PP1γ2对昆明小鼠精子成熟和运动性的调控作用
Sperm Maturation and Motility in Kunming Mice Regulated by Protein Phosphatase PP1γ2
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Keywords:
- PP1γ2 /
- sperm maturation /
- sperm motility /
- Kunming mice /
- epididymis
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哺乳动物的精子刚从睾丸产生时并没有完全成熟，需进入附睾，在其中发生一系列形态、生理和生化方面的变化，完成成熟过程，形成具有活力的精子[1]。由于精子是高度分化的特异细胞，其染色质高度浓缩，既不进行基因转录也不能进行蛋白质的翻译合成，细胞活动的调控几乎都是通过翻译后蛋白质修饰的方式进行。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是翻译后蛋白质修饰及其活性与功能调节的重要方式之一。目前，研究人员已在人、牛、大鼠、仓鼠等许多哺乳动物精子中发现蛋白质的磷酸化作用，而且这种作用与精子的运动能力、获能或顶体反应密切相关[2-4]。细胞内蛋白质的磷酸化水平由蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调控作用来维持，已有的研究更多关注的是蛋白激酶对精子功能的调控，对磷酸酶与精子功能关系的研究报道较少。从理论上来说，作为蛋白质磷酸化调节的一分子，磷酸酶在精子功能调控中也应发挥作用，而且越来越多的证据表明精子中有丝/苏氨酸磷酸酶的存在，并参与精子重要功能的调节[5-7]。
蛋白磷酸酶分为丝/苏氨酸磷酸酶和酪氨酸磷酸酶两大类[8]，它们的催化亚基具有很高的同源性，但其N-端和C-端结构域差异极大[8-10]。目前至少发现4类丝/苏氨酸磷酸酶，即PP1、PP2A、PP2B和PP2C[10-12]。磷酸酶PP1包括PP1α、PP1β、PP1γ1和PP1γ2[12-14]等4个成员，其中，前3种磷酸酶几乎在所有组织中均有表达，PP1γ2则主要表达于睾丸中且是PP1在精子中的唯一表达形式。这些磷酸酶与精子功能关系的研究表明：PP1γ2与牛、灵长类附睾精子成熟、运动能力获得及雄性生育力以及小鼠超激活运动的调节有关[7, 15-18]。PP2A与人及灵长类动物精子运动性获得有关[15]，此外，它还参与小鼠、仓鼠精子的超激活运动和蛋白酪氨酸磷酸化的调节[18-19]。研究人员在人、山羊、牛、猪、犬等动物精子中检测到磷酸酶PP2B[20]，进一步研究发现PP2B与人、猪、犬、家禽等动物精子运动性、顶体反应的调控有关[20-23]。最近的研究显示人精子获能与丝/苏氨酸磷酸酶的活动有关[20, 24]。关于磷酸酶PP1γ2与昆明小鼠精子功能关系的研究目前未见报道。为此，本研究探索了PP1γ2对昆明小鼠精子在附睾中成熟和运动性变化的调控作用。
1. 材料与方法
1.1 材料
8~10周雄性性成熟的昆明小鼠购自昆明市艾尼莫实验动物养殖中心。NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、Glucose、pyruvic acid、CaCl2、Hepes、okadaic acid (OA)、calyculin A (CA)等试剂从Sigma公司购买；洗精液参照文献[25]的方法配制。
1.2 精子蛋白的提取
将小鼠脱颈处死，取出附睾头和附睾尾，将其分别放入2个离心管中，于37 ℃水浴孵育10 min，使精子自由游出。加适量洗精液混匀后取少许检测精子活力及精子总数，加入适量洗精液稀释精子至5×106~6×106 mL−1。5 000 r/min，弃上清。用VISCONTI等[26]所述方法提取精子蛋白后于−80 ℃保存备用。
1.3 Western-blot分析
具体操作详见VISCONTI等[26]描述。
1.4 OA和CA作用的最适浓度及最佳时间的确定
将小鼠精子悬液分为5管，加入不同浓度的OA (0、1、5、10、25 μmol/L)，于37 ℃水浴中孵育10 min，在显微镜下统计精子运动度，确定OA作用于精子的最佳浓度；用最佳浓度的OA与附睾尾精子共同孵育不同时间(0、10、20、30 min)，统计精子运动度，确定OA作用于精子的最佳时间。
将小鼠精子悬液分为6管，加入不同浓度的CA (0、5、10、30、50、70 nmol/L)，于37 ℃水浴中孵育10 min，在显微镜下统计精子运动度，确定CA作用于精子的最佳浓度；用最佳浓度的CA与附睾尾精子共同孵育不同时间(0、10、20、30 min)，统计精子运动度，确定CA作用于精子的最佳时间。
对照试验(Ctrol)为：将附睾尾精子洗涤后置于洗精液中，室温放置40 min，分别用不同浓度的OA (0、1、5、10、25 μmol/L)和CA (0、5、10、30、50、70 nmol/L)于37 ℃孵育10 min，统计精子运动度。
1.5 db-cAMP、IBMX、Ca2+、OA、CA对小鼠附睾头和附睾尾精子PP1γ2磷酸化变化的影响
将附睾头和附睾尾精子悬液分别转入2 mL离心管，分别加入DMSO (DMSO是溶解A23187的溶剂，50%DMSO是溶解OA的溶剂，1%DMSO是溶解CA的溶剂)、db-cAMP、IBMX、10 μmol/L A23187、Ca2+(0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L)、5 μmol/L OA和50 nmol/L CA，在37 ℃中孵育之后，提取精子蛋白，进行Western-blot分析。
2. 结果与分析
2.1 PP1γ2在小鼠附睾头和附睾尾精子中的存在形式
由图1可知：通过Western-blot分析表明在小鼠附睾头和附睾尾精子中存在PP1γ2，提取等量的小鼠附睾头和附睾尾精子蛋白，可以看到PP1γ2 在小鼠附睾尾精子的磷酸化程度远高于小鼠附睾头精子。
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图 1 PP1γ2在昆明小鼠附睾头和附睾尾精子的存在形式Figure 1. The present form of PP1γ2 in caput and caudal epididymal spermatozoa in Kunming mice2.2 db-cAMP、IBMX和Ca2+对PP1γ2磷酸化的影响
由图2可知：在小鼠附睾头和附睾尾精子悬液中加入db-cAMP、IBMX或Ca2+，不会改变PP1γ2的磷酸化水平。
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图 2 db-cAMP、IBMX和Ca2+对PP1γ2磷酸化的影响Figure 2. Effects of db-cAMP, IBMX and Ca2+ on the phosphorylation of PP1γ22.3 OA和CA对附睾头和附睾尾精子PP1γ2磷酸化的影响
由图3可知：在小鼠附睾头和附睾尾精子悬液中分别加入蛋白磷酸酶抑制剂OA或CA，附睾头和附睾尾精子的PP1γ2磷酸化程度显著增加。
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图 3 OA和CA对附睾头和附睾尾精子PP1γ2磷酸化的影响Figure 3. Effects of OA and CA on the phosphorylation of PP1γ22.4 OA和CA对小鼠精子运动性的作用
由图4a可知：在相同的培养时间下，在0~5 μmol/L范围内，随着OA浓度的升高，小鼠精子运动度逐渐升高；继续增加OA浓度(10~25 μmol/L)后，小鼠精子运动度逐渐降低。在5 μmol/L时，小鼠精子运动度显著高于其他各组。
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图 4 不同浓度的OA和CA对小鼠精子运动性的作用注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。Figure 4. Effects of OA and CA concentration on the sperm motilityNote: Bars with different letters are significantly different (P<0.05); the same as below.由图4b可知：在相同的培养相同下，在0~50 nmol/L中，随着CA浓度的升高，小鼠精子运动度呈现上升趋势；当CA浓度增至70 nmol/L时，小鼠精子运动度逐渐降低。在50 nmol/L时，小鼠精子运动度显著高于其他各组。
2.5 OA和CA对小鼠精子运动性的作用时间
由图5可知：向小鼠精子悬液中分别加入5 μmol/L OA和50 nmol/L CA，分别孵育0、10、20、30 min，发现小鼠精子运动度有不同程度升高，孵育10 min的运动度均显著高于其他各组。
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图 5 最佳浓度的OA和CA对小鼠精子运动性的作用时间Figure 5. The effect of incubation time of OA and CA on the sperm motility2.6 OA和CA对小鼠附睾头和附睾尾精子运动性的影响
由图6可知：不同浓度的OA和CA对小鼠附睾头和小鼠附睾尾精子运动度的趋势相似。0~5 μmol/L，随着OA浓度升高，小鼠精子运动度呈上升状态；5~25 μmol/L，其运动度逐渐降低；OA浓度为5 μmol/L时，小鼠附睾头的运动度显著高于其他浓度组(图6a)。0~50 nmol/L，随着CA浓度的升高，小鼠附睾头和附睾尾精子运动度呈上升趋势；当CA浓度增至50 nmol/L后，其运动度逐渐降低，且当CA的浓度为50 nmol/L时，小鼠附睾尾精子运动度高于其他浓度组(图6b)。
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图 6 OA和CA对小鼠附睾头和附睾尾精子运动性的影响Figure 6. Effects of OA and CA on the motility of caput and caudal sperm3. 讨论
本研究中，在附睾头和附睾尾精子中加入磷酸酶抑制剂OA或CA，均能使磷酸化的PP1γ2蛋白水平增加，由于CA是PP1或PP2A的高效抑制剂，说明PP1(PP1γ2自身)或PP2A可对PP1γ2做出调节，即使得磷酸化的PP1γ2去磷酸化。
本研究发现：附睾尾精子磷酸化的PP1γ2 远远高于附睾头精子的，在运动度较低的附睾头精子中加入磷酸酶抑制剂OA或CA，能显著提高精子运动度，且能增加磷酸化PP1γ2的蛋白表达水平，表明小鼠精子在从附睾头转移至附睾尾的过程中，通过蛋白磷酸酶PP1γ2的调控而成熟，精子运动性也受PP1γ2的调控，此调控作用通过PP1γ2磷酸化/去磷酸化影响其酶活性变化而实现，PP1γ2的这种磷酸化/去磷酸化变化及其对精子功能的调控模式与前人在人、猕猴、牛精子中的情形一致[7, 16]，说明这是精子成熟及运动性调控的一种通用机制。尽管这些研究阐明了PP1γ2在附睾精子成熟和运动性获得中的重要性及其基本调控模式，但PP1γ2进一步的作用机制仍不清楚。已有研究表明：精子运动的起始依赖于细胞内cAMP、Ca2+等调控因子[27]。因此，本研究在附睾头和附睾尾精子中加入cAMP类似物db-cAMP、磷酸二酯酶抑制剂IBMX (能增加胞内cAMP浓度)以及Ca2+，以探索PP1γ2磷酸化状态的变化，研究结果显示：PP1γ2的磷酸化状态没有改变，说明它们可能以不同路径对精子成熟和运动性进行调控。
此外，HUANG等[16]认为：PP1γ2可能通过与其他蛋白分子的相互作用而在附睾头和附睾尾中表现出不同的活性。磷酸化的PP1γ2是该酶在附睾尾精子中唯一具催化作用的活性形式(尽管磷酸化的PP1γ2也结合有其他蛋白分子，即protein 14-3-3)，附睾尾精子中其他两种形式的PP1γ2则没有催化活性，它们分别是与sds22蛋白(为酵母PP1结合蛋白sds22蛋白的同源物)和hsp90蛋白相结合的PP1γ2。有意思的是，在附睾头精子中，大量非磷酸化的PP1γ2并不像在附睾尾精子那样与sds22蛋白结合在一起，它们或与1种17kDa蛋白质相结合，或单独存在[28]，因此，这种自由的PP1γ2分子具有催化活性，其他二种形式的PP1γ2与附睾尾精子中的一样。精子成熟过程中PP1γ2酶活性的降低是由非磷酸化的PP1γ2与其蛋白调节分子相结合的变化所引起，据推测这些变化远远大于有催化活性的磷酸化的PP1γ2。他们推测磷酸化的PP1γ2可能是在精子中维持PP1γ2催化活性的一种生化机制。由于本研究中PP1γ2在昆明小鼠附睾头和附睾尾的存在形式及对精子功能的作用方式与HUANG等[16]研究的结果相同，故推测其调控机制也与其基本一致。需要指出的是，除PP1γ2外，我们还检测到另外2种磷酸酶(PP2A 和PP2B)也存在于昆明小鼠精子中，其具体作用及是否与PP1γ2有关则是下一步的重点研究内容。
4. 结论
PP1γ2通过磷酸化和去磷酸化作用，其酶活性发生变化，从而对昆明小鼠附睾精子成熟和运动性进行调控，酶PP1γ2通过失活或降低活性的方式而促使附睾精子成熟及提高精子运动度。
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图 1 PP1γ2在昆明小鼠附睾头和附睾尾精子的存在形式
Figure 1. The present form of PP1γ2 in caput and caudal epididymal spermatozoa in Kunming mice
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图 2 db-cAMP、IBMX和Ca2+对PP1γ2磷酸化的影响
Figure 2. Effects of db-cAMP, IBMX and Ca2+ on the phosphorylation of PP1γ2
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图 3 OA和CA对附睾头和附睾尾精子PP1γ2磷酸化的影响
Figure 3. Effects of OA and CA on the phosphorylation of PP1γ2
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图 4 不同浓度的OA和CA对小鼠精子运动性的作用
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 4. Effects of OA and CA concentration on the sperm motility
Note: Bars with different letters are significantly different (P<0.05); the same as below.
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图 5 最佳浓度的OA和CA对小鼠精子运动性的作用时间
Figure 5. The effect of incubation time of OA and CA on the sperm motility
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期刊类型引用(2)
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百度学术
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