中药材的产地加工是指在药材原产地进行初加工和后处理的过程^[1]，包括按原材料的临床用药需求对其进行分级分类、饮片炮制等处理操作，是从药材转变为药品的关键过程。二氧化硫的化学特性使其成为一些药材产地加工中不可或缺的添加剂，通常药材和食品中的二氧化硫残留量是指亚硫酸盐(${\mathrm{SO}}_{3}^{2-} $)、亚硫酸氢盐(${\mathrm{H}}{\mathrm{SO}_3^{-}} $)、焦亚硫酸盐($ {\mathrm{S}_2}{\mathrm{O}_5^{2-}}$)等离子的统称。作为防腐剂，亚硫酸盐可有效防止细菌等有害微生物的侵蚀，具有抗褐变和氧化的作用^[2]。近年来的研究发现：二氧化硫可以被植物吸收到细胞内，迅速分解成${\mathrm{SO}}_{3}^{2-} $和${\mathrm{H}}{\mathrm{SO}_3^{-}} $，并进一步通过生物合成途径转化为半胱氨酸、谷胱甘肽等氨基酸成分^[3-4]，在药材的储存运输过程中对产品质量和安全起关键作用^[5-6]，但目前对于药材加工过程中含硫添加剂的使用问题仍然备受争议。一方面，研究表明：人类长期大量接触食品中残留的二氧化硫会导致咳嗽、胸闷、哮喘等呼吸道不适反应^[7-8]，且硫酸盐类的添加剂会影响食品和药品的品质^[9-11]；另一方面的研究则认为：中药材不同于一般的食品，服用前的煎煮等过程可使二氧化硫残留量流失60%~90%，降低其残留所带来的风险^[12-13]。除此之外，还需综合考虑中药材的实际用药量和不同加工方式等问题。

中药材天麻是兰科(Orchidaceae)植物天麻(Gastrodia elata Bl.)的干燥块茎。现代研究认为：天麻具有增强记忆、改善睡眠质量、防治糖尿病等药理作用^[14-19]。随着栽培技术的成熟，天麻已广泛种植于中国湖北、云南、陕西等地^[20]，目前市场中的商品天麻流通几乎全部依靠人工栽培供应。已有研究主要探讨了天麻加工过程中干燥、断生、硫熏等工艺对天麻有效药用成分的影响。刘彦铎等^[21]以天麻素为质量评价指标，对不同的干燥方法进行了比较。MA等^[22]利用电离质谱成像技术，跟踪调查蒸制过程中天麻酚类成分的空间分布变化，并认为水解酶的及时灭活是保证巴利森苷类化合物含量的关键。对天麻硫黄熏蒸的研究发现：二氧化硫在1~2 h内即与天麻中的酚酸类化合物发生反应，导致天麻素含量降低30.94%，对羟基苯甲醛含量降低50.00%^[23]；此外，硫熏过程中，苯酚类成分易发生酯化反应，而较高的含水量也为天麻有效成分的转化提供了适宜的反应环境^[24]。以上研究结果表明：不同的加工方式可对天麻的品质产生巨大影响。但关于天麻的加工研究通常聚焦于部分加工环节或单一有效成分，试验设计与实际产地加工情况较为脱节，不利于直接指导生产。

由于天麻块茎中含有大量多糖类成分而不易干燥，因此，在目前的产地加工过程中，经常使用含硫添加剂[ 焦亚硫酸钠溶液(sodium metabisulfite solution，SMS)]浸泡的方法处理天麻。通过近年来在天麻主产区的调研发现：使用SMS浸泡新鲜天麻基本完全替代了传统硫熏的加工方式，但目前关于其对天麻质量的影响还知之甚少。为了明确不同产地加工方式和含硫添加剂对天麻药材质量的影响，本研究结合实际生产，采用超高效液相色谱—飞行时间质谱(ultra high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS)解析不同处理方式对天麻化学成分的影响，并在此基础上对天麻主要差异成分进行定量分析，旨在为不同产地加工方式的天麻质量评价提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料与试剂

色谱级甲醇和乙腈，德国默克公司；天麻素(gastrodin，GA，批号：62499-27-8)、对羟基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA，批号：623-05-2)、巴利森苷E (parishin E，PE，批号：952068-57-4)、巴利森苷B (parishin B，PB，批号：174972-79-3)和巴利森苷C (parishin C，PC，批号：174972-80-6)，成都瑞芬思生物科技有限公司；巴利森苷A (parishin A，PA，批号：15082302)，成都博普菲植物化学制品有限公司；亚硫酸钠标准溶液，广州检测科技有限公司；焦亚硫酸钠，上海皓鸿生物医药科技有限公司；硫黄，洛阳天之道新材料科技有限公司。

新鲜天麻样品为单个质量约为150 g的红天麻，购自湖北省罗田县九资河镇，经湖北中医药大学刘大会教授鉴定为兰科植物天麻，凭证标本存放于湖北中医药大学。

1.2   主要仪器与设备

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱系统和Xevo-G2-S Q-TOF-MS质谱系统(含MassLynx 4.1软件)，美国Waters公司；LC-2030C 3D型高效液相色谱仪，日本岛津公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)，安捷伦科技(中国)有限公司；TRACE1300-ISQ QD型气相色谱—质谱联用系统，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；奥豪斯EX125DZH天平，美国奥豪斯仪器(上海)有限公司。

1.3   样品制备

将采购的新鲜天麻样品洗净后晾干表面水分，每组挑选大小一致的天麻约600 g。按照产地加工方式，设置5种天麻处理方式(表1)：J组天麻样品先在SMS中浸泡2 h，后隔水蒸至断面无白心；K组天麻样品先在SMS中浸泡2 h，后水煮至断面无白心；L组天麻样品先在水中浸泡2 h，后使用SMS煮至断面无白心；M组天麻样品先用水煮至断面无白心，后置于SMS中浸泡2 h；N组天麻样品先水煮至断面无白心，后置于干燥器上层，下层点燃硫黄粉末(m_天麻∶m_硫黄=20∶1)进行硫熏。

表  1  不同组别天麻的处理方法

Table  1.  Treatment methods for different groups of Gastrodia elata

组别 group	处理步骤 processing step	处理梯度* gradient of treatment
J	焦亚硫酸钠浸泡→蒸制断生 soaking in SMS→steaming	0、1、2、4、8、16
K	焦亚硫酸钠浸泡→煮制断生 (纯水) soaking in SMS→boiling with pure water	0、3、6、9、12
L	纯水浸泡→煮制断生 (焦亚硫酸钠) soaking in pure water→boiling with SMS	0、3、6、9、12
M	煮制断生 (纯水)→焦亚硫酸钠浸泡 boiling with pure water→soaking in SMS	0、3、6、9、12
N	煮制断生 (纯水)→硫黄熏蒸 boiling with pure water→sulphur fumigation	0、1、2
注：“*”表示不同组设置不同处理方式，其中，N组处理设置时间梯度，单位：h；其他组处理设置质量浓度梯度，单位：g/L。 Note: SMS. sodium metabisulfite solution. “*” indicates different groups set different treatment methods, among them, group N set time gradient, unit: h; other groups set mass concentration gradient, unit: g/L.

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在J、K、L和M组中，根据实际生产使用情况，设置5个SMS梯度处理，分别为：0 (空白对照组)、3、6、9和12 g/L；在N组中，设置3个硫熏时间，分别为：0 (空白对照组)、1和2 h。为了分析不同加工方式对天麻有效成分和二氧化硫残留量变化的影响，选取常用的煮制断生(K、L和M组)方式，并采用6 g/L SMS处理样品，进一步分析其成分的变化规律。天麻处理后统一55 ℃烘干，打粉过60目筛备用。

1.4   标准品溶液制备

精密称取适量GA、HA、PA、PB、PC和PE对照品，于10 mL容量瓶中加入50%甲醇溶液定容，分别制成质量浓度为0.416、0.306、0.602、0.318、0.808和0.318 mg/mL的标准品溶液。

1.5   供试品溶液制备

精密称取天麻药材粉末0.5 g，加入50%甲醇溶液20 mL，室温下超声提取(功率120 W，频率40 kHz) 30 min，补足失重，取上清液1 mL过0.22 μm滤膜，供高效液相色谱与Q-TOF-MS质谱分析。在供试样品制备完成后，间隔挑选15个样品，各取100 μL制成混合对照样品。

1.6   高效液相色谱条件

流动相：A相为色谱纯乙腈，B相为加入0.1%磷酸的超纯水溶液；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流速0.8 mL/min；检测波长220 nm；梯度洗脱程序为：0~10 min，3%~10% A；10~15 min，10%~12% A； 15~25 min， 12%~18% A； 25~40 min，18% A；40~42 min，18%~95% A。

1.7   质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，离子化模式为负离子，离子源温度100 ℃，氮气流速900 L/h。毛细管电压2000 V，锥孔电压40 V，扫描范围m/z 50~1500。以Leucineenk Ephalin为校正液。

1.8   二氧化硫残留量检测方法

天麻样品的二氧化硫残留量按照《中华人民共和国药典》^[25]中的气相色谱法测定。

1.9   数据处理与统计分析

所有试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26进行ANOVA显著性分析；采用GraphPad Prism 8.3.0作图；采用MassLynx^TM4.1 (Waters，美国)处理原始质谱数据，再采用Progenesis QI和EZinfo分析数据。

2.   结果与分析

2.1   主要差异化合物

经与二级裂解碎片和标准品(图1a)对比后，确认天麻混合样品(图1b)中的6个主要有效成分离子峰为2种天麻素类与4种巴利森苷类化合物。由样品整体的主成分分析可知：混合对照样品的化学成分数据分布稳定；5种不同处理的统计结果大致可分为2大类，其中J、K组样品聚为一类，M、N组样品聚为另一类，而L组由于组内样品有效成分含量差异较大导致离散程度较大(图2a)。从不同处理组的组间数据离散程度来看，K组和M组的数据完全分离，表明经过这2种不同处理方式后，天麻成分变化差异明显，由于煮制断生法目前在产地加工中被广泛使用，为了更好地代表不同加工方式对天麻品质的影响差异，选取K组和M组样品进行进一步的主要差异成分分析。

图  1  负离子模式下标准品 (a) 与天麻混合样品 (b) 的基峰离子图

注：GA. 天麻素，HA. 对羟基苯甲醇，PE. 巴利森苷E，PB. 巴利森苷B，PC. 巴利森苷C，PA. 巴利森苷A；下同。

Figure  1.  Base peak ion chromatogram of standards (a) and Gastrodia elata mixed samples (b) in negative ion mode

Note: GA. gastrodin, HA. p-hydroxybenzyl alcohol, PE. parishin E, PB. parishin B, PC. parishin C, PA. parishin A; the same as below.

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图  2  不同加工方式处理后天麻的差异成分分析

注：a) 不同加工方式处理天麻样品的主成分分析：t[1]表示数据中最大变异量的变化方向，t[2]表示数据中次要变异量的变化方向，各加工方式见表1，HY为混合样品；b) K、M组天麻的正交偏最小二乘判别分析：t[1]表示主成分与代谢物的协方差，t[2]表示主成分与代谢物的相关系数，各加工方式见表1；c) K、M组天麻的S-plot分析：p(corr)[1]表示变量与响应变量之间的相关性，p[1]表示该变量在模型中的重要程度，红色圆点表示6种主要的差异成分。

Figure  2.  Analysis of differential components in G. elata after different processing methods

Note: a) principal component analysis of different processing methods for G. elata samples: t[1] represents the direction of maximum variation in the data, t[2] represents the direction of secondary variation in the data, various processing methods are shown in Tab.1, HY represents composite sample; b) orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) of G. elata in group K and group M: t[1] represents the covariance between principal components and metabolites, t[2] represents the correlation coefficient between principal components and metabolites, various processing methods are shown in Tab.1; c) S-plot analysis of G. elata in group K and group M: p(corr)[1] represents the correlation between the variable and the response variable, p[1] represents the importance of the variable in the model, the red rings indicate the six main differential components.

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K组和M组间的正交偏最小二乘判别分析结果(图2b)显示：2种处理的样品完全分离。在左侧M组样品数据的区间内，样品按不同质量浓度处理各自聚集，且组内整体离散程度较大，其中，9 g/L处理的化学成分含量与空白组相距最远，表明该处理下的样品化学成分含量变化较大。而在K组样品中，各质量浓度处理的数据离散程度较小，即不同质量浓度处理的天麻成分含量变化不明显。根据S-plot分析结果(图2c)，筛选得到了6种具有明显差异的成分，经鉴定后确认其分别为PE (1，t_R 13.24，m/z 459.1150)、PA (2，t_R 16.66，m/z 995.3052)、HA (3，t_R 9.19，m/z 124.1370)、GA (4，t_R 6.06，m/z 285.0965)、PB (5，t_R 14.14，m/z 727.2111)、PC (6，t_R 15.63，m/z 727.2074)。根据其裂解碎片大小和裂解规律最终确定其化学结构，分别为2种酚酸类成分(GA、HA)和4种糖苷类成分(PA、PB、PC、PE)，这些糖苷类化合物在含硫的加工环境中可能发生磺化或亚磺化反应，从而导致有效成分流失。

2.2   不同加工方式对天麻有效成分及二氧化硫残留量的影响

由表2可知：同一SMS质量浓度下，不同加工方式处理的天麻，其有效成分含量具有显著差异(P<0.05)。L组样品的GA和HA含量显著低于其他组，但其PA、PC和PE含量显著高于其他组；从总含量来看，K组的6种有效成分总量最低，M组的总含量最高。在所有样品中，酚酸类与巴利森苷类成分总含量呈此消彼长的动态趋势，即随着天麻素类化合物含量的增加，巴利森苷类总含量逐渐下降，且在巴利森苷类含量最低的K组样品中，其二氧化硫残留量最高。

表  2  不同加工方式处理后天麻的有效成分含量和二氧化硫残留量

Table  2.  Contents of effective components and residual sulfur dioxide in G. elata after different processing methods

指标 indexes	K	L	M
天麻素/(mg·g−1) gastrodin (GA)	6.63±0.16 a	4.9±0.29 c	6.05±0.06 b
对羟基苯甲醇/(mg·g−1) p-hydroxybenzyl alcohol (HA)	0.30±0.00 b	0.15±0.01 c	0.36±0.00 a
巴利森苷E/(mg·g−1) parishin E (PE)	4.34±0.03 c	6.25±0.08 a	5.55±0.13 b
巴利森苷B/(mg·g−1) parishin B (PB)	6.25±0.20 b	5.93±0.07 b	7.39±0.43 a
巴利森苷C/(mg·g−1) parishin C (PC)	1.98±0.08 c	2.81±0.01 a	2.61±0.09 b
巴利森苷A/(mg·g−1) parishin A (PA)	16.02±0.15 c	19.73±0.21 a	17.88±0.02 b
GA+HA	6.84±0.32 a	5.08±0.24 c	6.40±0.05 b
PE+PB+PC+PA	28.58±0.25 b	34.76±0.13 a	33.43±0.65 a
二氧化硫残留量/(mg·kg−1) residual sulfur dioxide	278.37±6.30 a	225.07±0.28 b	223.80±0.35 b
注：K、L、M为不同加工方式，具体见表1；同行不同字母表示不同加工方式处理间存在显著差异 (P<0.05)。 Note: K, L, M indicate different processing methods, showing in Tab.1; in the same row, different letters indicate significant differences among different processing methods (P<0.05).

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2.3   不同加工方式对天麻有效成分总含量的影响

由图3可知：在各组处理中，GA与HA含量之和的最小值为2.88 mg/g，达到二者含量之和不小于2.5 mg/g的标准^[25]。从整体来看，各处理组中天麻有效成分总量的变化较大，说明添加剂的质量浓度能显著影响天麻的品质，其中，J组处理的SMS质量浓度达到16 g/L时，天麻的有效成分总量最低。另外，样品中各有效成分的占比较为稳定，表明这些特征差异化合物在加工过程中都受到了影响，造成了有效成分的流失并最终影响天麻的品质。从有效成分的变化趋势来看，N组硫熏天麻的有效成分随着硫熏时长的增加而降低；其他使用添加剂溶液浸泡加工的天麻样品，其有效成分含量均随着SMS质量浓度的升高呈先升高后降低的趋势。在J组处理中，1 g/L SMS浸泡处理的天麻总有效成分含量最高，为42.76 mg/g；而在产地加工中常用的煮制断生(K、L、M组)处理下，均以6 g/L SMS浸泡处理的总有效成分含量最高，分别为35.52、39.77和39.84 mg/g。以上结果表明：断生过程中，适当地使用SMS可以提高其有效成分总含量，但煮制处理的添加剂溶液超过6 g/L后，天麻的有效成分含量降低，过量使用添加剂会显著破坏天麻的品质；蒸制断生的加工方式可以在低质量浓度添加剂的条件下(1 g/L)最大程度地减少有效成分流失。

图  3  天麻中6种主要成分的含量

注：各加工方式见表1。

Figure  3.  Contents of six major components in G. elata

Note: Various processing methods are shown in Tab.1.

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3.   讨论

中药原材料的品质直接影响着中药的安全与疗效，而药材的产地加工则是直接影响中药材的品质、赋予其独特药性的过程，因此，科学规范的产地加工方式是中药质量和安全的关键。产地加工的作用包括在药材收获后筛分其药用部位、延长保质期限以利于储存运输、催生有效成分以提高药材品质、降低药材毒性、改变药性等^{[1, 26-27]}。中药材的鲜加工有效避免了其在自然缓慢干燥过程中活性成分的流失，在一定程度上保证了成品药材的质量^[28]。张薇等^[29]研究表明：微波干燥后，丹参表皮较传统烘干更为鲜亮，其丹参酮类成分的含量也有所提升；而与黑豆共蒸加工后，何首乌中的二苯乙烯苷含量降低了约一半^[30]。这说明中药材加工具有减毒增效、提升药材品质的作用。

本研究采用实际生产的加工方式，通过比较不同加工方式后天麻的主要差异成分、不同组别天麻药材有效成分含量以及二氧化硫残留量的变化规律，探讨5种加工方式对天麻品质的影响。通过差异性分析和S-plot分析，确定了不同处理组间的6种主要差异成分，并对其进行定量分析；在J、K、L、M组的空白对照样品中，M组样品的总有效成分含量最高，达到39.84 mg/g，该结果与前期研究结果^[22]一致，即先进行断生处理可以有效减少天麻药用成分的流失。在所有样品中，酚酸类与巴利森苷类成分总含量呈此消彼长的动态趋势，这可能是由于巴利森苷类化合物由若干个天麻素分子与柠檬酸在不同位点结合而成，在含有二氧化硫的酸性环境下，巴利森苷类成分易产生结构变化，使得天麻素分子与柠檬酸的结合部位出现裂解与重构现象，导致巴利森苷类化合物的相互转化。此外，随着SMS质量浓度的升高，J、K、L、M组样品的有效成分总含量均呈先升高后降低的趋势，分析认为：在添加剂存在的情况下，外部溶液的渗透压增高，在一定程度上抑制了天麻中化学成分向水中的溶解，但试验测定的6种有效成分均为水溶性，而这4组在处理过程中均长时间浸泡于水溶液中，导致天麻的有效成分损失。这说明一定程度的产地加工预处理确实可以保证中药材的品质(如：经九蒸九晒加工的何首乌样品，其二苯乙烯苷含量呈梯度下降，而游离蒽醌类含量上升^[31])，但需要适合的处理时间和添加剂浓度。

天麻中的有效成分多为水溶性，杨飞等^[32]研究认为：蒸制处理方式不仅便于天麻的后续切片加工，而且在断生过程中破坏了β-糖苷键酶的活性，一定程度上降低了天麻苷的分解。这一结果与本研究相同。在蒸制处理的J组样品中，天麻的有效成分含量最高(42.76 mg/g)，添加剂用量(1 g/L)也低于其他处理组。分析认为：在蒸制条件下，天麻不直接与水分接触，较煮制断生而言会减弱成分向外渗透的作用，故保留的有效成分含量较高。在安全性方面，当煮制断生且SMS的质量浓度大于6 g/L后，天麻的有效成分含量呈降低趋势，且二氧化硫残留量可能超过最大限值(400 mg/kg^[25])，因此，在生产中应严格注意SMS的使用剂量。天麻作为药食同源产品，应多方面综合评估其在产地加工过程中添加剂的种类、用量和用法问题，针对其药材和食品的双重属性制定加工管理规范。此外，亚硫酸盐作为化学合成制剂，会造成不同程度的二氧化硫残留，具有潜在的安全风险，不应作为长期使用的加工原料。后续研究应积极寻找绿色的替代加工方案，根据天麻主要有效成分的化合物类型开发适宜的产地加工方案，如：杏仁和黄芩中主要为苷类成分，通常通过热处理“杀酶保苷”^[33-34]；对于薄荷等挥发油类成分较高的中药材，通常避免加热和处理时间过长等^[35]。

4.   结论

产地加工时，及时的断生处理可以降低天麻有效成分的损失，一定质量浓度的SMS溶液浸泡也可以减少天麻有效成分的流失；但随着添加剂质量浓度的上升(>6 g/L)，其有效成分含量显著降低，且二氧化硫残留量可能超出限值标准。此外，蒸制断生的效果优于煮制断生。在本研究中，蒸制断生且添加1 g/L SMS的加工方式处理下，天麻6种有效成分的总含量最高，且添加剂的用量最少，增加了天麻产品的安全性。建议在产地加工过程中应尽量减少亚硫酸钠盐类添加剂的使用，避免天麻与水分直接接触，并采用快速蒸制断生的处理方法，以保证天麻的品质。