鸡Ⅱ型角蛋白基因家族成员鉴定及其功能的生物信息学分析
深入探讨鸡(Gallus gallus)Ⅱ型角蛋白(keratin，KRT)家族基因的分子特征和功能。
利用生物信息学方法对鸡基因组中的Ⅱ型KRT家族成员进行鉴定，并比较分析其分子特征、染色体分布、种内和种间的共线性以及分子功能。
共鉴定出14个鸡Ⅱ型KRTs，它们成簇分布于第34号染色体。KRT8、LOC107055419和LOC768978基因各具有2个可变剪接异构体。基因间编码区的碱基组成相似，但序列差异较大。各基因转录区的结构、外显子和内含子数量及位置具有一定的可变性。共线性分析显示：在鸡物种内以及鸡与孔雀(Pavo muticus)间无基因的片段重复(无共线性)；鸡与火鸡(Meleagris gallopavo)之间存在2个基因的片段重复；鸡与野鸭(Anas platyrhynchos)、鸡与日本鹌鹑(Coturnix japonica)之间各存在1个基因的片段重复。鸡Ⅱ型KRTs均为不稳定的亲水性蛋白，氨基酸组成差异较大，等电点为5.10~8.89；其保守基序数量为9~10个，含有Filament、Filament superfamily和Keratin_2_head保守结构域；其结构以α-螺旋为主。相较于人(Homo sapiens)和鼠(Mus muscμlus)，鸡的Ⅱ型KRT基因家族成员较少。功能分析表明：该家族蛋白在细胞核和细胞质内参与角化和中间丝的形成等生物学路径，在表皮及其附属物结构的完整性方面发挥作用。
鸡Ⅱ型KRT基因家族序列一致性差异较大，但其编码蛋白结构相似。鸡Ⅱ型KRTs编码的蛋白质作为细胞骨架的主要组分，可能与鸡羽毛的生长发育和结构完整性密切相关。
Identification of Chicken Type II Keratin Gene Family Members and Bioinformatics Analysis of Their Functions
To further explore the molecular characterization and function of the chicken (Gallus gallus) type Ⅱ keratin gene (KRT) family.
The members of the type Ⅱ KRT family were identified from chicken genome data, and their molecular characteristics, chromosome distribution, collinearity within and among species, and molecular function were analyzed by bioinformatics method.
A total of 14 chicken type Ⅱ KRTs were identified, all of which were clustered on chromosome 34. The KRT8, LOC107055419, and LOC768978 genes each had two alternative splicing variants. The coding regions of the genes were similar in base composition but different in sequence. The structure of the transcriptional regions, including the number and position of exons and introns, varied among the genes. Collinearity showed that there were no gene fragmentduplications (no collinearity) within the chicken species or between G. gallus and Pavo muticus. However, there were two gene fragment duplications between G. gallus and Meleagris gallopavo; and there was one gene fragment duplication each between G. gallus and Anas platyrhynchos, and between G. gallus and Coturnix japonica, respectively. The chicken type Ⅱ KRTs were all unstable hydrophilic proteins, with highly diverse amino acid compositions and isoelectric points ranging from 5.10 to 8.89. The number of conserved motifs in chicken type Ⅱ KRTs ranged from 9 to 10, including the Filament, Filament superfamily, and Keratin_2_head conserved domains; and their structures were mainly composed of α-helix. Compared to Homo sapiens and Mus muscμlus, chicken had fewer members in the type Ⅱ KRT gene family. Functional analysis indicated that the proteins in this family were involved in biological pathways such as keratinization and intermediate filament formation in the nucleus and cytoplasm, playing a role in the structural integrity of the epidermis and its epidermal appendages.
The chicken type Ⅱ KRT gene family shows significant sequence diversity but encodes proteins with similar structures. As major components of the cytoskeleton, these proteins are likely closely related to the growth, development, and structural integrity of chicken feathers.
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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以呕吐、水样腹泻、脱水和生长缓慢为主要特征的急性、高度接触性传染病[1]。PEDV是有囊膜的单条正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，包括1个5'非编码区(untranslated region，UTR)、1个3'UTR以及7个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N)[2]。其中，ORF3蛋白基因长度为675 bp，是PEDV粒子中的非结构蛋白，分子质量为25.3 ku；它是PEDV基因组中唯一的辅助蛋白，也是病毒的通道蛋白，与病毒的毒力有关，能够影响病毒复制[3]。ORF3蛋白还可通过延长细胞周期的S期、抑制早期细胞凋亡和促进自噬来调节细胞周期进程，从而为病毒繁殖提供适当的环境[4-5]。近年来，随着毒株的遗传变异，ORF3基因出现突变、天然截短和翻译中断等现象，且不同毒株之间存在差异[6-7]。膜糖蛋白(membrane glycoproteins，M)基因长度为681 bp，可翻译226个氨基酸，分子质量为27~32 ku，其保守性和结构稳定性很高，常被用于设计引物以检测PEDV[8]。PEDV M蛋白是一种重要的结构蛋白，与病毒复制、感染和组装有关[9-10]。
为进一步了解PEDV在云南的流行及演变情况，本研究于2022—2023年，从云南多个疑似暴发PED的猪场采集病料样品125份，采用RT-PCR法检测样品中是否存在PEDV；对PEDV阳性样品进行测序分析，构建M和ORF3基因的遗传进化树，旨在了解病毒的流行和遗传进化情况，为该病的防控提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 病料收集与贮存
2022年8月—2023年7月，从云南省禄劝彝族苗族自治县(以下简称“禄劝县”)、永平县、凤庆县、大理市和曲靖市9个暴发仔猪腹泻病的猪场采集发病仔猪小肠组织样品、粪便或肛拭子共125份。取适量样品于5 mL无菌离心管中，将样品与无菌PBS溶液按1∶5 (V∶V)充分混匀后置于−80 ℃反复冻融3次，
12000 r/min离心10 min，取上清分装于新的离心管中，加入1%双抗，一部分用于提取RNA；另一部分冻存用于后续试验。1.2 主要试剂
TransZol UP RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Super HiFi PCR Mix (KT212)、DL2000 DNA Marker、DL3000 DNA Marker、核酸染料、cDNA 第1链合成预混试剂盒等购自北京天根生化有限公司。
1.3 引物合成及PCR扩增
根据表1合成引物，将样品提取RNA后反转录为cDNA，用针对猪传染性胃肠炎病毒(porcine infectious gastroenteritis virus，TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine delta coronavirus，PDCoV)和PEDV M基因的引物进行PCR扩增，取PCR产物7 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，符合预期大小的样品送至上海生工有限公司进行测序。确定为PEDV M阳性的样品，用针对PEDV ORF3基因的引物进行扩增并测序。
表 1 供试引物序列Table 1. Primer sequences for test引物名称
primer name引物序列 (5'→3')
primer sequence片段长度/bp
fragment length退火温度/ ℃
annealing temperature参考文献
referencesPEDV M F：AACGGTTTTATTCCCGTTGAT 663 55 [11] R：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATT TGEV F：TTACAAACTCGCTATCGCATGG 528 55 [11] R：TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC PoRV F：CCCCGGTATTGAATATACCACAGT 333 55 [11] R：TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT PEDV ORF3 F：TCCTAGACTTCAACCTTACG 833 55 [12] R：GGTGACAAGTGAAGCACAGA PDCoV F：TCGGGAGCTGACACTTCTATTA 564 49 [13] R：GGTCTGGTTAACGACCGTATTG 注：PEDV. 猪流行性腹泻病毒，TGEV. 猪传染性胃肠炎病毒，PoRV. 猪轮状病毒，PDCoV. 猪德尔塔病毒；下同。
Note: PEDV. porcine epidemic diarrhea virus, TGEV. porcine infectious gastroenteritis virus, PoRV. porcine rotavirus, PDCoV. porcine delta corona virus; the same as below.1.4 序列比对及分析
将测序结果与GenBank中的相关序列(表2)进行比对，并将比对正确的毒株按照采集地、样品类型、日期进行命名。采用DNAstar软件对测序结果进行拼接；采用生物学软件Megalign分析序列同源性，并对核苷酸和氨基酸序列突变点进行统计分析；采用MEGA 11构建遗传进化树。
表 2 PEDV参考毒株Table 2. References strains of PEDV序号
serial
number名称
name登录号
accession
No.分离国家及年代
separation of
countries and years1 VNJFP1013-1 KJ960178.1 越南，2013
Vietnam2 USA Minnesota271-2014 KR265813.1 美国，2014
United States3 USA Iowa16465 2013 KF452322.1 美国，2013
United States4 OH851 KJ399978.1 美国，2014
United States5 MEX1242014 KJ645700 美国，2014
United States6 LZC EF185992.1 中国，2006
China7 LC JX489155.1 中国，2011
China8 KNU- 1406 -1KM403155.1 韩国，2014
Korea9 JS2008 KC109141.1 中国，2012
China10 GD S07 MH726370.1 中国，2018
China11 GD-A JX112709 中国，2012
China12 CV777 AF353511.1 比利时，1988
Belgium13 CH-YNKM-8 2013 KF761675 中国，2013
China14 CH-S JN547228.1 中国，2011
China15 CHHB 2012 KC189944.1 中国，2011
China16 CH ZMD ZY11 KC196276.1 中国，2012
China17 AJ1102 JX188454.1 中国，2011
China18 DR13 JQ023162.1 韩国，2011
Korea19 SM98 GU937797.1 韩国，2010
Korea20 83P-5 AB618618.1 日本，2011
Japan2. 结果与分析
2.1 PEDV检测及M基因扩增
由图1和表3可知：在检测的125份样品中，检出49份PEDV阳性样品(663 bp)，阳性率为39.2%；PoRV阳性样品14份(333 bp)，阳性率为11.2%；PoRV与PEDV混合感染率为10.4% (13/125)，未检测出TGEV和PDCoV。对符合目的基因大小的PCR产物进行测序，结果与Genebank上的参考序列进行比对分析，比对正确的毒株分别为：YNLPF2-1、YNLPF2-8和YNLPF2-15 (罗平县肛拭子)；YNQJF4-1、YNQJF4-3、YNQJF4-6、YNQJF4-7和YNQJF4-9 (曲靖市粪样)；YNDLF6-1 (大理市粪样)；YNDLC7-6和YNDLC7-8 (大理市肠样)。
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图 1 PCR产物电泳结果注：M1. DL3000 Marker；M2. DL2000 Marker；N. 阴性对照；P. 阳性对照；1~6. 部分猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品；7~8. 猪轮状病毒(PoRV)阳性样品。Figure 1. Electrophoresis results of PCR productsNote: N. negative control; P. positive control; 1-6. part of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)-positive samples; 7-8. porcine rotavirus (PoRV)-positive samples.表 3 PCR检测结果Table 3. Detection results of PCR样品采集地
sample
collection site采集日期
(yyyy-mm-dd)
collection date样品数
number of
samples样品类型
sample type阳性数 number of positives PEDV PoRV TGEV PDCoV 永平县
Yongping County2022-08-28 12 粪样
fecal samples0 0 0 0 禄劝县
Luquan County2022-10-12 13 粪样
fecal samples0 0 0 0 永平县
Yongping County2022-11-07 10 粪样
fecal samples0 0 0 0 曲靖市
Qujing City2022-12-05 14 粪样
fecal samples0 0 0 0 凤庆县
Fengqing County2022-12-22 27 肛拭子
anorectal swabs3 0 0 0 罗平县
Luoping County2023-02-16 15 肛拭子
anorectal swabs12 3 0 0 曲靖市
Qujing City2023-04-06 10 粪样
fecal samples10 3 0 0 大理市
Dali City2023-06-06 14 粪样
fecal samples14 8 0 0 大理市
Dali City2023-07-03 10 小肠
small intestine10 0 0 0 合计 total 125 49 14 0 0 2.2 PEDV ORF3基因片段的扩增
PEDV M阳性样品的ORF3基因引物扩增和电泳检测结果显示：得到长833 bp的片段，符合预期目的(图2)。
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图 2 PEDV ORF3基因扩增电泳结果注：M. DL3000 Marker；N. 阴性对照；P. 阳性对照；1. PEDV阴性样品ORF3基因扩增；2~13. PEDV阳性样品ORF3基因扩增。Figure 2. Electrophoresis results of PEDV ORF3 gene amplificationNote: N. negative control; P. positive control; 1. ORF3 gene amplification of PEDV-negative sample; 2-13. ORF3 gene amplification of PEDV-positive samples.2.3 PEDV M基因和ORF3基因的生物信息学分析
2.3.1 PEDV M基因的遗传进化分析
PEDV M基因序列的进化树(图3)显示：10株云南流行毒株同属GⅡ型。其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株亲缘关系较近；其余8株与GD S07亲缘关系较近，与GⅠ型CV777、DR13、SM98等疫苗株的亲缘关系较远。同源性分析结果显示：云南流行株M基因的核苷酸同源性为96.9%~100.0%，与国内外参考流行株的核苷酸同源性为96.2%~99.8%，与经典疫苗株CV777和DR13的同源性分别为97.1%~98.1%和96.9%~97.9%，与美国代表毒株OH851的同源性为98.1%~99.5%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为97.6%~99.7%和97.4%~99.5%。10株M基因氨基酸序列与参考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的比对结果显示：云南流行株有6个氨基酸突变位点，分别是第24位(C→R)、第53位(F→S)、第56位(T→I)、第76位(I→T)、第162位(T→M)和第183位(Q→P)，未出现氨基酸插入及缺失现象。
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图 3 PEDV M基因的遗传进化树注：●为本研究PEDV阳性样品扩增的基因；下同。Figure 3. Genetic and phylogenetic tree of PEDV M geneNote: ● indicate the genes amplified from the PEDV-positive sample in this study; the same as below.2.3.2 PEDV ORF3基因遗传进化分析
PEDV ORF3基因序列进化树(图4)显示：10株云南流行毒株同属GⅡ型。其中，YNQJF 4-3和YNQJF 4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株以及越南株VN-JFP1013亲缘关系较近；其余8株与GD S07亲缘关系较近，与经典疫苗株CV777、DR13等亲缘关系较远。同源性分析结果显示：云南流行株ORF3基因的核苷酸同源性为95.6%~100.0%，与国内外参考流行株的核苷酸同源性为89.3%~99.6%，与经典疫苗株CV777和JS2008的同源性分别为96.3%~96.7%和89.3%~90.2%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为95.9%~98.8%和95.9%~99.1%。
2.3.3 PEDV ORF3蛋白氨基酸序列分析
将PEDV ORF3基因片段序列翻译为蛋白氨基酸序列，与经典疫苗株CV777、DR13和JS2008的ORF3蛋白氨基酸序列进行比对，结果显示：与CV777相比，10株毒株在第21位点(A→V)、第54位点(V→I)、第79位点(V→I)、第101位点(A→T)和第166位点(N→S)发生氨基酸突变；YNQJF4-3和YNQJF4-7在第168位点(D→N)、第25位点(D→L)、第70位点(I→V)和第107位点(C→F)发生氨基酸突变；YNDLC7-6、YNDLC7-8、YNDLF6-1、YNLPF2-1、YNLPF2-8、YNLPF2-15和YNQJF4-9在第182位点(H→Q)发生氨基酸突变；无氨基酸插入或缺失现象。与DR13和JS2008的ORF3蛋白氨基酸序列进行比对，结果显示：10株毒株均未出现氨基酸连续大片段缺失的现象。
3. 讨论
猪流行性腹泻于1971年在英国首次被报道，之后迅速在欧洲甚至亚洲蔓延，给世界养猪业造成巨大的经济损失[14-15]。由于PEDV毒株易发生变异，导致现有疫苗免疫效果不佳，因此，有必要通过流行病学调查监测新出现的流行株，从而及时研发针对性的疫苗用于有效防控[16-17]。本研究采集云南省部分地区9个猪场共125份小肠、粪便和肛拭子样品进行检测，结果显示：有49份PEDV阳性样品，14份PoRV阳性样品，PEDV与PoRV混合感染率为10.4%，未检测出TGEV和PDCoV。可见，PEDV仍是云南省新生仔猪肠道疾病的主要病原，迫切需要研制新型有效的疫苗来防治PEDV的变异情况[14]。
对PEDV M基因进行遗传进化分析及同源性分析，结果表明：10株云南流行毒株均属于GⅡ型，其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株亲缘关系较近，其余8株与GD S07亲缘关系较近，与GⅠ型CV777、DR13、SM98等疫苗株的亲缘关系较远，现有疫苗可能无法完全覆盖云南省流行的PEDV毒株，从而影响疫苗的免疫效果。10株云南流行株M序列的核苷酸同源性为96.9%~100.0%，表明这些毒株在遗传上具有较高的相似性；与国内外参考流行株的核苷酸同源性为96.2%~99.8%，与经典疫苗株CV777和DR13的同源性分别为97.1%~98.1%和96.9%~97.9%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为97.6%~99.7%和97.4%~99.5%，提示PEDV可能存在跨国流传的现象。10条云南流行株与参考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的M基因氨基酸序列有6个氨基酸突变位点，但未出现氨基酸插入及缺失现象，整体上M基因序列较保守，与已有研究结果[18-19]一致。尽管M基因序列整体上比较保守，但这些突变位点可能影响病毒的生物学特性或免疫逃避能力，仍然需要引起关注，可能在未来成为疫苗研发或抗病毒药物设计的潜在靶点。
10株云南流行株ORF3序列的核苷酸同源性为95.6%~100.0%，与国内外参考毒株的核苷酸同源性为89.3%~99.6%；氨基酸序列主要有5个氨基酸突变位点，无氨基酸插入或缺失现象。研究表明：ORF3基因是否发生17个氨基酸缺失是区别野生型和弱毒株的关键分子特征，且与病毒的毒力和致病性密切相关[20]。本研究中，PEDV 毒株的ORF3序列氨基酸未观察到疫苗株大片段缺失的特征，提示其为强毒株。
本研究揭示了云南省部分地区流行的PEDV遗传特征和流行状况，为了解PEDV的流行病学和致病机制提供了新视角。研究样本采自云南省部分地区的9个猪场，样本量相对有限且地域覆盖范围不够广泛，可能无法完全代表云南地区乃至全国的PEDV流行状况，未来的研究仍需进一步扩大样本量。此外，本研究主要关注了M基因和ORF3基因的遗传进化特征，而PEDV的其他基因片段也可能对病毒的生物学特性和致病机制有重要影响。因此，未来的研究需要综合考虑PEDV的全基因组特征，以更全面地理解其遗传多样性和致病机制。
4. 结论
云南流行的PEDV是以GⅡ型为主的强毒株，与中国其他地方流行的毒株亲缘关系密切，急需研制针对变异株的疫苗，降低其带来的经济损失。
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图 1 鸡Ⅱ型KRT家族成员基因结构
Figure 1. Structure of members of the chicken type Ⅱ KRT family genes
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图 2 鸡Ⅱ型KRT家族成员染色体定位
Figure 2. Chromosomal localization of members of the chicken type Ⅱ KRT family
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图 3 鸡Ⅱ型KRT家族成员共线性分析
Figure 3. Collinearity analysis among members of the chicken type Ⅱ KRT family
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图 4 鸡、火鸡、日本鹌鹑、孔雀和野鸭的Ⅱ型KRT家族成员共线性分析
Figure 4. Collinearity analysis of type Ⅱ KRT family members in Gallus gallus, Meleagris gallopavo, Coturnix japonica, Pavo muticus and Anas platyrhynchos
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图 5 鸡Ⅱ型KRT家族成员的基序模式、保守域和遗传关系
Figure 5. Motif patterns, conserved domains, and genetic relationships of chicken type II KRT family members
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图 6 鸡、人和鼠的Ⅱ型KRT基因家族发育树
Figure 6. Phylogenetic tree of type II KRT genes family in G. gallus, Homo sapiens and Mus muscμlus
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图 8 鸡Ⅱ型KRT家族成员蛋白质相互作用网络
Figure 8. Interaction network of proteins of chicken type II KRT family members
表 1 鸡Ⅱ型KRT家族基因编码区碱基组成
Table 1 Base composition in the coding region of type II KRT family genes
基因名称
gene nameA/% G/% T/% C/% A+T/% C+G/% 编码序列长度/bp
coding sequence lengthKRT3 22.68 37.18 19.11 21.03 41.78 58.22 2130 KRT5 23.33 35.72 16.72 24.22 40.06 59.94 1800 KRT7 24.61 31.37 17.78 26.23 42..39 57.61 1479 KRT6A 25.43 31.87 17.27 25.43 42.70 57.30 1569 KRT71 24.86 37.28 19.01 18.85 43.87 56.13 1899 KRT75 24.02 32.65 18.00 25.33 42.02 57.98 1611 KRT75L1 24.96 36.33 18.64 20.06 43.60 56.40 1899 KRT75L2 24.03 34.98 19.49 21.50 43.52 56.48 1698 KRT75L4 20.91 36.68 17.83 24.58 38.74 61.26 1851 KRT8.1 23.20 33.26 15.79 27.74 38.99 61.01 1431 KRT8.2 23.80 33.78 15.47 26.95 39.26 60.74 1332 LOC107055419.2 25.97 30.97 20.53 22.53 46.49 53.51 1398 LOC107055419.1 25.18 30.85 19.50 24.46 44.68 55.32 1815 LOC768978.1 23.88 33.50 19.72 22.91 43.60 56.40 1851 LOC768978.2 23.86 33.50 19.75 22.89 43.61 56.39 1848 LOC431300 29.44 30.67 20.36 19.54 49.80 50.20 1464 LOC112529929 23.53 34.42 17.60 24..44 41.14 58.86 1653 
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表 2 鸡Ⅱ型KRT家族基因核苷酸序列的一致性
Table 2 Nucleotide sequence consistency of type II KRT family genes
基因 gene 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 67.5 70.2 69.1 61.2 67.6 61.8 62.9 55.5 64.3 66.8 55.5 49.6 52.3 52.3 57.3 65.6 2 42.8 70.2 72.9 64.6 69.6 64.5 65.5 57.6 66.7 67.9 56.3 51.6 56.3 56.3 56.3 69.2 3 38.3 38.3 70.8 65.4 68.9 65.7 64.4 59.6 71.2 71.9 57.8 55.2 58.4 58.5 59.8 67.9 4 40.0 33.8 37.1 64.6 80.8 64.6 64.8 58.2 68.5 68.7 56.8 53.8 59.1 59.1 58.6 67.1 5 54.8 48.0 46.8 48.0 61.9 90.1 89.5 57.2 59.9 62.3 58.3 53.0 56.0 56.0 58.6 65.8 6 42.9 39.3 40.4 22.3 53.4 61.9 62.2 58.3 68.3 69.0 57.7 54.8 59.1 59.1 58.5 66.9 7 53.6 48.3 46.1 48.0 10.7 53.5 85.1 56.2 59.7 61.8 57.1 52.2 55.1 55.1 58.9 64.4 8 51.3 46.3 48.9 47.8 11.4 52.9 16.8 58.0 62.1 63.0 57.8 53.1 57.0 57.0 59.2 65.5 9 67.6 62.5 58.5 61.6 63.9 61.1 66.2 62.2 58.1 58.7 60.9 56.4 67.9 67.9 55.5 57.7 10 48.7 44.2 36.5 41.1 57.5 41.3 58.0 53.0 61.4 100.0 58.0 54.3 56.9 57.0 58.0 66.4 11 44.0 42.1 35.3 40.7 52.5 40.1 53.5 51.3 60.0 0.0 59.3 55.2 57.7 57.8 59.3 67.4 12 67.9 66.3 62.4 64.9 61.4 62.6 64.1 62.8 56.0 62.4 59.4 99.9 64.5 64.5 52.8 56.3 13 84.3 78.5 68.7 72.5 74.6 69.6 76.6 74.3 66.4 71.2 68.8 0.1 60.5 60.5 52.7 52.7 14 76.3 66.0 61.0 59.6 66.9 59.3 68.9 64.4 42.4 64.2 62.3 48.7 56.8 100.0 56.4 56.6 15 76.4 66.0 60.9 59.6 66.9 59.4 69.0 64.5 42.4 64.1 62.2 48.7 56.8 0.0 56.4 56.6 16 63.8 66.7 58.0 61.1 60.8 61.3 60.0 59.4 67.7 62.1 59.1 75.5 75.6 66.0 66.0 58.0 17 46.4 39.9 42.0 43.5 45.9 43.8 48.7 46.6 62.4 44.6 42.8 66.0 75.1 65.0 65.1 62.2 注：1~17分别表示KRT3、KRT5、KRT7、KRT6A、KRT71、KRT75、KRT75L1、KRT75L2、KRT75L4、KRT8.1、KRT8.2、LOC107055419.2、LOC107055419.1、LOC768978.1、LOC768978.2、LOC431300和LOC112529929基因。
Note: 1-17 indicate KRT3, KRT5, KRT7, KRT6A, KRT71, KRT75, KRT75L1, KRT75L2, KRT75L4, KRT8.1, KRT8.2, LOC107055419.2, LOC107055419.1, LOC768978.1, LOC768978.2, LOC431300 and LOC112529929 genes, respectively.
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表 3 鸡Ⅱ型KRT家族蛋白的氨基酸组成
Table 3 Amino acid composition of the chicken type II KRT family
% 氨基酸
amino acid1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 丙氨酸
alanine6.60 6.80 8.70 8.40 4.30 9.70 4.10 5.00 7.10 7.40 7.40 7.10 7.50 6.20 6.20 4.30 6.70 精氨酸
arginine4.40 6.30 6.90 7.10 7.00 6.20 6.30 8.00 7.60 7.80 7.20 7.70 7.90 6.80 6.80 8.60 4.90 天冬酰胺
asparagine4.20 3.80 5.10 5.40 3.80 3.20 4.00 3.90 3.20 3.60 3.80 3.40 3.00 4.70 4.70 4.10 3.60 天冬氨酸
aspartic acid3.20 3.70 4.70 4.20 2.50 3.70 2.80 3.00 4.10 4.40 4.70 4.30 3.50 4.50 4.60 5.50 4.40 半胱氨酸
cysteine0.10 0.50 0.00 1.30 1.90 2.10 1.30 2.30 5.70 0.20 0.20 3.40 4.80 6.00 6.00 0.60 2.50 谷氨酰胺
glutamine3.70 4.00 4.70 5.00 5.10 6.00 6.20 5.70 5.20 5.70 6.10 6.50 5.80 5.50 5.50 8.80 4.90 谷氨酸
glutamic acid6.20 7.20 8.90 8.00 7.80 8.40 7.00 8.50 7.60 10.90 11.70 9.50 7.60 8.00 8.00 10.70 7.80 甘氨酸
glycine26.80 18.70 9.10 10.50 23.70 11.60 23.10 15.80 13.00 6.50 6.80 5.60 7.60 9.30 9.30 10.30 14.40 组氨酸
histidine0.10 0.50 0.20 0.40 0.80 0.60 0.60 0.70 0.50 0.60 0.70 2.20 2.50 0.60 0.70 2.10 0.50 异亮氨酸
isoleucine3.40 3.70 4.70 4.80 4.90 5.20 4.40 5.30 3.90 4.80 5.00 3.20 3.00 4.40 4.40 4.10 3.80 亮氨酸
leucine10.70 8.80 9.80 9.20 6.30 8.60 6.30 7.40 9.40 11.10 12.00 12.30 9.90 8.40 8.60 9.20 9.80 赖氨酸
lysine5.10 5.00 6.30 5.90 3.80 5.20 3.80 4.40 4.50 5.90 6.10 7.10 6.00 6.30 6.30 4.30 7.10 蛋氨酸
methionine1.70 3.20 2.40 2.10 4.10 1.90 4.60 1.80 1.10 2.30 2.30 2.60 2.00 1.30 1.30 3.10 1.30 苯丙氨酸
phenylalanine3.20 3.00 2.80 3.40 3.00 3.70 3.60 2.80 2.60 2.70 2.50 2.80 2.30 3.10 3.10 3.30 4.40 脯氨酸
proline1.60 1.30 1.00 1.50 1.10 1.50 1.40 1.80 1.80 1.70 1.40 1.50 3.00 3.10 3.10 1.20 1.50 丝氨酸
serine9.90 11.00 10.80 9.80 9.20 11.00 9.50 9.20 8.10 9.50 8.10 9.00 11.30 7.10 7.00 7.40 9.80 苏氨酸
threonine3.00 3.30 4.30 4.40 2.50 4.10 2.70 3.90 3.20 6.30 5.90 3.90 5.00 2.60 2.60 2.50 4.40 色氨酸
tryptophan0.30 0.30 0.40 0.40 0.30 0.40 0.30 0.40 0.20 0.40 0.50 1.30 1.20 0.30 0.30 0.60 0.40 酪氨酸
tyrosine2.50 3.00 2.60 3.30 3.20 2.80 3.30 3.20 2.60 2.50 2.70 1.90 1.70 2.90 2.90 4.90 2.50 缬氨酸
valine3.20 5.70 6.50 4.80 4.70 4.30 4.60 7.10 8.40 5.70 5.00 4.70 4.60 8.80 8.60 4.30 5.30 注：1~17分别表示KRT3、KRT5、KRT7、KRT6A、KRT71、KRT75、KRT75L1、KRT75L2、KRT75L4、KRT8.1、KRT8.2、LOC107055419.2、LOC107055419.1、LOC768978.1、LOC768978.2、LOC431300和LOC112529929基因编码的蛋白质。
Note: 1-17 indicate the protein coded by KRT3, KRT5, KRT7, KRT6A, KRT71, KRT75, KRT75L1, KRT75L2, KRT75L4, KRT8.1, KRT8.2, LOC107055419.2, LOC107055419.1, LOC768978.1, LOC768978.2, LOC431300 and LOC112529929 genes, respectively.
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表 4 鸡Ⅱ型KRT基因家族成员编码蛋白的理化特征
Table 4 Physicochemical characteristics of proteins coded by chicken type II KRT gene family members
基因名称
gene name蛋白质ID
protein ID氨基酸数量/aa
number of
amino acid相对分子质量/ku
relative molecular weight等电点
isoelectric
point不稳定系数
coefficient of instability疏水性平均值
mean hydrophobic value亚细胞定位
subcellular localization跨膜次数
transmembrane frequencyKRT3 XP_040510846.1 709 70.13 6.76 49.09 −0.332 细胞质
cytoplasm0 KRT5 NP_001001195.1 599 62.46 8.46 49.43 −0.381 细胞质
cytoplasm0 KRT7 NP_ 990263.2 492 53.75 5.97 50.94 −0.451 细胞核
nucleus0 KRT6A NP_001001313.3 522 57.03 8.48 47.25 −0.488 细胞核
nucleus1 KRT71 XP_001232027.5 632 65.57 8.15 60.55 −0.457 细胞质
cytoplasm0 KRT75 NP_001001314.3 536 57.56 5.80 58.12 −0.362 细胞核
nucleus1 KRT75L1 XP_015155860.1 632 65.87 7.99 61.77 −0.480 细胞质
cytoplasm0 KRT75L2 XP_ 428850.2 565 60.79 8.45 55.39 −0.449 细胞质
cytoplasm0 KRT75L4 XP_015155859.1 616 65.94 7.77 46.20 −0.192 细胞质
cytoplasm0 KRT8.1 XP_015128103.2 476 53.38 5.44 51.43 −0.532 细胞核
nucleus0 KRT8.2 XP_040510849.1 443 49.85 5.10 48.14 −0.564 细胞核
nucleus0 LOC107055419.2 XP_040510847.1 465 52.93 8.38 56.29 −0.554 细胞核
nucleus0 LOC107055419.1 XP_025001374.2 604 66.77 8.89 54.63 −0.537 细胞核
nucleus0 LOC768978.1 XP_015155861.2 616 67.85 7.90 51.35 −0.314 细胞质
cytoplasm0 LOC768978.2 XP_015155862.2 615 67.78 7.90 51.42 −0.314 细胞质
cytoplasm0 LOC431300 XP_046760990.1 487 56.07 5.31 58.18 −0.889 细胞核
nucleus0 LOC112529929 XP_001231586.3 550 58.66 6.45 46.65 −0.369 细胞质
cytoplasm0
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表 5 鸡Ⅱ型KRTs的二级结构组成
Table 5 Composition of secondary structure of chicken type II KRTs
% 蛋白质ID
protein IDα-螺旋
α-helix延伸链
extended strandβ-转角
β-turn无规则卷曲
random coilXP_040510846.1 40.34 18.90 10.58 30.18 NP_001001195.1 49.42 16.36 6.84 27.38 NP_ 990263.2 58.54 14.84 3.86 22.76 NP_001001313.3 56.70 15.52 4.21 23.56 XP_001232027.5 48.10 11.55 8.39 31.96 NP_001001314.3 54.66 9.89 1.87 33.58 XP_015155860.1 46.68 12.18 7.28 33.86 XP_ 428850.2 53.27 14.16 6.37 26.19 XP_015155859.1 54.06 14.45 8.88 22.73 XP_015128103.2 58.40 7.56 1.89 32.14 XP_040510849.1 68.62 4.74 1.35 25.28 XP_040510847.1 64.52 6.45 2.58 26.45 XP_025001374.2 51.99 7.95 2.65 37.42 XP_015155861.2 50.97 12.50 4.38 32.14 XP_015155862.2 52.03 11.71 3.25 33.01 XP_046760990.1 61.40 8.42 5.34 24.85 XP_001231586.3 53.82 11.45 5.64 29.09
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表 6 鸡Ⅱ型KRTs的三维结构与模板的一致性和覆盖率
Table 6 Consistency and coverage rate of the three-dimensional structure of chicken type IIKRTs with the template
% 蛋白质ID
protein ID模版
template一致性
consistency覆盖率
coverage rateXP_040510846.1 A0A7K8E7F7.1.A 90.24 98 NP_001001195.1 A0A7L4H5N3.1.A 96.13 99 NP_ 990263.2 A0A226MN76.1.A 96.95 100 NP_001001313.3 A0A7K5XDH8.1.A 92.34 100 XP_001232027.5 A0A6J3EBP9.1.A 91.69 99 NP_001001314.3 A0A0A0A5I2.1.A 88.06 100 XP_015155860.1 A0A6J3EBP9.1.A 96.52 100 XP_ 428850.2 A0A091VPT2.1.A 94.47 99 XP_015155859.1 A0A2P4TER8.1.A 97.73 100 XP_015128103.2 A0A674HK87.1.A 77.04 98 XP_040510849.1 A0A674HK87.1.A 75.91 99 XP_040510847.1 A0A7K5NIG5.1.A 77.70 92 XP_025001374.2 A0A7K5NIG5.1.A 77.70 71 XP_015155861.2 A0A7K5NIG5.1.A 98.38 100 XP_015155862.2 A0A7K5NIG5.1.A 98.21 100 XP_046760990.1 A0A7K5NIG5.1.A 90.72 100 XP_001231586.3 A0A1D5PQ92.1.A 99.82 100
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表 7 鸡Ⅱ型KRT家族成员的GO分析
Table 7 GO analysis of chicken type II KRT family members
蛋白名称
protein name生物学过程
biological process细胞成分
cell component分子功能
molecular functionKRT3 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT5 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分；皮肤附属物结构成分
structural constituent of epidermis; structural constituent of cutaneous appendageKRT7 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT6A 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT71 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT75 凋亡过程 ；角化；中间长丝组织 apoptotic process; keratinization; intermediate filament organization 细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament结构分子活性；表皮结构成分
structural molecule activity; structural constituent of epidermisKRT75L1 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT75L2 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT75L4 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；中间丝；角蛋白丝
extracellular space; intermediate filament; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisKRT8 — 角蛋白丝 keratin filament — LOC107055419 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；中间丝；角蛋白丝
extracellular space; intermediate filament; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisLOC768978 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisLOC431300 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；中间丝；角蛋白丝
extracellular space; intermediate filament; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermisLOC112529929 角化；中间长丝组织
keratinization; intermediate filament organization细胞外间隙；角蛋白丝
extracellular space; keratin filament表皮结构成分
structural constituent of epidermis
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