阳宗海鱼虾中砷、镉、铅、汞含量
分析阳宗海鱼虾中砷等重金属的含量。
于2022年9月采集阳宗海鱼虾样本15种，按照食品安全国家标准检测其无机砷、镉、铅和总汞含量，运用均值型指数法评估重金属综合污染程度，对比暂定每周可耐受摄入量(provisional tolerable weekly intake，PTWI)以评估食用安全性。
鱼虾样本中的无机砷含量为未检出(not detected，ND)~0.190 mg/kg，镉含量为ND~0.023 mg/kg，铅含量为ND~0.071 mg/kg，总汞含量为ND~0.120 mg/kg。虾中的无机砷和镉含量较高，且与鱼类相比存在显著差异；鱼类中的总汞含量显著高于虾。在鱼类中，尼罗罗非鱼的无机砷含量最高，高体鳑鲏对无机砷、镉和铅表现出较强的富集能力。虾的污染指数为0.107，属于微污染；鱼类的污染指数低于0.5，属于未污染或轻污染。根据鱼虾的重金属含量，计算得出人均每周重金属摄入量占PTWI标准值的0.020%~3.500%。
阳宗海鱼虾样本中的4种重金属含量均低于食品安全国家标准和无公害食品的有毒有害物质限量标准，总体污染程度为未污染或轻、微污染。初步推测阳宗海鱼虾的食用风险较低。
Content of Arsenic, Cadmium, Lead, and Mercury in Fish and Shrimp from Yangzonghai
To analyze the content of arsenic (As) and other heavy metals in fish and shrimp from Yangzonghai.
In September 2022, 15 species of fish and shrimp samples were collected from Yangzonghai. In accordance with national food safety standards, the inorganic As, cadmium (Cd), lead (Pb), and total mercury (Hg) contents in these samples were measured. The mean index method was used to evaluate the overall heavy metal pollution, and the provisional tolerable weekly intake (PTWI) was used to evaluate the safety of consumption.
The inorganic As content in fish and shrimp samples ranged from not detected (ND) to 0.190 mg/kg, Cd content ranged from ND to 0.023 mg/kg, Pb content ranged from ND to 0.071 mg/kg, and total Hg content ranged from ND to 0.120 mg/kg. The inorganic As and Cd contents in shrimp were higher than in fish, with significant differences observed; and the total Hg content in fish was significantly higher than in shrimp. Among different fishes, the highest inorganic As content was found in Oreochromis nilotica, and Rhodeus ocellatus showed relatively high bioaccumulation of inorganic As, Cd, and Pb. The pollution index of shrimp was 0.107, indicating mild pollution; while the pollution index of fish was less than 0.5, indicating no pollution or light pollution. Based on the heavy metal content in the fish and shrimp, the weekly per capita intake of heavy metals was calculated to range from 0.020% to 3.500% of the PTWI standard value.
The levels of the four heavy metals in the fish and shrimp samples from Yangzonghai are below the national food safety standards and the limits for toxic and harmful substances in non-polluted food. The overall pollution degree is classified as no pollution or lightly to mildly pollution. It is preliminarily concluded that the consumption risk of fish and shrimp from Yangzonghai is low.
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Keywords:
- Yangzonghai /
- fish /
- shrimp /
- heavy metal pollution /
- food safety /
- arsenic
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蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)是原产于热带、亚热带地区的附生兰科(Orchidaceae)植物，其花型奇特，花色艳丽，花期长，是重要的观赏切花和盆栽花卉，具有较高的经济价值[1]。蝴蝶兰在中国云南、福建、台湾、广东等地广泛种植，长年稳居云南省年宵花销售榜首。云南省的蝴蝶兰大多分布于昆明市晋宁区和嵩明县、玉溪市江川区、红河哈尼族彝族自治州开远市等地，其中嵩明县是云南最大的蝴蝶兰主产区。随着中国蝴蝶兰相关产业的发展，其种植面积不断扩大，再加上长年工厂化组织培养的繁殖方式，导致病毒病发生严重。目前，在蝴蝶兰上已报道的病毒包括建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus，CymMV)、齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus，ORSV)等[2-3]，对蝴蝶兰的产量和品质造成了严重的影响。程晓非等[4]和郑元仙等[5]分别从云南蝴蝶兰病样中分离到隶属于正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的病毒分离物Tospo-Pha以及凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot orthotospovirus，INSV)。丁元明等[6]和黄亚宁等[7]分别报道了云南蝴蝶兰中的CymMV、INSV以及番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)和番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot orthotospovirus，TZSV)的复合感染。扆守鑫等[8]和宋起萱等[9]发现：危害云南蝴蝶兰的主要病毒为CymMV和ORSV。综上所述，目前在云南蝴蝶兰上报道了5种病毒的侵染。
近年来，随着中国兰科植物种苗进出口渠道的多元化，种苗、盆花或切花产品的国内外贸易和种质交流日益频繁，也增加了一些新型病毒病发生和传播的风险[10-11]。ORSV属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是广泛危害蝴蝶兰的病毒之一[12]，但截至目前，尚未见其同属的其他病毒侵染蝴蝶兰的相关报道。课题组对来自昆明花卉市场上的蝴蝶兰病毒病开展病毒检测时，发现了疑似烟草花叶病毒属的番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus，ToMMV)。ToMMV寄主广泛，试验条件下可侵染茄科、豆科、十字花科等5科33种植物[13-18]，但尚未见ToMMV对兰科植物侵染的相关报道。ToMMV传播方式多样，暗示其可能对更多的植物造成危害[15]。被ToMMV感染的田间茄科作物往往表现出顶端坏死、叶片皱缩、斑驳[13-14, 19]、花瓣碎色[20]等症状，严重影响茄果类作物果实的产量及品质。
为更好地了解当前蝴蝶兰产业发展过程中病毒的感染情况，本研究收集了昆明花卉市场的17份蝴蝶兰样品，利用已报道且能侵染蝴蝶兰的ORSV、CymMV、TSWV、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、TZSV及其他病毒的特异性引物进行相关病毒的检测，以明确昆明市售蝴蝶兰携带的病毒种类，并对疑似首次在蝴蝶兰上发现的ToMMV分离物的cp基因进行序列分析，以期为蝴蝶兰病毒病的防控提供参考。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
于2023年7月—2024年4月，对云南昆明花鸟市场的蝴蝶兰进行病害调查，并采集表现为花瓣碎色、叶片褪绿等疑似感染病毒病的蝴蝶兰样品。对采集的样品进行拍照、编号，置于−80 ℃冰箱保存备用。
1.2 供试材料
大肠杆菌DH5α菌株为云南生物资源保护与利用国家重点实验室保存；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)为国产分析纯；pMD19-T载体和反转录试剂TaKaRa Reverse Trancsriptase M-MLV (RNase H−)购自宝生物工程(大连)有限公司，2×SanTaq PCR Mix、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒和DNA纯化回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ToMMV CP单克隆抗体由浙江大学吴建祥教授提供；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。用于病毒接种的蝴蝶兰幼苗购自广州蝴蝶兰基地。
1.3 引物设计
ToMMV检测引物根据GenBank中云南辣椒分离物基因组序列(GenBank登录号：KR824950)设计；CymMV和ORSV检测引物参考文献[10]，CMV检测引物参考文献[21]，TZSV检测引物参考文献[22]；TSWV和INSV检测引物由云南生物资源保护与利用国家重点实验室设计保存。各引物序列见表1。
表 1 用于检测蝴蝶兰病毒的引物Table 1. Primers used for virus detection in Phalaenopsis aphrodite病毒
virus引物名称
primer name引物序列 (5′→3′)
primer sequence退火温度/℃
Tm片段长度/bp
fragment length来源
sourceCymMV CymMV-F CCGCCATAGTCATCCCTCTCTG 54 689 文献[10]
reference [10]CymMV-R GGACACAATCTTTAGAAACCCACA ORSV ORSV-F ATGTCTTACACTATTACAGACCCGTC 56 690 文献[10]
reference [10]ORSV-R TTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC ToMMV ToMMV-F ATGTCTTACGCTATTACTTCTCCG 54 691 本研究
this studyToMMV-R TTAGGACGCTGGCGCAGAAGTC CMV CMV-PuF TCTCATGGATGCTTCTCCGCG 61 692 文献[21]
reference [21]CMV-PuR CCGTAAGCTGGATGGACAACC TSWV TSWVmF ACATCATACTCTACTCCAACACTC 54 693 本实验室
this laboratoryTSWVmR AACCACACTTCGGAATGCTACC INSV INSV-F AGTGTTATCCTCTCAGTTGCTC 53 694 本实验室
this laboratoryINSV-R ATGTCTTGCTGAACACTGTCAC TZSV TZSV-NF CCATCTGCTTCAATTGATC 50 614 文献[22]
reference [22]TZSV-NR CCTCTTTCTATGAGGAGAAC 注：CymMV. 建兰花叶病毒；ORSV. 齿兰环斑病毒；ToMMV. 番茄斑驳花叶病毒；CMV. 黄瓜花叶病毒；TSWV. 番茄斑萎病毒；INSV. 凤仙花坏死斑病毒；TZSV. 番茄环纹斑点病毒。
Note: CymMV. cymbidium mosaic virus; ORSV. odontoglossum ringspot virus; ToMMV. tomato mottle mosaic virus; CMV. cucumber mosaic virus; TSWV. tomato spotted wilt orthotospovirus; INSV. impatiens necrotic spot orthotospovirus; TZSV. tomato zonate spot orthotospovirus.1.4 植物病毒的RT-PCR检测和序列分析
利用CTAB法[23]，从所采集的疑似病毒病样本中提取总核酸，以提取的样品总核酸为模板，利用TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H−)试剂盒合成病毒cDNA。参照2×SanTaq PCR Mix试剂说明书和表1的引物进行目标条带的PCR扩增。PCR反应体系总体积为10.0 μL，包括：2×SanTaq PCR Mix 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1.0 μL。PCR反应程序为：预变性2 min；94 ℃变性30 s，不同引物的退火温度下(表1)退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止反应。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。电泳结束后，在紫光灯下剪切预期大小的特异性片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α，经PCR验证后送至生工生物工程(上海)公司进行测序。测序结果处理后提交至NCBI核酸数据库进行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列比对分析。
1.5 病毒的Dot-ELISA检测
参考张舒[24]的方法对蝴蝶兰病毒进行常规Dot-ELISA检测。分别向检测到感染ToMMV的蝴蝶兰花瓣和叶片样品加入0.01 mol/L PBS缓冲液 (取Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g和KH2PO4 0.2 g完全溶解后定容至1 L，调节pH至7.2)进行研磨；研磨后的匀浆于4 ℃、
12000 r/min离心5 min，取上清液2 μL点到硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜上，室温干燥30 min；将NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液 (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)中，室温封闭。依次进行ToMMV CP单抗孵育和碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育，最后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行显色，观察并记录结果。以感染ToMMV的珊西烟病叶为阳性对照样品。1.6 病毒摩擦接种及感病植株的检测
为了验证ToMMV对蝴蝶兰的致病性，采用摩擦接种的方式，将PBS病毒缓冲液(即PBS缓冲液中含有感染了ToMMV的珊西烟汁液)接种至5株处于4叶期的健康蝴蝶兰上。取被ToMMV感染的珊西烟样品1.0 g于预冷的研钵中，加入0.01 mol/L PBS病毒缓冲液6 mL，充分研磨混合；于4 ℃、
6000 r/min离心5 min，吸取全部上清液至新的1.5 mL离心管，置于冰上。在待接种健康蝴蝶兰叶片表面撒少量金刚砂，用手指蘸取少量病样汁液，在叶面顺时针轻轻摩擦，后喷洒清水。对照植株以同样的方式接种PBS缓冲液。接种完成的植株贴上标签，标注接种日期及毒源，观察记录蝴蝶兰植株的生长情况及感病症状。接种30 d后，采集蝴蝶兰叶片，对ToMMV进行RT-PCR和Dot-ELISA检测，方法同1.4和1.5节。1.7 构建ToMMV cp基因系统进化树
利用NCBI网站的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具对RT-PCR扩增出的片段测序结果进行比对分析，从GenBank数据库中下载ToMMV不同分离物的cp序列，利用MEGA 7.0软件进行序列多重比对分析，然后在MEGA 7.0软件中采用最大似然法构建ToMMV不同分离物cp基因的系统进化树。
2. 结果及分析
2.1 蝴蝶兰样品中7种病毒的RT-PCR检测结果
利用CymMV引物扩增到约700 bp的条带，ORSV引物扩增到约400 bp的条带，TSWV引物扩增到约500 bp的条带，ToMMV引物扩增到约500 bp的条带，均与设计引物扩增片段大小一致(图1)。PCR扩增产物的克隆和测序结果表明：在17份蝴蝶兰样品中， 有7份样品检出ORSV、 CymMV、 TSWV和ToMMV， 病毒总检出率为41.18%。其中，6份样品检测到ORSV，检出率为35.29%；4份样品检测到CymMV，检出率为23.53%；各有1份样品分别检测到TSWV和ToMMV，检出率分别为5.88%；4份样品检测到ORSV和CymMV的复合侵染，复合侵染率为23.53%，1份样品同时检测到ORSV、CymMV和TSWV，复合侵染率为5.88%。在17份蝴蝶兰样品中均未检测到CMV、INSV和TZSV。
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图 1 蝴蝶兰样品中7种病毒的RT-PCR检测结果注：M.2000 bp DNA Marker；1~17. 蝴蝶兰样品；CK. 阴性对照；+. 阳性对照。a) 建兰花叶病毒(CymMV)检测；b) 齿兰环斑病毒(ORSV)检测；c) 凤仙花坏死斑病毒(INSV)检测；d) 番茄环纹斑点病毒(TZSV)检测；e) 番茄斑萎病毒(TSWV)检测；f) 黄瓜花叶病毒(CMV)检测；g) 番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)检测。Figure 1. Seven viruses detection results by RT-PCR in Phalaenopsis aphrodite samplesNote: M.2000 bp DNA Marker; 1-17. P. aphrodite samples; CK. negative control; +. positive control. a) detection of cymbidium mosaic virus (CymMV); b) detection of odontoglossum ringspot virus (ORSV); c) detection of impatiens necrotic spot orthotospovirus (INSV); d) detection of tomato zonate spot orthotospovirus (TZSV); e) detection of tomato spotted wilt orthotospovirus (TSWV); f) detection of cucumber mosaic virus (CMV); g) detection of tomato mottle mosaic virus (ToMMV).2.2 Dot-ELISA验证蝴蝶兰样品中ToMMV的感染
Dot-ELISA检测结果(图2)显示：感染ToMMV的珊西烟病叶(阳性对照)与ToMMV CP抗体呈强烈的阳性反应，感病蝴蝶兰的花瓣和叶片与ToMMV CP抗体呈弱阳性反应，健康的蝴蝶兰叶片与ToMMV CP抗体没有反应，表明感病蝴蝶兰的花瓣和叶片中确实存在ToMMV，但病毒含量较低。
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图 2 Dot-ELISA验证ToMMV对蝴蝶兰的感染注：1. 感染ToMMV的蝴蝶兰花瓣；2. 感染ToMMV的蝴蝶兰叶片；+. 感染ToMMV的珊西烟叶片阳性对照；CK. 健康蝴蝶兰叶片。Figure 2. Dot-ELISA verification of ToMMV infection in P. aphroditeNote: 1. ToMMV-infected P. aphrodite petals; 2. ToMMV-infected P. aphrodite leaf; +. positive control of ToMMV-infected Nicotiana tabacum var. Xanthinc leaf; CK. healthy P. aphrodite leaf.2.3 接种ToMMV后蝴蝶兰的症状
接种PBS缓冲液的蝴蝶兰植株无症状；接种ToMMV的蝴蝶兰接种叶黄化，而系统叶无明显症状(图3)。RT-PCR和Dot-ELISA检测结果(图4~5)显示：在接种病毒的5株蝴蝶兰植株中均检出ToMMV，而接种PBS缓冲液的蝴蝶兰植株中未检出ToMMV，表明人工接种条件下ToMMV可以感染蝴蝶兰。
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图 3 接种ToMMV蝴蝶兰的症状注：a)和b) 接种PBS缓冲液；c)和d) 接种ToMMV。Figure 3. Symptom of P. aphrodite plants after inoculation with ToMMVNote: a) and b) inoculation with PBS buffer solution; c) and d) inoculation with ToMMV.![]()
图 4 RT-PCR检测接种蝴蝶兰中ToMMV的感染情况注：M. Marker；1~2. 接种PBS缓冲液；3~7. 接种ToMMV；+. ToMMV阳性对照；CK. 阴性对照。Figure 4. Detection of ToMMV infection in the inoculatedP. aphrodite by RT-PCRNote: M. Marker; 1-2. inoculation with PBS buffer solution; 3-7. inoculation with ToMMV; +. ToMMV positive control; CK. negative control.![]()
图 5 Dot-ELISA检测接种蝴蝶兰中ToMMV的感染情况注：1~5. 接种ToMMV；CK1和CK2. 接种PBS缓冲液；+. ToMMV阳性对照。Figure 5. Detection of ToMMV infection in the inoculatedP. aphrodite by Dot-ELISANote: 1-5. inoculation with ToMMV; CK1 and CK2. inoculation with PBS buffer solution; +. ToMMV positive control.2.4 ToMMV蝴蝶兰分离物cp基因的遗传变异和系统发育分析
从蝴蝶兰植株中克隆获得完整的ToMMV cp基因480 bp，测序后将ToMMV蝴蝶兰分离物(YKMHDL) cp基因序列(GenBank登录号：PP445226)与GenBank中其他19个ToMMV分离物的 cp基因序列进行比对，发现YKMHDL分离物与其他ToMMV分离物的cp基因核苷酸序列一致性为98.12%~99.79%。其中，YKMHDL分离物与云南元谋辣椒分离物(GenBank登录号：KR824950)、云南蒙自豌豆分离物(GenBank登录号：ON146334)的cp基因核苷酸序列一致性最高，为99.79%；与西藏拉萨辣椒分离物(GenBank登录号：KR824951)的cp基因核苷酸序列一致性为99.58%；与西班牙番茄分离物(GenBank登录号：KU594507)的cp基因核苷酸序列一致性最低，为98.12%。YKMHDL分离物与来自中国的海南番茄分离物(GenBank登录号：MG171192)、茄子分离物(GenBank登录号：MH636301)、安徽栝楼分离物(GenBank登录号：ON924176)的cp基因核苷酸序列一致性分别为99.17%、99.17%和98.75%，显示这些ToMMV中国分离物之间的亲缘关系较近。
以上述20个ToMMV分离物的cp基因序列构建系统进化树，结果(图6)显示：20个ToMMV分离物大致分为2个大组。组Ⅰ大部分为中国分离物，包括：云南元谋辣椒分离物、云南蒙自豌豆分离物、云南蝴蝶兰分离物、西藏辣椒分离物、海南番茄分离物、中国茄子分离物、山东番茄分离物(GenBank登录号：MW373515)，以及国外的越南番茄分离物(GenBank登录号：OK334224)、以色列番茄分离物(GenBank登录号：KP861748)和美国番茄分离物(GenBank 登录号：KX898033)；其中，ToMMV-YKMHDL分离物与云南元谋辣椒分离物、云南蒙自豌豆分离物聚集到同一小分支，表明3个分离物之间亲缘关系最近。组Ⅱ大部分为国外分离物，包括：美国番茄分离物(GenBank登录号：KT810183、KP202857、KM000123)、澳大利亚辣椒分离物(GenBank登录号：MN654021)、墨西哥番茄分离物(GenBank 登录号：KF477193)、西班牙番茄分离物和巴西番茄分离物(GenBank 登录号：KT222999)，以及来自中国的广东辣椒分离物(GenBank 登录号：OK180812)、安徽栝楼分离物和辽宁辣椒分离物(GenBank 登录号：MN853592)；其中来自中国的3个分离物聚集在同一小分支上。对比2个大组之间的分离物发现：中国的分离物亲缘关系较近，基本上都聚在组Ⅰ，或单独成1个小分支(云南辣椒、豌豆、蝴蝶兰分离物聚集在同一小分支；辽宁辣椒、广东辣椒、安徽栝楼分离物聚集在同一小分支)，而与其他国家的ToMMV分离物亲缘关系相对较远，表明不同ToMMV分离物之间的差异可能与其地理来源有关。
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图 6 基于ToMMV不同分离物cp基因序列构建的系统发育树注：▲为本研究获得的ToMMV蝴蝶兰分离物。Figure 6. Phylogenetic tree based on the cp gene sequences of different ToMMV isolatesNote: ▲ indicates the ToMMV P. aphrodite isolate obtained in this study.3. 讨论
蝴蝶兰具有较高的观赏价值和经济价值，是重要的观赏花卉之一。目前世界上已报道CymMV、ORSV、CMV、TSWV等超过15种植物病毒能够感染蝴蝶兰。病毒感染会导致蝴蝶兰叶片坏死和畸形、花穗短小、花期缩短、花瓣变色等明显症状，导致蝴蝶兰观赏和商品价值降低[25]；此外，还有部分病毒感染蝴蝶兰后虽然无明显症状，但会造成植株生长缓慢[5]。在国内外关于蝴蝶兰病毒病的报道中，危害最为广泛和严重的是CymMV和ORSV，这2种病毒可以通过无性繁殖材料、汁液、昆虫媒介等传播，是影响世界蝴蝶兰经济的主要病原[12, 26]。
云南省是中国蝴蝶兰的主要产地之一，目前云南地区报道了蝴蝶兰的CymMV[6, 8-9]、ORSV[8-9]、INSV[5-6]、TSWV[7]和TZSV[7]侵染，其中CymMV和ORSV是危害云南地区蝴蝶兰的主要病毒，检出率高达90%以上[9]。本研究对昆明市售的蝴蝶兰进行了病毒检测，发现ORSV和CymMV依然是危害蝴蝶兰的主要病毒，检出率分别为35.29%和23.53%。7份阳性蝴蝶兰样品中，ORSV单独感染样品无明显症状，ORSV和CymMV复合侵染的样品表现为花瓣碎色或症状不明显，而受到ORSV、CymMV和TSWV复合侵染的样品表现为叶片褪绿，推测该症状可能与TSWV或其他未知病毒有关，单一或复合病毒侵染对蝴蝶兰病毒病症状的影响需进一步研究。本研究首次在蝴蝶兰中检出ToMMV，并通过人工接种方式验证ToMMV对蝴蝶兰的致病性，结果表明：ToMMV能感染蝴蝶兰，但被ToMMV感染的蝴蝶兰无明显症状，这与市售ToMMV侵染的蝴蝶兰叶片轻微褪绿有所不同，分析其原因可能与蝴蝶兰品种特性、ToMMV分离物或蝴蝶兰上还存在其他病毒感染有关，具体原因还需进一步探究。
ToMMV为帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属成员，于2013年首次在墨西哥温室番茄中被报道[27]。据欧洲和地中海植物保护组织统计：ToMMV已在全球24个国家和地区发生，使番茄、辣椒等作物的生产遭受了重大损失[28]。目前报道的ToMMV自然寄主有茄科[29-30]、豆科[31]和葫芦科[32]作物，但人工接种条件下ToMMV还能够侵染5科33种植物[13-18]。本研究为ToMMV侵染兰科植物及蝴蝶兰的首次发现，也是ToMMV在自然情况下侵染茄科、豆科、藜科和葫芦科植物以外的首次报道，表明ToMMV寄主范围在不断扩大。
有研究表明：当前全球不同ToMMV分离物的基因组序列差异性较小[33-34]。本研究获得的ToMMV蝴蝶兰分离物与来自不同国家、不同寄主植物上的19条ToMMV完整cp基因序列的比对结果也表明ToMMV高度保守；但进一步的系统发育分析发现：ToMMV蝴蝶兰分离物与云南辣椒分离物和豌豆分离物亲缘关系最近，与国外分离物的亲缘关系较远，暗示侵染蝴蝶兰的ToMMV分离物可能来源于云南的辣椒或豌豆，或它们有共同的祖先。
从已有研究来看，单一的ToMMV侵染不会导致蝴蝶兰出现明显症状，但ToMMV与其他病毒的复合侵染可能会使蝴蝶兰出现严重的症状。携带ToMMV的无症状或轻微症状蝴蝶兰在市场上广泛交易，存在ToMMV通过蝴蝶兰大范围且远距离传播的潜在风险。目前，市场上尚无彻底清除病毒的药剂，需加强ToMMV在不同作物上的监测，防范ToMMV的进一步传播、扩散和蔓延。此外，选用健康或脱毒的组培苗，对提高蝴蝶兰产品质量和控制病毒传播尤为重要。
4. 结论
从云南昆明花卉市场收集的17份蝴蝶兰植株中检测到4种病毒：ORSV、CymMV、TSWV、ToMMV。其中，ORSV和CymMV仍然是危害蝴蝶兰的2种主要病毒，ToMMV为首次在蝴蝶兰及兰科植物中检出的病毒。ToMMV蝴蝶兰分离物的cp基因核苷酸序列与目前已知的其他ToMMV分离物高度保守，其中，与来自云南的ToMMV辣椒分离物和豌豆分离物的cp基因核苷酸序列一致性最高，亲缘关系最近。
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表 1 样本基本情况
Table 1 Basic information of samples
种
species数量
quantity体长/mm body length 体质量/g body weight 最小值
minimum
value最大值
maximum
value平均值
average
value最小值
minimum
value最大值
maximum
value平均值
average
value鲢 Hypophthalmichthys molitrix 26 90 515 366 9.7 2345.0 1605.0 鳙 Aristichthys nobilis 6 90 446 166 11.3 1660.0 299.0 鲫 Carasius auratus 8 48 200 145 3.1 218.4 114.9 䱗 Hemiculter leucisculus 87 125 176 153 23.2 63.6 43.0 太湖新银鱼 Neosalanx taihuensis 478 40 60 50 3.0 5.0 4.0 草鱼 Ctenopharyngodon idellus 1 182 182 182 99.2 99.2 99.2 瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachelli 38 132 134 133 30.8 33.9 32.3 尼罗罗非鱼 Oreochromis nilotica 9 25 200 162 0.6 343.5 224.4 鲤 Cyprinus carpio 1 180 180 180 167.4 167.4 167.4 高体鳑鲏 Rhodeus ocellatus 76 31 74 49 0.7 8.7 4.0 间下鱵鱼 Heporhamphus intermedius 46 110 178 136 2.5 11.8 7.3 花䱻 Hemibarbus maculatus 3 165 206 178 61.9 115.4 83.4 子陵吻鰕虎鱼 Rhinogobius giurinus 412 22 50 40 1.2 3.0 0.3 小黄䱂鱼 Micropercops swinhonis 18 28 34 32 0.1 0.3 0.3 日本沼虾 Macrobrachium nipponenes 101 0.9 
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表 2 鱼虾中4种重金属的含量
Table 2 Content of four heavy metals in fish and shrimp
重金属
heavy metal含量范围/(mg·kg−1)
content range检出率/%
detection rate平均值/(mg·kg−1)
average value限量标准/(mg·kg−1)
limited standard是否超标
exceed or not鱼类 fish 虾 shrimp 无机砷 As ND~0.190 33.3 0.038±0.058 0.1 0.5 否 no 镉 Cd ND~0.023 26.7 0.003±0.006 0.1 0.5 否 no 铅 Pb ND~0.071 6.7 0.005±0.018 0.5 0.5 否 no 汞 Hg ND~0.120 66.7 0.036±0.039 0.5 0.5 否 no 注：汞的限量标准为甲基汞限量。ND表示检测结果低于检测仪器的检出限，涉及计算时ND视为“0”；下同。
Note: The limit standard for mercury is the limit of methylmercury. ND indicates the detection result is below the detection limit of the testing instrument, and ND is regarded as “0” when the calculation is involved; the same as below.
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表 3 不同鱼类和虾中的重金属含量检测值(n=3)
Table 3 Detection values of heavy metals in different fishes and shrimp
mg/kg 物种 species 无机砷 As 镉 Cd 铅 Pb 汞 Hg 鲢 Hypophthalmichthys molitrix ND ND ND 0.025±0.003 鳙 Aristichthys nobilis ND ND ND 0.032±0.003 鲫 Carasius auratus ND ND ND 0.038±0.002 䱗 Hemiculter leucisculus ND ND ND 0.120±0.004 太湖新银鱼 Neosalanx taihuensis ND ND ND ND 草鱼 Ctenopharyngodon idellus ND ND ND ND 瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachelli ND ND ND 0.120±0.001 尼罗罗非鱼 Oreochromis nilotica 0.098±0.001 0.004±0.001 ND ND 鲤 Cyprinus carpio ND ND ND ND 高体鳑鲏 Rhodeus ocellatus 0.097±0.000 0.007±0.000 0.070±0.002 0.029±0.002 间下鱵鱼 Heporhamphus intermedius ND ND ND 0.071±0.003 花䱻 Hemibarbus maculatus ND 0.006±0.000 ND 0.048±0.002 子陵吻鰕虎鱼 Rhinogobius giurinus 0.090±0.001 ND ND 0.026±0.000 小黄䱂鱼 Micropercops swinhonis 0.090±0.001 ND ND 0.026±0.003 日本沼虾 Macrobrachium nipponenes 0.190±0.004 0.023±0.004 ND ND
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表 4 鱼类和虾的重金属污染指数
Table 4 Pollution index of heavy metals in fish and shrimp
物种
species污染指数
pollution index程度
degree高体鳑鲏 Rhodeus ocellatus 0.311 轻污染 light pollution 尼罗罗非鱼 Oreochromis nilotica 0.255 轻污染 light pollution 小黄䱂鱼 Micropercops swinhonis 0.238 轻污染 light pollution 子陵吻鰕虎鱼 Rhinogobius giurinus 0.238 轻污染 light pollution 日本沼虾 Macrobrachium nipponenes 0.107 微污染 mild pollution 䱗 Hemiculter leucisculus 0.060 未污染 unpolluted 瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachelli 0.060 未污染 unpolluted 花䱻 Hemibarbus maculatus 0.039 未污染 unpolluted 间下鱵鱼 Heporhamphus intermedius 0.036 未污染 unpolluted 鲫 Carasius auratus 0.019 未污染 unpolluted 鳙 Aristichthys nobilis 0.016 未污染 unpolluted 鲢 Hypophthalmichthys molitrix 0.012 未污染 unpolluted 草鱼 Ctenopharyngodon idellus 0.000 未污染 unpolluted 鲤 Cyprinus carpio 0.000 未污染 unpolluted 太湖新银鱼 Neosalanx taihuensis 0.000 未污染 unpolluted
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表 5 每周人均重金属摄入量与暂定每周可耐受摄入量(PTWI)
Table 5 Weekly per capita intake of heavy metals and provisional tolerable weekly intake (PTWI)
重金属
heavy metal每周摄入量/mg
weekly intakePTWIa/(mg·kg−1) PTWIb/mg 占 PTWIb/% A M A 占比 M 占比 无机砷 As 0.0026 0.0133 0.015 0.90 0.289 1.478 镉 Cd 0.0002 0.0016 0.007 0.42 0.048 0.381 铅 Pb 0.0003 0.0050 0.025 1.50 0.020 0.333 汞 Hg 0.0025 0.0084 0.004 0.24 1.042 3.500 注：A表示以重金属含量平均值计算每周摄入量；M表示以重金属含量最大值计算每周摄入量；a表示单位为mg/kg的PTWI值；b表示单位为mg的PTWI值。
Note: A represents the weekly intake calculated by the average value of heavy metal content; M represents the weekly intake calculated by the maximum value of heavy metal content; a represents the PTWI value in unit of “mg/kg”; b represents the PTWI value in unit of “mg”.
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表 6 本研究水域与其他水域鱼类重金属平均含量的比较
Table 6 Comparison of the average heavy metal content of fish in this study area and other waters
研究区域 study area 砷 As 镉 Cd 铅 Pb 汞 Hg 神农架大九湖[51]
Dajiuhu Lake, Shennongjia0.135 0.008 0.243 0.082 威宁草海[52]
Caohai, Weining0.209 0.082 0.325 0.008 贵州松桃河[53]
Songtao River, Guizhou0.005 0.027 0.113 长江中下游[54]
the middle and lower reaches
of the Yangtze River0.091 0.524 0.012 湖北保安湖[55]
Bao’an Lake, Hubei0.230 0.005 0.030 0.047 江西鄱阳湖[56]
Poyang Lake, Jiangxi0.043 0.125 广西漓江[57]
Lijiang River, Guangxi0.020 0.175 0.652 0.034 广西刁江[58]
Diaojiang, Guangxi0.365 0.018 0.367 0.015 本研究
this study0.027 0.001 0.005 0.038
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