多油辣木PKM-1花药培养获得愈伤组织
Obtaining Callus from Anther Culture of Moringa oleifera Lam. cv. PKM-1
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Keywords:
- Moringa oleifera /
- PKM-1 /
- anther culture /
- callus /
- Murashige and Skoog media
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稳定性同位素锶(Sr)是人体需要的微量元素，适量的锶能够促进骨细胞和血管内皮细胞增殖，抑制破骨细胞形成和降低血管紧张性等功效[1-2]。然而锶可沉积在人骨组织中并滞留多年，因此人持续或过量摄入锶会引起机体急、慢性损伤，如神经调节功能、心血管功能、免疫功能障碍[3]。随着锶被广泛应用于显像管、制药、焰火等生产以及放射性治疗和核工业等行业之中，越来越多的锶进入土壤和水等生态环境，在土壤、水和植物之间转移，过量的锶通过饮用水和植物食物链途径进入人体，可能引发人患多种疾病。
利用植物对锶的吸收和富集作用修复遭受高浓度锶污染地区的生态环境具有成本低、效果好、无二次污染等优点。已有的研究表明：低浓度的锶能够促进一些植物的光合作用，增强叶片光合效率，而高浓度的锶妨碍叶片光合作用，导致光合效率降低[4-6]。说明在一定条件下低浓度的锶促进植物生长，高浓度锶对植物产生逆境胁迫作用。逆境胁迫作用在细胞质中大量累积活性氧(ROS)分子，如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2.ˉ)和羟自由基(HO·)等，进而使植物受到次级氧化胁迫，最终作用到细胞核的组氨酸激酶受体蛋白(HKT)，使膜脂、蛋白质和核酸等氧化损伤，进而改变细胞代谢，引起对植物的伤害[7-8]。植物为减轻活性氧对细胞膜及胞内生物大分子的伤害，其中最为重要的一类途径是通过保护酶系统，包括过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等清除活性氧，从而降低逆境胁迫对植物的伤害作用[9-10]。低浓度的ROS能够诱导植物产生对生物和非生物胁迫的保护机制，但高浓度的ROS导致过度的保护，最终造成对细胞的损伤[11]。
豆科植物具有较强的富集锶能力，其干物质中锶的含量最高[12]，在修复锶污染方面具有较高的应用价值。大豆是全球种植面积最大的豆科作物，提供了世界69%的食用蛋白和30%的食用油[13]，并且一定锶离子浓度中生长的大豆，其植物铁蛋白(包括香豆素类、异戊烯黄酮和异黄酮)含量升高[14]，异黄酮等物质具有防癌、抗衰老、抗氧化、防治心血管疾病等作用。因此，在锶污染的土壤中种植大豆不但能够起到修复作用，而且能够增加大豆中促进人类健康的物质积累。然而，高浓度的锶可能会对大豆产生逆境胁迫，导致大豆减产乃至绝收、死亡。锶胁迫植物的抗氧化生理机制虽有部分研究，但结果并不一致[15-16]，而锶胁迫大豆抗氧化系统研究也未见报道，因此本研究旨在探讨大豆锶胁迫下大豆的抗氧化机制，为大豆修复锶造成的环境污染等提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试大豆为南农1138-2，是奉贤穗稻黄单株选择获得的品系，是长江中下游大豆育种的优异亲本和重要推广品种[17]。
1.2 试验设计
选取籽粒饱满的大豆种子，经0.1% HgCl2消毒8 min，自来水冲洗5遍，播种于装有湿沙的花盆中，置于温室大棚中，自然光照，待出苗后，选取长势一致的幼苗转至1/2 Hoagland营养液(pH 5.8)中用不同浓度SrCl2进行处理。试验设6个处理，在1/2 Hoagland中分别添加含0.00、1.00、5.00、10.00、20.00和40.00 mmol/L的SrCl2溶液，每个处理3个重复，每个重复1盆，每盆5株。
1.3 测定项目和方法
根长和茎长：培养至V2期，以子叶节为分界点，分别测量根长和茎长。
鲜重和干重：从子叶节剪断后，吸干水渍，成为根和茎，称量根和茎鲜重，经105 ℃杀青10 min，80 ℃烘干至恒重后分别称取根和茎干重。根冠比＝根干重/茎干重。
分别采集三出复叶的中间小叶，重复内5株混合取样，每重复取0.20 g，立即用液氮充分研磨，然后用预冷的0.20 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.8)按料:液＝1:5多次洗涤，全部转移至1.5 mL的离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心20 min，取上清液，作为待测粗酶液。
酶活性测定：POD活性用愈创木酚法测定[18]，SOD活性用邻苯三酚自氧化速率法测定[19]，CAT活性用紫外吸收法测定[18]。酶的活力单位用比活力单位表示，即每分钟吸光度变化1个OD值(OD/min)。
酶活性单位= K·(ΔA·Vt)/(Vs·t)
式中，K=提取酶液总质量(料和液总质量)/样品质量；ΔA是反应时间内吸光度的变化，Vt是测定吸光值时的总体积； Vs是测定时取用的酶液体积；t为反应时间， min。
同工酶电泳：3种同工酶都采用Tris-HCl缓冲体系，浓缩胶浓度为4%，分离胶为7%。先用80 V电泳1 h，然后用110 V将POD和SOD电泳至溴酚蓝至胶底端为止，CAT溴酚蓝至胶低端后继续电泳1 h。POD同工酶用联苯胺染色法[20]、SOD同工酶用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法[21]、CAT同工酶用改良的铁染色法[22]染色。
1.4 数据分析
数据用Excel 2007和SPSS 13.0进行统计分析，经单因素方差分析(ANOVA)检验显著性，最小极差法(LSD)进行多重比较。
2. 结果与分析
2.1 锶对大豆生长的影响
从表 1可知：随着SrCl2浓度升高，大豆根长、茎长、根鲜重和干重、茎鲜重和干重都相应减小，在没有SrCl2胁迫下，生长最好。根冠比随SrCl2浓度升高而相应增大，说明SrCl2胁迫逆境条件下，根生长减少小于茎的减少。经方差分析表明：大豆的7个生长指标都受到不同SrCl2浓度处理的显著影响。最小极差法(LSD)多重比较显示：根长只有在5.00和10.00 mmol/L SrCl2浓度处理时差异不显著，其他处理之间都存在显著差异。茎长只有在1.00和5.00 mmol/L SrCl2浓度处理时差异不显著，其他处理之间都存在显著差异。根鲜重在1.00和5.00 mmol/L以及10.00和20.00 mmol/L SrCl2浓度处理之间不存在显著差异，其他处理间有显著差异。茎鲜重在不加SrCl2处理与1.00 mmol/L SrCl2处理没有显著差异，并显著高于添加5.00 mmol/L及以上浓度的SrCl2处理。根干重在不加SrCl2处理显著高于用SrCl2处理的根干重，并且5.00 mmol/L及以上浓度处理之间没有显著差异。茎干重只有用5.00和10.0 mmol/L之间以及20.00和40.00 mmol/L SrCl2浓度处理之间没有显著差异，其他处理之间都存在显著差异。根冠比在不加SrCl2处理时显著小于其他处理，1.00、5.00和10.0 mmol/L SrCl2处理之间没有显著差异，20.00和40.00 mmol/L处理之间没有显著差异。
表 1 不同浓度SrCl2处理下大豆的根和茎生长性状表现Table 1. Characteristics of soybean’s root and stem growth treated with different concentrations of SrCl2c(SrCl2)/
(mmol·L−1)根长/cm
length of root茎长/cm
length of shoot根鲜重/g
fresh weight of root茎鲜重/g
fresh weight of shoot根干重/g
dry weight of root茎干重/g
dry weight of shoot根冠比
root/shoot ratio0.00 23.25±0.69 a 26.78±1.78 a 0.83±0.035 a 1.42±0.079 a 0.057±0.004 a 0.157±0.008 a 0.37±0.006 c 1.00 20.45±1.06 b 21.63±1.11 b 0.67±0.045 b 1.35±0.069 ab 0.054±0.004 b 0.135±0.008 b 0.42±0.008 b 5.00 18.50±0.60 c 20.10±1.36 b 0.63±0.055 b 1.28±0.049 b 0.052±0.003 bc 0.120±0.007 c 0.43±0.002 b 10.00 17.77±0.35 c 17.98±0.38 c 0.59±0.024 c 0.92±0.013 c 0.051±0.002 c 0.117±0.012 c 0.44±0.025 b 20.00 15.45±0.99 d 7.77±0.15 d 0.56±0.018 c 0.78±0.053 d 0.048±0.002 c 0.096±0.007 d 0.53±0.017 a 40.00 13.03±0.68 e 1.42±0.08 e 0.48±0.015 d 0.75±0.019 d 0.047±0.001 c 0.086±0.004 d 0.54±0.019 a 注：同列不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)；下同。
Note: Different letters in the same column indicate significant difference among different treatments at 0.05 level; the same as below.2.2 锶对大豆抗氧化酶活性的影响
从表 2可知：添加SrCl2后，各浓度处理的POD、SOD和CAT酶活性均有不同程度的升高，3种酶活性都表现为随SrCl2浓度的升高，先升高后降低，并且只要添加SrCl2处理大豆的酶活性都显著高于未添加SrCl2处理大豆的酶活性。其中，POD酶活性从0到5.00 mmol/L SrCl2处理时缓慢升高，当用10.00 mmol/L SrCl2处理时，迅速升高到最大，然后随处理浓度升高缓慢下降，并且10.00与20.00 mmol/L处理之间没有显著差异，与其他处理之间都存在显著差异，而20.00与40.00 mmol/L SrCl2处理之间以及1.00与5.00 mmol/L SrCl2处理之间也没有显著差异。
表 2 不同SrCl2处理大豆抗氧化酶活性和比值Table 2. Activities and ratio of anti-oxidative enzyme of soybean under different SrCl2 treatmentsc(SrCl2)/(mmol·L−1) 酶活性/(OD·min−1) activities of anti-oxidative enzyme SOD/POD SOD/CAT SOD/(POD+CAT) POD SOD CAT 0.00 14.66±1.18 d 9.42±1.29 d 30.98±3.29 d 0.64±0.04 a 0.30±0.02 a 0.21±0.01 a 1.00 20.02±1.81 c 11.66±1.44 c 56.35±2.86 bc 0.59±0.12 a 0.21±0.02 c 0.15±0.02 b 5.00 24.44±1.94 c 15.70±1.37 a 69.77±5.19 a 0.65±0.05 a 0.23±0.04 bc 0.17±0.02 b 10.00 54.82±2.66 a 14.93±1.16 ab 60.09±6.44 b 0.27±0.02 b 0.25±0.03 bc 0.13±0.01 c 20.00 49.50±4.97 ab 14.46±0.86 ab 58.40±3.04 bc 0.30±0.05 b 0.25±0.03 bc 0.13±0.02 c 40.00 45.38±4.25 b 13.56±0.65 bc 51.80±3.97 c 0.30±0.02 b 0.26±0.01 b 0.14±0.01 c SOD酶活性从0.00到5.00 mmol/L SrCl2处理时迅速升高，0.00、1.00和5.00 mmol/L 3个SrCl2浓度处理的酶活性两两之间都存在显著性差异。5.00到40.00 mmol/L SrCl2处理酶活性缓慢下降，并且5.00、10.00和20.00 mmol/L SrCl2处理之间酶活性没有显著性差异，而10.00、20.00和40.00 mmol/L SrCl2处理之间酶活性也没有显著差异。
CAT酶活性从0.00到5.00 mmol/L SrCl2处理时同样迅速升高，0.00、1.00和5.00 mmol/L 3个SrCl2浓度处理的酶活性两两之间都存在显著性差异。而从5.00到40.00 mmol/L SrCl2处理的酶活性减少有所减缓，10.00与20.00 mmol/L SrCl2处理之间没有显著差异，20.00与40.00 mmol/L SrCl2处理之间没有显著差异。
SOD/POD的比例在0、1和5 mmol/L SrCl2浓度处理中没有显著差异，并且显著大于10、20和40mmol/L SrCl2浓度处理，后3个高浓度SrCl2处理之间也没有显著差异。SOD/CAT的比值在未添加SrCl2处理时显著大于添加SrCl2处理时的值，但添加SrCl2处理后，浓度越高，值也越大，从1.00到20.00 mmol/L的SrCl2处理范围内没有显著差异，5.00到40.00 SrCl2处理范围内也没有显著差异。SOD/(POD+CAT)的值中，未添加SrCl2处理时显著大于添加SrCl2处理的值，添加了SrCl2处理的比值之间没有显著差异。
3个酶的活性分析表明：低浓度SrCl2处理能够迅速提高酶的活性，增强抗氧化能力，达到缓解SrCl2胁迫的作用，但浓度达到一定程度后，随SrCl2浓度升高，酶活性逐渐降低，抗氧化能力受到一定的抑制。
2.3 锶胁迫对大豆抗氧化酶谱的影响
从图 1可知：在SrCl2胁迫下，大豆叶片中共产生了9种不同的POD酶带。其中，1、2、4、6和7型是6个处理共有的酶带，随SrCl2浓度的增加，同工酶的种类先增加，在对照处理的大豆中，除了第9型POD同工酶不表达外，其余8种表达；在1和5 mmol/L SrCl2处理时大豆POD同工酶种类表达最多，9种POD的同工酶都表达。5 mmol/L处理后，随浓度升高，POD同工酶种类表达减少，10和20 mmol/L处理下第8和9型POD同工酶不表达，其余均表达，40 mmol/L SrCl2处理下表达酶类型最少，第5、8和9型3种POD同工酶不表达。说明随SrCl2浓度的升高，部分类型的POD同工酶基因表达受到抑制。
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图 1 不同浓度SrCl2处理对大豆POD同工酶谱的影响注：横向数字代表SrCl2处理浓度；纵向数字代表POD同工酶酶谱；下同。Figure 1. Effects of SrCl2 treatments on the POD isoenzyme patterns of soybeanNote: The transverse numbers represent the concentrations of SrCl2, and the vertical numbers represent the patterns of POD isoenzymes.从图 2可知：在SrCl2胁迫的作用下，大豆叶片中共产生了5条不同的SOD酶带。其中在不添加SrCl2处理的大豆中有4种SOD同工酶，3型SOD同工酶不表达，5个添加SrCl2处理的大豆中，5种SOD同工酶都表达，说明添加SrCl2处理诱导了3型SOD同工酶表达来缓解胁迫作用所产生的活性氧(ROS)分子所产生的伤害。
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图 2 不同浓度SrCl2处理对大豆SOD同工酶谱的影响Figure 2. Effects of SrCl2 treatments on the SOD isoenzyme patterns of soybean从图 3可知：在SrCl2胁迫的作用下，大豆叶片中共产生了2条不同的CAT酶带。其中在不添加SrCl2处理的大豆中只能产生1型CAT同工酶，而在5个添加SrCl2处理的大豆中，1和2型2种CAT同工酶同时表达，说明添加SrCl2处理诱导了2型CAT同工酶表达来缓解胁迫作用所产生的活性氧(ROS)分子所产生的伤害。
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图 3 不同浓度SrCl2处理对大豆CAT同工酶谱的影响Figure 3. Effects of SrCl2 treatments on the CAT isoenzyme patterns of soybean3. 讨论
已有研究表明：低浓度的锶能够促进油菜和水稻的生长，提高光合效率，高浓度的锶抑制植物生长[5, 23]，然而大豆上并未见相关报道。本研究利用不同浓度锶处理大豆幼苗，结果表明：低浓度到高浓度的锶处理对大豆生长都有一定的抑制作用，随浓度的增加，抑制作用越强。虽然一定浓度锶能够使大豆增加对人类有益的植物铁蛋白含量[14]，然而随锶浓度的增加，大豆生长受到危害，因此锶污染严重的地区并不适合大豆种植。
植物在逆境胁迫下大量累积活性氧分子。过量的ROS攻击脂质、蛋白质等生物分子，导致它们氧化降解，酶失活，生物膜透性增强[24]。抗氧化酶系统能够有效清除植物中因胁迫诱导产生的过量ROS[25]。大豆在锶处理胁迫下，3种抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性都显著升高，并且随浓度增大都快速升高，其中POD酶活性在10 mmol/L SrCl2处理时增加到最大，SOD和CAT酶活性在5 mmol/L SrCl2处理时达到最大。此后，随SrCl2处理浓度增大，3种抗氧化酶的活性均有不同程度的降低，但降低速度低于先前各自的升高速度。这可能是在低浓度锶胁迫下，大豆快速增强抗氧化系统酶的表达减少锶胁迫产生的活性氧积累，有助于缓解胁迫带来的伤害，但在高浓度锶胁迫条件下，大豆抗氧化系统无法应对大量累积的ROS，导致了对植物的伤害。
已有的研究表明：在清除ROS的途径中，SOD酶负责将O2.ˉ歧化为H2O2，POD和CAT酶负责清除H2O2[20]，如果两者比例不协调同样达不到清除活性氧毒害的作用。本研究表明：虽然3种抗氧化酶都有不同程度的升高，然而SOD/POD值在高于5.00 mmol/L的SrCl2处理下显著降低。而SOD/CAT比值在添加SrCl2处理就表现降低，SOD/(POD+CAT)的比值添加SrCl2处理就表现为显著下降，而添加不同浓度SrCl2处理之间没有显著差异。说明清除SrCl2胁迫所产生ROS对大豆伤害的限制因素是SOD酶无法将O2.ˉ歧化为H2O2。
同工酶能催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质等存在明显差异。植物随生长阶段、外界环境的改变和自身生理状态的改变，同工酶谱带会发生相应的改变。在逆境胁迫下，植物为抵御不良环境会表达产生抗氧化系统酶的旁路途径，表达新的同工酶[8, 26]。本研究所用材料南农1138-2是基因型高度纯合的品种，本研究中同工酶的基因表达差异唯一来源于不同SrCl2处理。从抗氧化酶的同工酶谱带可见：POD种质资源遗传多样性研究在1和5 mmol/L SrCl2处理时大豆POD同工酶谱带最多，SrCl2处理诱导大豆表达了新的同工酶，5 mmol/L以上随SrCl2浓度升高，POD同工酶谱带减少，表达受到抑制。而SOD和CAT同工酶在添加SrCl2处理都新增了1条谱带，说明SrCl2处理诱导了同工酶基因的表达，使大豆产生了一种新的同工酶谱帯。
4. 结论
SrCl2作用抑制了大豆的生长，并随浓度升高抑制作用增加。大豆抗氧化系统的POD、SOD和CAT酶活性随SrCl2浓度升高，表现为先升高后降低。其中POD在10 mmol/L、SOD和CAT在5 mmol/L SrCl2处理时活性最大。并且SOD/POD、SOD/CAT和SOD/(POD+CAT)在SrCl2处理下比值降低，SOD酶活性是清除SrCl2使大豆产生过量ROS的限制因素。1.00和5.00 mmol/LSrCl2处理下大豆产生1条新的POD酶谱带，5 mmol/L以上SrCl2浓度处理，随浓度增加有部分POD谱带消失。SOD和CAT同工酶在SrCl2处理时产生了1条新的酶带。
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图 1 PKM-1花蕾及其花药培养(bar=1 cm)
注：a)-c) PKM-1花蕾；d)-e) 消毒过的花蕾及花药培养；f) 花药愈伤组织；g) 花药愈伤组织分化。
Figure 1. Buds of PKM-1 flower and the anther culture
Note: a)-c) buds of Moringa PKM-1 flower; d)-e) aseptic buds and the anther culture; f) callus generated from cultured anther; g) plantlet regenerate from callus of anther culture.
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图 2 PKM-1花药发育时期与二倍体细胞染色体数目(2n=28, bar=100 μm)
注：a) 四分体；b) 二倍体花药愈伤组织细胞2n=28；c) 二倍体组培苗。
Figure 2. Anther developmental stages and chromosome number of PKM-1
Note: a) tetrad anther; b) chromosome number of the doubled haploid callus; c) tissue culture plant.
表 1 辣木花药培养诱导愈伤组织
Table 1 Callus induction from PKM-1 anther on MS media supplemented with hormone
编号
No.ρ(2,4-D)/
(mg·L–1)ρ(NAA)/
(mg·L–1)接种数/个
anther number诱导率/%
callus induction rate1 1 0 100 1.5* 2 1.5 0.5 100 2.0* 3 2 0.5 100 4.5* 4 2 0 100 9.0* 5 2 1 100 4.5* 合计total — — 500 — 注：t值为−3.538，df为4，“*”为0.05水平上显著。
Note: t value is −3.538, df is 4, “*” represents significance at level 0.05.
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表 2 花药愈伤组织经秋水仙素处理加倍
Table 2 Doubled haploid calli from haploid calli treated with colchicine
编号
No.秋水仙素添加比
例/% colchicine percentage诱变时间/
h
time花药愈伤组织/块
haploid花药愈伤组织
加倍/块
doubled haploid1 0.4 24 50 20** 2 0.4 48 50 22** 3 0.4 72 50 23** 4 0.6 24 50 22** 5 0.6 48 50 25** 6 0.6 72 50 30** 7 0.8 24 50 29** 8 0.8 48 50 30** 9 0.8 72 50 28** CK 0 24 10 2 CK 0 48 10 2 CK 0 72 10 2 注：t值为5.484，df为11，“**” 为0.01水平上极显著。
Note: t value is 5.484, df is 11, “**” represent extreme significance at level 0.01.
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表 3 辣木花药愈伤组织诱导分化植株
Table 3 Moringa doubled haploid callus regenerate plantlets
激素/(mg·L-1)
hormone愈伤组织/块
callus愈伤组织分化状态
regeneration status1.0 6-BA 30 变大，未见胚状体 1.0 NAA 30 变大，未见胚状体 0.5 NAA + 0.5 6-BA 30 变大，未见胚状体 0.5 NAA + 1.0 6-BA 30 变大，未见胚状体 1.0 KT + 0.5 6-BA 30 变大，未见胚状体 0.5 KT + 0.5 6-BA 30 变大，未见胚状体
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