烟草(Nicotiana tabacum)是中国重要的经济作物，不仅可以带来大量税收，还可以使种植地烟农实现经济增收^[1]。但烟叶生产一直受到病毒病困扰，一旦感染病毒，烟草经济价值将大幅下降，给国家和烟农带来严重的经济损失^[2]。病毒病主要通过刺吸式口器昆虫刺吸烟草叶片汁液传播^[3]，其中烟粉虱(Bemisia tabaci)是主要的传播媒介^[4]。烟粉虱隶属于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，最初发现于中东、北非和地中海等热带和亚热带地区^[5]。自20世纪80年代以来，烟粉虱通过进出口花卉苗木在世界各地迅速传播，目前已在90多个国家和地区广泛暴发^[6]。1949年，中国首次发现烟粉虱^[7]，但当时仅为零星现象，并未造成广泛危害；直到20世纪90年代，烟粉虱传播加剧，才引起广泛关注^[8]。目前，烟粉虱的防治主要依赖化学防治^[9]，但由于药剂的不合理使用以及烟粉虱易产生抗药性，其危害愈发严重^[10-11]。同时，随着“绿色烟叶”“有机烟叶”等概念的兴起，化学药剂的使用将受到越来越严格的限制^[12]。

植物可通过产生次生代谢物获得抗虫性，如番茄通过分泌酚糖抵抗烟粉虱^[13]。酚糖是一类重要的抗虫次生代谢产物，能够抑制昆虫的生长发育，但酚糖对植物有一定的毒性，因此，在害虫离去后，植物需要迅速降解多余的酚糖。植物利用酚糖丙二酰基转移酶(phenolic glucoside malonyltransferase，PMaT)催化酚糖的丙二酰基化反应，实现解毒作用。XIA等^[13]研究表明：烟粉虱的BtPMaT1基因与植物的PMaT是同源基因，且烟粉虱BtPMaT1基因的同源基因仅存在于植物和少量真菌中，说明烟粉虱从植物中获得这一基因，体现了生物界普遍存在的水平基因转移现象。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，其作用是沉默相关基因。RNAi具有高度特异性、高效性、高稳定性等突出特点，已被广泛应用于作物基因功能研究、抗病、抗虫害、提高作物品质等领域^[14-15]。XIA等^[13]利用RNA干扰烟粉虱的BtPMaT1基因，并成功构建了转基因番茄品系，使烟粉虱对酚糖敏感，烟粉虱取食转基因番茄7 d后，死亡率为93.35%。烟草和番茄均为茄科作物，因此推测烟田的烟粉虱亦能通过BtPMaT1基因降解烟草产生的酚糖，从而避免对烟草的毒害。为了验证这一假设，本研究构建了BtPMaT1基因的RNAi载体并转化烟草，随后检测转化RNAi烟草对烟粉虱的抗性，以期为培育抗烟粉虱的烟草品种奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

2023年在云南省玉溪市红塔区(102°21′32″E，24°12′22″N，海拔1 650 m)进行试验，供试烟草材料为雪茄烟品种云雪6号，由玉溪中烟种子有限责任公司提供。烟粉虱材料采自云南11个不同烟区的烟田，包括保山市和玉溪市采样点各2个、昆明市采样点1个、临沧市和文山壮族苗族自治州采样点各3个。

1.2   试验设计

收集烟草上的烟粉虱，提取其总RNA并克隆烟粉虱BtPMaT1基因，获得该基因序列。与烟草中相应基因进行比对，在基因保守区设计RNAi靶标位点，构建RNAi载体，转化至云雪6号烟草，获得转基因烟草植株。选取团棵期转基因烟草和云雪6号烟草作为材料，接种烟粉虱，观测烟株上的烟粉虱数量，统计虫量比，评价RNAi沉默BtPMaT1基因烟草对烟粉虱的抗性。

1.3   试验方法

1.3.1   烟粉虱BtPMaT1基因序列克隆

采用TRIzol Reagent (Invitrogen, Cat 15596026CN)提取烟粉虱总RNA，采用Qiagen RNeasy迷你植物试剂盒(Cat 74104)提取烟草的RNA。在冰上配置10 μL的反转录反应体系，包括总RNA 2 μg、50 μmol/L oligo (dT) 1 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL以及适量经DEPC处理的水。将该体系在65 ℃温浴5 min后，迅速置于冰上1 min。向上述体系中加入10× RT Buffer 2 μL、25 mmol/L MgCl₂ 4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL、40 U/μL RNaseOUT 1 μL和200 U/μL SuperScript Ⅲ RT 1 μL，在50 ℃下保持50 min，并在85 ℃下使酶失活，在冰上冷却终止反应，即获得cDNA。采用Primer 5软件设计特异引物(F：ATGTCGATATCGAGCTCAGTGGCCGTACTAAACG，R：TCAGCAGCTCCGCTTTTCCAATAACTTAAGATCATC)，以NEB Q5高保真酶为聚合酶，以cDNA为模板，用设计好的引物进行PCR扩增，以获得11个烟田烟粉虱的BtPMaT1基因片段。PCR扩增体系为50.0 μL，包括：模版DNA 1.0 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，5×Buffer 10.0 μL，10 mmol/L Dntp混合物1.0 μL，Q5 DNA聚合酶 0.5 μL，ddH₂O 35.5 μL。PCR扩增条件为：① 98 ℃ 5 min，② 98 ℃ 30 s，③ 58 ℃ 30 s，④ 72 ℃ 30 s，步骤②至④共循环35次，⑤ 72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

使用琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，再使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收产物。回收后的产物通过ClonExpress^®Ⅱ快速克隆试剂盒连接到原核表达载体pET-32a上，并转化到JM109感受态细胞中，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，最后提取质粒，送至测序公司分析测序结果。

1.3.2   基因序列比对、系统发生树构建以及RNAi载体的构建与烟草转化

将获得的烟粉虱BtPMaT1基因序列与文献[13]中公开的烟粉虱BtPMaT1基因序列、NCBI数据库中的烟草NtPMaT1基因序列进行比对(ClustalW)，并构建系统发育树。基于BtPMaT1基因的测序结果，从所有烟粉虱序列中挑选出相似度最高且最为保守的区间，设计BtPMaT1基因RNAi沉默的靶标位点，尽可能多地同时沉默不同类型烟粉虱，并保证不沉默烟草中的NtPMaT1基因，即不影响烟草NtPMaT1基因的酚糖解毒功能。

针对筛选出的RNAi靶标片段序列，设计相应的RNAi引物；利用内含子分隔靶标位点的序列，通过BP重组反应，将该片段构建到gateway中间载体中，再分别以正向和反向构建入植物RNAi表达载体pHELLSGATE12 (由中国科学院昆明植物研究所吴建强课题组提供)中(图1)^[16]。对获得的pHELLSGATE12阳性载体，分别通过XbaⅠ和XhoⅠ酶切进行验证。进行遗传转化后，检测转基因植株中是否含有pHELLSGATE12载体上的NPTⅡ抗性基因，从而获得具有烟粉虱BtPMaT1基因RNAi载体的阳性烟株。

图  1  pHELLSGATE12载体(a)及其构建和RNAi流程(b)

Figure  1.  pHELLSGATE12 vector (a) and vector construction and RNAi procedure (b)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

1.3.3   RNAi烟草创制

采用农杆菌介导的叶盘法，将含有RNAi载体(pHELLSGATE12)的农杆菌菌株进行活化培养。在LB培养基中添加适量卡那霉素，37 ℃条件下培养过夜，待菌液OD₆₀₀值为0.6~0.8。选取健康烟草叶片，先用70%乙醇消毒处理30 s，再用无菌水冲洗3次。切取直径5~7 mm的叶片圆盘，注意保持边缘完整，避免机械损伤。将菌液稀释到OD₆₀₀值为0.2~0.5，加入100 μmol/L乙酰丁香酮诱导农杆菌的感染能力。将叶盘浸入菌液中，轻轻振荡10~15 min，使菌液充分接触叶片表面；取出叶盘，用无菌滤纸吸去多余菌液，平铺于无选择性诱导MS培养基上，于25 ℃暗培养2~3 d，促进农杆菌侵染。将侵染后的叶盘转移至含有50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中，于25 ℃、光照16 h/黑暗8 h条件下培养3~4周，观察叶盘是否形成愈伤组织和芽点，若形成芽点，说明转基因成功。将长出的芽分离，转移至含卡那霉素的增殖培养基培养2~3周。挑选健康芽转移至不含抗生素的生根培养基中，待其生根后移栽到土壤中继续培养。提取烟草DNA，通过PCR检测是否含有pHELLSGATE12载体上的NPTⅡ抗性基因，最终筛选得到具有烟粉虱BtPMaT1基因RNAi载体的阳性转基因烟株。

1.3.4   烟草农艺性状测量

于烟草团棵期测量农艺性状。使用钢卷尺测量从烟草基部土壤表面至植株顶端的高度，即为株高；有效叶数为除去子叶和枯叶的叶片数量；最大叶长、最大叶宽为中部叶最大叶片的长和宽；最大茎围为烟草茎高约1/3处的圆周长；节距为烟草株高1/3处上下各3个叶位、共计6个叶位节距的平均值。

1.3.5   RNAi烟草植株对烟粉虱的抗性评估

在日光温室中培养转基因烟草至团棵期，选取10株长势一致的转基因烟草，再选取10株生长相近的非转基因云雪6号烟草作为对照，分别放入10个养虫笼中，每笼放置2株(转基因和非转基因烟草各1株)，每株接种30头烟粉虱。在接种后的7、14、21、28和35 d，统计烟粉虱的活虫数，并按照公式计算虫量比(r)：r=某一烟草品种总虫数/全部烟草品种的平均虫数，其中，总虫数包括虫卵在内的所有虫龄段烟粉虱。根据赵文娟等^[17]对抗虫性的分级标准，r≥1.00为高感；0.60≤r<1.00为敏感；0.40≤r<0.60为中抗；0.19≤r<0.40为抗性；0≤r<0.19为高抗。

1.4   数据处理与统计分析

使用MEGA 7.0.26进行序列比对并构建系统发育树。其他数据使用Excel 2020初步处理后，通过SPSS 22.0进行t检验和作图。试验数据以“平均值±标准差”表示。

2.   结果与分析

2.1   烟粉虱BtPMaT1基因序列

琼脂糖凝胶电泳结果显示：烟粉虱BtPMaT1片段约为1 500 bp，与预期一致。对每条序列进行测序，结果表明：11个烟田的烟粉虱BtPMaT1基因序列各不相同，呈多样性和不同程度的特异性，即不同烟区的烟粉虱BtPMaT1基因存在不同程度的变异。

2.2   烟粉虱BtPMaT1基因序列比对及系统发育树分析结果

进一步构建的系统发生树(图2)显示：1、3、4、5、6、7、8、9这8个区域的烟粉虱同源性较近，可聚为一类；而2、10和11这3个区域的烟粉虱同源性较远，各自为一类，因此，共聚为4类。此外，与文献[13]中的烟粉虱BtPMaT1基因序列及NCBI数据库中的烟草NtPMaT1基因序列比对结果显示：云南11个烟田的烟粉虱BtPMaT1基因与文献中烟粉虱和烟草的同源基因关系较远，这可能是由于云南烟田的烟粉虱BtPMaT1基因来源于其他植物，这一差异为后续RNAi靶标位点的设计提供了便利。

图  2  云南11个烟田烟粉虱与文献中烟粉虱BtPMaT1基因及烟草中同源基因聚类分析结果

Figure  2.  Clustering analysis results of the BtPMaT1 gene in the Bemisia tabaci from 11 tobacco fields of Yunnan and from the literature and homologous genes in tobacco

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   烟粉虱BtPMaT1基因RNAi靶标片段的筛选结果

序列比对发现：11个烟田的烟粉虱BtPMaT1基因在530~970位置上高度相似(图3a)。进一步选取LOC_1区域，并将其与文献[13]中的烟粉虱BtPMaT1基因以及烟草NtPMaT1基因进行了双序列比对，结果(图3b~c)显示：连续20~23 nt的序列在烟粉虱BtPMaT1基因和烟草NtPMaT1基因之间无法匹配，表明沉默该靶标片段不影响烟草的酚糖解毒功能。因此，该区域为RNAi靶标片段的最佳选择。

图  3  RNAi靶标片段的确定

注：a) 11个烟田的烟粉虱BtPMaT1基因在530~970位置序列的保守性分析；b) 选取的RNAi干扰片段序列与烟草中NtPMaT1序列比对；c) 选取的RNAi干扰片段序列与文献中的烟粉虱序列比对。

Figure  3.  Determination of RNAi target fragments

Note: a) conserved analysis of BtPMaT1 gene at 530-970 locations in the B. tabaci from 11 tobacco fields; b) the selected RNAi interference fragment sequence was compared with the NtPMaT1 sequence in tobacco; c) the selected RNAi interference fragment sequences were compared with the B. tabaci sequences in the literature.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   烟粉虱BtPMaT1基因RNAi载体的构建与烟草转化

针对筛选出的RNAi靶标片段序列，设计了相应的RNAi引物(F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAAACAGACCTCCAGCAATTGC；R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGGTGGGTCGTCTCCATGT)。经PCR扩增，获得约400 bp的片段，与预期一致。烟粉虱BtPMaT1基因RNAi载体验证结果表明载体构建成功(图4)，可用于烟草转化。

图  4  烟粉虱BtPMaT1基因RNAi载体验证

Figure  4.  Validation of BtPMaT1 gene RNAi vector of B. tabaci

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   RNAi烟草植株对烟粉虱的抗性

由表1可知：RNAi烟草的农艺性状与对照烟草无明显差异。由图5和表2可知：接种14~35 d，转基因烟草的虫量极显著低于对照烟草，对照组的抗虫性在试验期均为高感，RNAi烟草的抗性随着试验时间的延长而增强，14 d时为中抗，从21 d起达到抗性。在试验35 d时，转基因烟草上的活虫数仅约为对照烟草的1/8。

表  1  RNAi烟草与对照烟草的农艺性状

Table  1.  Agronomic characters on the RNAi tobacco and the control tobacco

处理 treatments	株高/cm plant height	有效叶数 number of effective leaves	最大叶长/cm maximum leaf length	最大叶宽/cm maximum leaf width	最大茎围/cm maximum stem girth	节距/cm pitch
对照组 control group	37.60±0.34	14.60±0.49	17.72±0.27	13.06±0.19	2.60±0.06	2.46±0.05
RNAi组 RNAi group	37.74±0.41	14.60±0.49	17.66±0.27	13.08±0.15	2.56±0.10	2.51±0.07

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  5  RNAi烟草的抗烟粉虱效果

注：a) RNAi烟草(RNAi)和对照烟草(control)的活虫数，“**”表示同一时间点差异极显著 (P<0.01)；b) 接种后第28天的RNAi烟草(RNAi)和对照烟草(control)。

Figure  5.  Anti-B. tabaci effect of the RNAi tobacco

Note: a) number of live B. tabaci on RNAi tobacco and control tobacco, “**” indicates extremely significant differences at the same time (P<0.01); b) the RNAi tobacco and control tobacco after inoculated B. tabaci 28 days.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  2  RNAi烟草与对照烟草上烟粉虱虫量比

Table  2.  Insect count ratio of the B. tabaci on the RNAi tobacco and the control tobacco

处理 treatments	0 d	7 d	14 d	21 d	28 d	35 d
对照组 control group	1.00	1.00±0.01	1.44±0.05	1.63±0.07	1.72±0.07	1.76±0.10
RNAi组 RNAi group	1.00	0.99±0.05	0.56±0.08**	0.37±0.09**	0.28±0.03**	0.24±0.09**
注：“**”表示处理间差异极显著 (P<0.01)。 Note: “**” indicates extremely significant differences between treatments (P<0.01).

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

3.1   云南烟田烟粉虱的危害及特异性

烟粉虱具有喜温、喜湿、喜光等生活习性^[18]，其对烟草的危害主要体现在刺吸烟叶汁液，导致植株生长衰弱，并传播如烟草曲叶病、曲茎病等病毒病^[19]。云南地区气候温暖、湿润且日照时间长，是烟草的主要产区，也是烟粉虱危害的重点区域，特别是在湿热的雪茄烟、晾晒烟和香料烟主产区，烟粉虱危害更为严重^[20]。由于烟粉虱具有多样性、易产生抗药性等特点，防治难度逐年增加。本研究供试烟粉虱采自云南的主要烟叶产区，具有代表性。然而，云南烟田的烟粉虱与其他地区或作物上的烟粉虱基因型存在差异。烟粉虱基因型多样性的原因主要包括以下几个方面：(1) 物种复合体：作为遗传多样性丰富的物种复合体，烟粉虱包含了多个形态上难以区分、但遗传组成有显著差异的隐种^[21-23]；(2) 生物型的存在：烟粉虱由多个具有遗传分化的生物型组成^[24]；(3) 地理种群的分化：不同地理种群之间的烟粉虱也表现出遗传多样性^[25]；(4) 水平基因转移：烟粉虱通过水平基因转移获得新的功能基因，如植物源的BtFAD2-9基因，有助于烟粉虱自主合成PUFA和PGE2，从而增强其生殖能力^[26]，这使得烟粉虱能适应不同的环境，进一步增加了其基因型的多样性^[27]；(5) 次生共生体的影响：烟粉虱及其次级寄生虫种群中的次生内共生菌也表现出基因型的多样性^[28]。这些因素共同作用，使云南烟田的烟粉虱BtPMaT1基因序列存在较大的变异。

3.2   RNAi技术在植物抗虫领域的研究应用

RNAi技术在植物抗虫领域具有巨大的潜力和广阔的应用前景。该技术通过表达双链RNA (dsRNA)，靶向并抑制害虫的特定基因表达，从而达到抗虫的目的。RNAi技术依赖于核苷酸互补配对的方式，将特定的dsRNA引入害虫体内，导致其靶基因沉默，从而阻碍害虫的正常生长、发育和繁殖，最终导致害虫死亡^[29]。这一策略具有高度的靶向性和特异性，在防治害虫方面具有独特优势。尽管RNAi技术在抗虫领域展现了巨大潜力，但传统的细胞核介导的RNAi技术在实际应用中仍面临一些挑战。如：dsRNA在植物细胞中的表达水平通常较低，且长链dsRNA易被植物自身的Dicer酶切割降解，导致其生物活性和稳定性受限^[29-30]，限制了RNAi的效果及其在植物抗虫中的应用。为解决这些问题，研究人员提出了质体介导的RNAi技术，这一方法有效地提高了抗虫效率。质体是植物细胞中重要的细胞器，具有独特的结构和功能，能够有效积累dsRNA并避免其降解。因此，通过质体介导的RNAi技术，植物可以在较低的表达水平下保持较高的RNAi活性，从而提高抗虫效果和稳定性^[31]。

此外，Bt毒素与RNAi技术的联合应用是一种前景广阔的综合防控策略，它不仅可以增强植物对害虫的防控效果，还能延缓害虫对Bt蛋白的抗性进化。通过将RNAi技术与Bt毒素结合，植物能够利用RNAi的序列特异性和种属特异性，精确地靶向特定的害虫种类进行有效防治，从而降低害虫的适应性，提高防治的持久性和效果^[32]。但是，RNAi抗虫技术在商业化和实际应用中仍面临诸多挑战。首先，如何高效地在植物体内产生足够多的稳定dsRNA，且确保其能够被害虫有效摄取并传递到靶基因，是目前要解决的关键问题。研究表明：dsRNA需要通过害虫的摄食或其他途径进入体内才能发挥作用^{[30, 33]}，因此，如何优化dsRNA的递送方式，确保其在害虫体内的稳定性，是需要进一步解决的技术难题。此外，外源dsRNA的安全性和生物安全性评估也是RNAi技术商业化应用中不可忽视的重点问题。虽然RNAi技术对非靶标生物的影响较小，但仍需进行全面的生态风险评估，以确保其不会对环境和其他物种产生不良影响。综上所述，RNAi介导的植物抗虫技术具有巨大的应用潜力，通过不断优化技术和解决当前的问题，RNAi有望成为一种既安全又高效的害虫管理工具。这一技术不仅能减少对化学农药的依赖，还符合可持续农业的环保要求，推动农业生产向更加绿色、环保的方向发展。

3.3   烟田烟粉虱防治措施

烟粉虱是烟草种植中严重的害虫，防治措施通常包括生物防治、化学防治、物理防治、农业防治等多种方法。烟粉虱种群多样、适应性极强，单一的防治手段难以有效控制其危害。因此，综合应用多种防治策略是最佳的途径。在传统的防治手段中，化学农药的使用虽能有效减轻烟粉虱的危害，但随着时间的推移，烟粉虱对化学农药的抗药性逐渐增强，防治效果逐渐下降。烟草基因工程育种手段旨在培育抗烟粉虱的烟草新品系，但由于烟草天然抗性基因匮乏，这一途径的应用受到了一定限制^[34]。因此，本研究采用RNAi技术，沉默烟粉虱BtPMaT1基因的表达，烟粉虱在取食转基因烟草后，失去了对烟草中酚糖类有毒物质的解毒功能，从而有效控制了烟粉虱繁殖，提升了烟草的抗虫性。与传统的烟粉虱防治方法相比，RNAi技术在防治烟粉虱方面具有以下优势。(1) 高特异性。RNAi技术能够精确靶向特定基因，选择性地沉默烟粉虱体内的关键基因，从而减少对非靶标生物(如益虫、授粉昆虫或其他有益生物)的影响，这极大地降低了对生态系统中其他生物的危害风险^[35-36]。(2) 降低抗药性风险。与传统的化学农药不同，RNAi技术通过基因沉默机制抑制目标昆虫的生理过程，而非通过化学毒素直接杀死昆虫。RNAi可以靶向不同的基因，从而降低害虫产生抗药性的概率。如果害虫产生了抗性，还可以通过调整靶基因的设计，继续保持RNAi技术的防治效果^[37]。(3) 环保性和低残留。RNAi技术基于小干扰RNA (siRNA)发挥作用，这些分子在环境中较易降解，减少了残留污染的风险。相比之下，化学农药在施用后可能长期残留在土壤和水体中，造成环境污染和食品安全隐患。RNAi技术符合可持续农业的环保要求，能够减少农业生产中的化学物质使用，降低环境污染^[35]。(4) 靶向多重基因的潜力。RNAi技术能够同时靶向多个害虫生理中的关键基因，通过联合干扰多个目标基因，可以显著增强防治效果，并降低害虫适应性变异的可能性^[38-39]，这在防治复杂害虫群体(如不同发育阶段的烟粉虱)时具有显著的优势。

4.   结论

本研究通过RNAi技术在烟草中沉默烟粉虱从植物源获得的酚糖解毒基因BtPMaT1，显著提高了烟草对烟粉虱的抗性，为烟田烟粉虱防治提供了新的思路和方法。这一技术有望成为农业害虫管理的重要手段。