蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)是原产于热带、亚热带地区的附生兰科(Orchidaceae)植物，其花型奇特，花色艳丽，花期长，是重要的观赏切花和盆栽花卉，具有较高的经济价值^[1]。蝴蝶兰在中国云南、福建、台湾、广东等地广泛种植，长年稳居云南省年宵花销售榜首。云南省的蝴蝶兰大多分布于昆明市晋宁区和嵩明县、玉溪市江川区、红河哈尼族彝族自治州开远市等地，其中嵩明县是云南最大的蝴蝶兰主产区。随着中国蝴蝶兰相关产业的发展，其种植面积不断扩大，再加上长年工厂化组织培养的繁殖方式，导致病毒病发生严重。目前，在蝴蝶兰上已报道的病毒包括建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus，CymMV)、齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus，ORSV)等^[2-3]，对蝴蝶兰的产量和品质造成了严重的影响。程晓非等^[4]和郑元仙等^[5]分别从云南蝴蝶兰病样中分离到隶属于正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的病毒分离物Tospo-Pha以及凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot orthotospovirus，INSV)。丁元明等^[6]和黄亚宁等^[7]分别报道了云南蝴蝶兰中的CymMV、INSV以及番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)和番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot orthotospovirus，TZSV)的复合感染。扆守鑫等^[8]和宋起萱等^[9]发现：危害云南蝴蝶兰的主要病毒为CymMV和ORSV。综上所述，目前在云南蝴蝶兰上报道了5种病毒的侵染。

近年来，随着中国兰科植物种苗进出口渠道的多元化，种苗、盆花或切花产品的国内外贸易和种质交流日益频繁，也增加了一些新型病毒病发生和传播的风险^[10-11]。ORSV属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是广泛危害蝴蝶兰的病毒之一^[12]，但截至目前，尚未见其同属的其他病毒侵染蝴蝶兰的相关报道。课题组对来自昆明花卉市场上的蝴蝶兰病毒病开展病毒检测时，发现了疑似烟草花叶病毒属的番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus，ToMMV)。ToMMV寄主广泛，试验条件下可侵染茄科、豆科、十字花科等5科33种植物^[13-18]，但尚未见ToMMV对兰科植物侵染的相关报道。ToMMV传播方式多样，暗示其可能对更多的植物造成危害^[15]。被ToMMV感染的田间茄科作物往往表现出顶端坏死、叶片皱缩、斑驳^{[13-14, 19]}、花瓣碎色^[20]等症状，严重影响茄果类作物果实的产量及品质。

为更好地了解当前蝴蝶兰产业发展过程中病毒的感染情况，本研究收集了昆明花卉市场的17份蝴蝶兰样品，利用已报道且能侵染蝴蝶兰的ORSV、CymMV、TSWV、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、TZSV及其他病毒的特异性引物进行相关病毒的检测，以明确昆明市售蝴蝶兰携带的病毒种类，并对疑似首次在蝴蝶兰上发现的ToMMV分离物的cp基因进行序列分析，以期为蝴蝶兰病毒病的防控提供参考。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

于2023年7月—2024年4月，对云南昆明花鸟市场的蝴蝶兰进行病害调查，并采集表现为花瓣碎色、叶片褪绿等疑似感染病毒病的蝴蝶兰样品。对采集的样品进行拍照、编号，置于−80 ℃冰箱保存备用。

1.2   供试材料

大肠杆菌DH5α菌株为云南生物资源保护与利用国家重点实验室保存；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)为国产分析纯；pMD19-T载体和反转录试剂TaKaRa Reverse Trancsriptase M-MLV (RNase H⁻)购自宝生物工程(大连)有限公司，2×SanTaq PCR Mix、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒和DNA纯化回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ToMMV CP单克隆抗体由浙江大学吴建祥教授提供；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。用于病毒接种的蝴蝶兰幼苗购自广州蝴蝶兰基地。

1.3   引物设计

ToMMV检测引物根据GenBank中云南辣椒分离物基因组序列(GenBank登录号：KR824950)设计；CymMV和ORSV检测引物参考文献[10]，CMV检测引物参考文献[21]，TZSV检测引物参考文献[22]；TSWV和INSV检测引物由云南生物资源保护与利用国家重点实验室设计保存。各引物序列见表1。

表  1  用于检测蝴蝶兰病毒的引物

Table  1.  Primers used for virus detection in Phalaenopsis aphrodite

病毒 virus	引物名称 primer name	引物序列 (5′→3′) primer sequence	退火温度/℃ Tm	片段长度/bp fragment length	来源 source
CymMV	CymMV-F	CCGCCATAGTCATCCCTCTCTG	54	689	文献[10] reference [10]
	CymMV-R	GGACACAATCTTTAGAAACCCACA
ORSV	ORSV-F	ATGTCTTACACTATTACAGACCCGTC	56	690	文献[10] reference [10]
	ORSV-R	TTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC
ToMMV	ToMMV-F	ATGTCTTACGCTATTACTTCTCCG	54	691	本研究 this study
	ToMMV-R	TTAGGACGCTGGCGCAGAAGTC
CMV	CMV-PuF	TCTCATGGATGCTTCTCCGCG	61	692	文献[21] reference [21]
	CMV-PuR	CCGTAAGCTGGATGGACAACC
TSWV	TSWVmF	ACATCATACTCTACTCCAACACTC	54	693	本实验室 this laboratory
	TSWVmR	AACCACACTTCGGAATGCTACC
INSV	INSV-F	AGTGTTATCCTCTCAGTTGCTC	53	694	本实验室 this laboratory
	INSV-R	ATGTCTTGCTGAACACTGTCAC
TZSV	TZSV-NF	CCATCTGCTTCAATTGATC	50	614	文献[22] reference [22]
	TZSV-NR	CCTCTTTCTATGAGGAGAAC
注：CymMV. 建兰花叶病毒；ORSV. 齿兰环斑病毒；ToMMV. 番茄斑驳花叶病毒；CMV. 黄瓜花叶病毒；TSWV. 番茄斑萎病毒；INSV. 凤仙花坏死斑病毒；TZSV. 番茄环纹斑点病毒。 Note: CymMV. cymbidium mosaic virus; ORSV. odontoglossum ringspot virus; ToMMV. tomato mottle mosaic virus; CMV. cucumber mosaic virus; TSWV. tomato spotted wilt orthotospovirus; INSV. impatiens necrotic spot orthotospovirus; TZSV. tomato zonate spot orthotospovirus.

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1.4   植物病毒的RT-PCR检测和序列分析

利用CTAB法^[23]，从所采集的疑似病毒病样本中提取总核酸，以提取的样品总核酸为模板，利用TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H⁻)试剂盒合成病毒cDNA。参照2×SanTaq PCR Mix试剂说明书和表1的引物进行目标条带的PCR扩增。PCR反应体系总体积为10.0 μL，包括：2×SanTaq PCR Mix 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH₂O 3.6 μL，cDNA 1.0 μL。PCR反应程序为：预变性2 min；94 ℃变性30 s，不同引物的退火温度下(表1)退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止反应。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。电泳结束后，在紫光灯下剪切预期大小的特异性片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α，经PCR验证后送至生工生物工程(上海)公司进行测序。测序结果处理后提交至NCBI核酸数据库进行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列比对分析。

1.5   病毒的Dot-ELISA检测

参考张舒^[24]的方法对蝴蝶兰病毒进行常规Dot-ELISA检测。分别向检测到感染ToMMV的蝴蝶兰花瓣和叶片样品加入0.01 mol/L PBS缓冲液 (取Na₂HPO₄·12H₂O 3.0 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g和KH₂PO₄ 0.2 g完全溶解后定容至1 L，调节pH至7.2)进行研磨；研磨后的匀浆于4 ℃、12000 r/min离心5 min，取上清液2 μL点到硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜上，室温干燥30 min；将NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液 (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)中，室温封闭。依次进行ToMMV CP单抗孵育和碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育，最后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行显色，观察并记录结果。以感染ToMMV的珊西烟病叶为阳性对照样品。

1.6   病毒摩擦接种及感病植株的检测

为了验证ToMMV对蝴蝶兰的致病性，采用摩擦接种的方式，将PBS病毒缓冲液(即PBS缓冲液中含有感染了ToMMV的珊西烟汁液)接种至5株处于4叶期的健康蝴蝶兰上。取被ToMMV感染的珊西烟样品1.0 g于预冷的研钵中，加入0.01 mol/L PBS病毒缓冲液6 mL，充分研磨混合；于4 ℃、6000 r/min离心5 min，吸取全部上清液至新的1.5 mL离心管，置于冰上。在待接种健康蝴蝶兰叶片表面撒少量金刚砂，用手指蘸取少量病样汁液，在叶面顺时针轻轻摩擦，后喷洒清水。对照植株以同样的方式接种PBS缓冲液。接种完成的植株贴上标签，标注接种日期及毒源，观察记录蝴蝶兰植株的生长情况及感病症状。接种30 d后，采集蝴蝶兰叶片，对ToMMV进行RT-PCR和Dot-ELISA检测，方法同1.4和1.5节。

1.7   构建ToMMV cp基因系统进化树

利用NCBI网站的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具对RT-PCR扩增出的片段测序结果进行比对分析，从GenBank数据库中下载ToMMV不同分离物的cp序列，利用MEGA 7.0软件进行序列多重比对分析，然后在MEGA 7.0软件中采用最大似然法构建ToMMV不同分离物cp基因的系统进化树。

2.   结果及分析

2.1   蝴蝶兰样品中7种病毒的RT-PCR检测结果

利用CymMV引物扩增到约700 bp的条带，ORSV引物扩增到约400 bp的条带，TSWV引物扩增到约500 bp的条带，ToMMV引物扩增到约500 bp的条带，均与设计引物扩增片段大小一致(图1)。PCR扩增产物的克隆和测序结果表明：在17份蝴蝶兰样品中， 有7份样品检出ORSV、 CymMV、 TSWV和ToMMV， 病毒总检出率为41.18%。其中，6份样品检测到ORSV，检出率为35.29%；4份样品检测到CymMV，检出率为23.53%；各有1份样品分别检测到TSWV和ToMMV，检出率分别为5.88%；4份样品检测到ORSV和CymMV的复合侵染，复合侵染率为23.53%，1份样品同时检测到ORSV、CymMV和TSWV，复合侵染率为5.88%。在17份蝴蝶兰样品中均未检测到CMV、INSV和TZSV。

图  1  蝴蝶兰样品中7种病毒的RT-PCR检测结果

注：M. 2000 bp DNA Marker；1~17. 蝴蝶兰样品；CK. 阴性对照；+. 阳性对照。a) 建兰花叶病毒(CymMV)检测；b) 齿兰环斑病毒(ORSV)检测；c) 凤仙花坏死斑病毒(INSV)检测；d) 番茄环纹斑点病毒(TZSV)检测；e) 番茄斑萎病毒(TSWV)检测；f) 黄瓜花叶病毒(CMV)检测；g) 番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)检测。

Figure  1.  Seven viruses detection results by RT-PCR in Phalaenopsis aphrodite samples

Note: M. 2000 bp DNA Marker; 1-17. P. aphrodite samples; CK. negative control; +. positive control. a) detection of cymbidium mosaic virus (CymMV); b) detection of odontoglossum ringspot virus (ORSV); c) detection of impatiens necrotic spot orthotospovirus (INSV); d) detection of tomato zonate spot orthotospovirus (TZSV); e) detection of tomato spotted wilt orthotospovirus (TSWV); f) detection of cucumber mosaic virus (CMV); g) detection of tomato mottle mosaic virus (ToMMV).

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2.2   Dot-ELISA验证蝴蝶兰样品中ToMMV的感染

Dot-ELISA检测结果(图2)显示：感染ToMMV的珊西烟病叶(阳性对照)与ToMMV CP抗体呈强烈的阳性反应，感病蝴蝶兰的花瓣和叶片与ToMMV CP抗体呈弱阳性反应，健康的蝴蝶兰叶片与ToMMV CP抗体没有反应，表明感病蝴蝶兰的花瓣和叶片中确实存在ToMMV，但病毒含量较低。

图  2  Dot-ELISA验证ToMMV对蝴蝶兰的感染

注：1. 感染ToMMV的蝴蝶兰花瓣；2. 感染ToMMV的蝴蝶兰叶片；+. 感染ToMMV的珊西烟叶片阳性对照；CK. 健康蝴蝶兰叶片。

Figure  2.  Dot-ELISA verification of ToMMV infection in P. aphrodite

Note: 1. ToMMV-infected P. aphrodite petals; 2. ToMMV-infected P. aphrodite leaf; +. positive control of ToMMV-infected Nicotiana tabacum var. Xanthinc leaf; CK. healthy P. aphrodite leaf.

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2.3   接种ToMMV后蝴蝶兰的症状

接种PBS缓冲液的蝴蝶兰植株无症状；接种ToMMV的蝴蝶兰接种叶黄化，而系统叶无明显症状(图3)。RT-PCR和Dot-ELISA检测结果(图4~5)显示：在接种病毒的5株蝴蝶兰植株中均检出ToMMV，而接种PBS缓冲液的蝴蝶兰植株中未检出ToMMV，表明人工接种条件下ToMMV可以感染蝴蝶兰。

图  3  接种ToMMV蝴蝶兰的症状

注：a)和b) 接种PBS缓冲液；c)和d) 接种ToMMV。

Figure  3.  Symptom of P. aphrodite plants after inoculation with ToMMV

Note: a) and b) inoculation with PBS buffer solution; c) and d) inoculation with ToMMV.

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图  4  RT-PCR检测接种蝴蝶兰中ToMMV的感染情况

注：M. Marker；1~2. 接种PBS缓冲液；3~7. 接种ToMMV；+. ToMMV阳性对照；CK. 阴性对照。

Figure  4.  Detection of ToMMV infection in the inoculatedP. aphrodite by RT-PCR

Note: M. Marker; 1-2. inoculation with PBS buffer solution; 3-7. inoculation with ToMMV; +. ToMMV positive control; CK. negative control.

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图  5  Dot-ELISA检测接种蝴蝶兰中ToMMV的感染情况

注：1~5. 接种ToMMV；CK1和CK2. 接种PBS缓冲液；+. ToMMV阳性对照。

Figure  5.  Detection of ToMMV infection in the inoculatedP. aphrodite by Dot-ELISA

Note: 1-5. inoculation with ToMMV; CK1 and CK2. inoculation with PBS buffer solution; +. ToMMV positive control.

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2.4   ToMMV蝴蝶兰分离物cp基因的遗传变异和系统发育分析

从蝴蝶兰植株中克隆获得完整的ToMMV cp基因480 bp，测序后将ToMMV蝴蝶兰分离物(YKMHDL) cp基因序列(GenBank登录号：PP445226)与GenBank中其他19个ToMMV分离物的 cp基因序列进行比对，发现YKMHDL分离物与其他ToMMV分离物的cp基因核苷酸序列一致性为98.12%~99.79%。其中，YKMHDL分离物与云南元谋辣椒分离物(GenBank登录号：KR824950)、云南蒙自豌豆分离物(GenBank登录号：ON146334)的cp基因核苷酸序列一致性最高，为99.79%；与西藏拉萨辣椒分离物(GenBank登录号：KR824951)的cp基因核苷酸序列一致性为99.58%；与西班牙番茄分离物(GenBank登录号：KU594507)的cp基因核苷酸序列一致性最低，为98.12%。YKMHDL分离物与来自中国的海南番茄分离物(GenBank登录号：MG171192)、茄子分离物(GenBank登录号：MH636301)、安徽栝楼分离物(GenBank登录号：ON924176)的cp基因核苷酸序列一致性分别为99.17%、99.17%和98.75%，显示这些ToMMV中国分离物之间的亲缘关系较近。

以上述20个ToMMV分离物的cp基因序列构建系统进化树，结果(图6)显示：20个ToMMV分离物大致分为2个大组。组Ⅰ大部分为中国分离物，包括：云南元谋辣椒分离物、云南蒙自豌豆分离物、云南蝴蝶兰分离物、西藏辣椒分离物、海南番茄分离物、中国茄子分离物、山东番茄分离物(GenBank登录号：MW373515)，以及国外的越南番茄分离物(GenBank登录号：OK334224)、以色列番茄分离物(GenBank登录号：KP861748)和美国番茄分离物(GenBank 登录号：KX898033)；其中，ToMMV-YKMHDL分离物与云南元谋辣椒分离物、云南蒙自豌豆分离物聚集到同一小分支，表明3个分离物之间亲缘关系最近。组Ⅱ大部分为国外分离物，包括：美国番茄分离物(GenBank登录号：KT810183、KP202857、KM000123)、澳大利亚辣椒分离物(GenBank登录号：MN654021)、墨西哥番茄分离物(GenBank 登录号：KF477193)、西班牙番茄分离物和巴西番茄分离物(GenBank 登录号：KT222999)，以及来自中国的广东辣椒分离物(GenBank 登录号：OK180812)、安徽栝楼分离物和辽宁辣椒分离物(GenBank 登录号：MN853592)；其中来自中国的3个分离物聚集在同一小分支上。对比2个大组之间的分离物发现：中国的分离物亲缘关系较近，基本上都聚在组Ⅰ，或单独成1个小分支(云南辣椒、豌豆、蝴蝶兰分离物聚集在同一小分支；辽宁辣椒、广东辣椒、安徽栝楼分离物聚集在同一小分支)，而与其他国家的ToMMV分离物亲缘关系相对较远，表明不同ToMMV分离物之间的差异可能与其地理来源有关。

图  6  基于ToMMV不同分离物cp基因序列构建的系统发育树

注：▲为本研究获得的ToMMV蝴蝶兰分离物。

Figure  6.  Phylogenetic tree based on the cp gene sequences of different ToMMV isolates

Note: ▲ indicates the ToMMV P. aphrodite isolate obtained in this study.

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3.   讨论

蝴蝶兰具有较高的观赏价值和经济价值，是重要的观赏花卉之一。目前世界上已报道CymMV、ORSV、CMV、TSWV等超过15种植物病毒能够感染蝴蝶兰。病毒感染会导致蝴蝶兰叶片坏死和畸形、花穗短小、花期缩短、花瓣变色等明显症状，导致蝴蝶兰观赏和商品价值降低^[25]；此外，还有部分病毒感染蝴蝶兰后虽然无明显症状，但会造成植株生长缓慢^[5]。在国内外关于蝴蝶兰病毒病的报道中，危害最为广泛和严重的是CymMV和ORSV，这2种病毒可以通过无性繁殖材料、汁液、昆虫媒介等传播，是影响世界蝴蝶兰经济的主要病原^{[12, 26]}。

云南省是中国蝴蝶兰的主要产地之一，目前云南地区报道了蝴蝶兰的CymMV^{[6, 8-9]}、ORSV^[8-9]、INSV^[5-6]、TSWV^[7]和TZSV^[7]侵染，其中CymMV和ORSV是危害云南地区蝴蝶兰的主要病毒，检出率高达90%以上^[9]。本研究对昆明市售的蝴蝶兰进行了病毒检测，发现ORSV和CymMV依然是危害蝴蝶兰的主要病毒，检出率分别为35.29%和23.53%。7份阳性蝴蝶兰样品中，ORSV单独感染样品无明显症状，ORSV和CymMV复合侵染的样品表现为花瓣碎色或症状不明显，而受到ORSV、CymMV和TSWV复合侵染的样品表现为叶片褪绿，推测该症状可能与TSWV或其他未知病毒有关，单一或复合病毒侵染对蝴蝶兰病毒病症状的影响需进一步研究。本研究首次在蝴蝶兰中检出ToMMV，并通过人工接种方式验证ToMMV对蝴蝶兰的致病性，结果表明：ToMMV能感染蝴蝶兰，但被ToMMV感染的蝴蝶兰无明显症状，这与市售ToMMV侵染的蝴蝶兰叶片轻微褪绿有所不同，分析其原因可能与蝴蝶兰品种特性、ToMMV分离物或蝴蝶兰上还存在其他病毒感染有关，具体原因还需进一步探究。

ToMMV为帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属成员，于2013年首次在墨西哥温室番茄中被报道^[27]。据欧洲和地中海植物保护组织统计：ToMMV已在全球24个国家和地区发生，使番茄、辣椒等作物的生产遭受了重大损失^[28]。目前报道的ToMMV自然寄主有茄科^[29-30]、豆科^[31]和葫芦科^[32]作物，但人工接种条件下ToMMV还能够侵染5科33种植物^[13-18]。本研究为ToMMV侵染兰科植物及蝴蝶兰的首次发现，也是ToMMV在自然情况下侵染茄科、豆科、藜科和葫芦科植物以外的首次报道，表明ToMMV寄主范围在不断扩大。

有研究表明：当前全球不同ToMMV分离物的基因组序列差异性较小^[33-34]。本研究获得的ToMMV蝴蝶兰分离物与来自不同国家、不同寄主植物上的19条ToMMV完整cp基因序列的比对结果也表明ToMMV高度保守；但进一步的系统发育分析发现：ToMMV蝴蝶兰分离物与云南辣椒分离物和豌豆分离物亲缘关系最近，与国外分离物的亲缘关系较远，暗示侵染蝴蝶兰的ToMMV分离物可能来源于云南的辣椒或豌豆，或它们有共同的祖先。

从已有研究来看，单一的ToMMV侵染不会导致蝴蝶兰出现明显症状，但ToMMV与其他病毒的复合侵染可能会使蝴蝶兰出现严重的症状。携带ToMMV的无症状或轻微症状蝴蝶兰在市场上广泛交易，存在ToMMV通过蝴蝶兰大范围且远距离传播的潜在风险。目前，市场上尚无彻底清除病毒的药剂，需加强ToMMV在不同作物上的监测，防范ToMMV的进一步传播、扩散和蔓延。此外，选用健康或脱毒的组培苗，对提高蝴蝶兰产品质量和控制病毒传播尤为重要。

4.   结论

从云南昆明花卉市场收集的17份蝴蝶兰植株中检测到4种病毒：ORSV、CymMV、TSWV、ToMMV。其中，ORSV和CymMV仍然是危害蝴蝶兰的2种主要病毒，ToMMV为首次在蝴蝶兰及兰科植物中检出的病毒。ToMMV蝴蝶兰分离物的cp基因核苷酸序列与目前已知的其他ToMMV分离物高度保守，其中，与来自云南的ToMMV辣椒分离物和豌豆分离物的cp基因核苷酸序列一致性最高，亲缘关系最近。