛furfural 831 — 0.68 9.74 4.61 1.86 0.76 0.54 −0.463 5.998 糠醇furfuryl alcohol 849 1.51 8.46 21.16 29.94 27.98 4.16 2.05 −0.351 6.192 3-甲基吡啶
pyridine, 3-methyl-852 — 0.08 0.03 — 0.05 1.32 0.86 0.936** 6.490 对二甲苯
p-xylene862 — 1.23 0.10 0.48 0.45 0.53 — −0.043 
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