AMPK介导的饥饿条件下小鼠肝细胞能量代谢转换及脂肪自噬
通过探究饥饿条件下小鼠肝细胞内能量代谢的过程，揭示其营养感应的变化，筛选调节肝细胞内自噬及能量调控的关键通路，阐明脂质响应能量动员的降解机制。
近交系小鼠(C57/B6)分别完全禁食0、24和48 h，按时间点记录小鼠血糖和体质量的变化，取各组小鼠肝脏组织进行过碘酸雪夫染色和电镜观察；采用RT-qPCR检测糖脂代谢和自噬相关基因mRNA的相对表达量；采用Western-blot检测自噬和能量感应AMPK通路中关键蛋白的表达。
饥饿24和48 h后，小鼠肝组织内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的相对表达量极显著升高，P62蛋白的相对表达量显著降低。饥饿处理引起小鼠肝细胞内主要能量来源发生转换，脂滴招募自噬基因ATG2A和PLIN2的mRNA表达显著上调，线粒体膜蛋白TOM20以及调控能量代谢和脂噬的P-AMPK、P-FOXO1蛋白表达极显著上调，表明饥饿处理导致小鼠肝细胞发生了线粒体自噬和脂噬。
饥饿24 h后，小鼠机体主要能量来源由以糖代谢为主转换为以脂质代谢为主，饥饿处理可能通过激活AMPK和FOXO1促进储存于小鼠肝细胞内的脂质发生脂噬降解，释放游离脂肪酸氧化供能。
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关键词:
- 饥饿 /
- 能量代谢转换 /
- 脂肪自噬 /
- 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)
AMPK Mediates Energy Metabolism Transformation and Lipid Autophagy in Mouse Liver Cells under Starvation Conditions
To explore the process of energy metabolism in mouse hepatocytes during starvation, revealing the changes in nutritional sensitivity, screening out the key pathways regulating autophagy and energy regulation in hepatocytes, and elucidating the mechanism of lipid degradation in response to energy mobilization.
Inbred mice (C57/B6) were completely fasted for 0, 24 and 48 hours, the changes of blood glucose and body weight of mice were recorded according to time point. The liver tissues of mice in each group were detected by periodic acid-Schiff (PAS) staining and electron microscope observation, and the relative mRNA expression levels of related genes in glucose and lipid metabolism and autophagy were detected by q-PCR. Western-blot analysis was performed to detect the expression of key proteins in autophagy and energy-sensing AMPK pathway.
The expression level of protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ was extremely significantly increased, and the expression level of protein P62 was significantly decreased in the liver tissues of mice starved for 24 and 48 hours. Starvation induced the transformation of the main energy source in mouse hepatocytes, the mRNA expressions of autophagy genes ATG2A and PLIN2 were significantly up-regulated; the expressions mitochondrial membrane protein TOM20 and the proteins regulating energy metabolism and lipophagy (P-AMPK and P-FOXO1) were extremely significantly up-regulated. These results indicated that mitochondrial autophagy and lipophagy were induced by starvation treatment in the mouse liver cells.
After 24 hours of starvation, the main energy source of mice changed from glucose metabolism to lipid metabolism. Starvation treatment may promote the lipophagic degradation of lipids stored in mouse hepatocytes by activating AMPK and FOXO1, releasing free fatty acids for oxidation to supply energy.
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自噬是一种高度保守的分解代谢过程，通过将清除的长寿命蛋白质和细胞器输送到液泡或溶酶体进行降解，维持细胞的能量稳态[1]。OHSUMI[2]研究发现：饥饿状态下，酵母细胞会启动自噬维持自身存活。随后多项研究证实这一机制在其他真核细胞中也成立。因此，饥饿状态下机体会启动自噬，降解受损细胞器、大分子物质等成分以维持细胞内正常的生理活动及稳态。
饥饿状态下，哺乳动物体内储存的糖原大量消耗，肝外组织无法从血液中获得充足的葡萄糖，为维持机体的正常活动，肝脏中的糖异生作用加速，肝脏和肌肉中的脂肪酸氧化也加速，同时动员蛋白质分解。脂肪是所有营养物质中单位质量能量最高的化合物，也是动物的主要能量储存形式。在真核生物中，从膳食中获取的脂肪经机体消化吸收后转化为甘油三酯，并进一步被包装为脂滴(lipid droplets，LDs)。 在能量短缺时，LDs可以通过自噬等途径降解，释放游离脂肪酸，通过脂肪酸β-氧化产生能量[3]。最新研究表明：自噬和LDs在抵御营养应激方面发挥着互补作用[4]。FAN等[5]通过LDs和自噬标记物的共定位检测，证实饥饿会诱导脂肪自噬。CHEN等[6]的研究也表明：在应激刺激下，LDs通过自噬或脂肪酶介导的脂肪分解迅速释放脂肪酸，并通过与线粒体的相互作用，快速将脂肪酸转移到线粒体中燃烧，从而促进产能。LIU等[7]合成了一种“变色”生物荧光探针DPABP-BI，通过改变荧光发射波长识别LDs，并追踪其自噬动态过程，发现溶酶体通过自噬消化LDs，参与细胞能量代谢。细胞内的脂质通过自噬体转运至溶酶体分解的过程称为脂噬作用，简称为脂噬，是调节细胞脂质水平的一种新途径。然而，目前仍不清楚LDs和自噬体如何相互作用[8]。
腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是维持细胞能量稳态的重要能量传感器。据报道，激活的AMPK可通过磷酸化mTORC1、ULK1和PIK3C3/VPS34复合物中的自噬相关蛋白直接促进自噬，或通过调节下游转录因子的自噬相关基因(如FOXO3、TFEB和BRD4)的表达间接促进自噬。葡萄糖耗尽的细胞通过主要的能量感应激酶AMPK诱导自噬，以获得生存所需的能量[9]。PI3K/Akt信号通路会被多种细胞刺激或毒性损伤激活，并调节转录、翻译、增殖、生长、存活等基本细胞功能。已有研究表明：激活PI3K/Akt信号通路能够调节细胞凋亡、蛋白质合成、脂质和能量代谢等[10]。Akt下游作用底物种类繁多，活化的Akt能够负向调控TSC2，使其磷酸化被抑制，随即负向调控mTOR通路使其激活，启动细胞自噬。FOXO1作为细胞氧化还原信号的开关，调控细胞自噬和凋亡的转化，在低氧化应激环境中，FOXO1从细胞核中排出，修饰成Ac-FOXO1，与胞浆中的ATG7结合，促进自噬，保护细胞；而在高氧化应激环境中，FOXO1定位于细胞核，促进促凋亡蛋白的转录，进而诱导细胞凋亡[11]。因此，饥饿情况下的脂噬作用机制可能与上述通路激活有关。
禁食能够诱发机体发生能量转换等多种反应，现阶段已有多种短期禁食模式被开发用于健康干预，但尚未明确禁食过程中脂质代谢作为机体主要能量来源的发生时间及其与自噬的关系。因此，本研究分别通过禁食24和48 h诱导正常小鼠发生自噬，观察小鼠能量代谢的变化和肝脏脂质自噬应答，探究饥饿条件下小鼠能量代谢的调节通路及机制，为短期禁食作为肥胖症或代谢性疾病的健康干预手段提供更深入的理论基础。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 试验动物和分组
45只8周龄SPF级健康C57/B6小鼠(19~21 g)，由昆明医科大学实验动物中心提供。将小鼠随机平均分为3组，即0 h禁食组(对照组)、24 h禁食组和48 h禁食组。0 h禁食组正常供给饮用水和食物，24和48 h禁食组仅提供饮用水。
1.1.2 主要试验材料和试剂
二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、30%丙烯酰胺—亚甲基双丙烯酰胺(acrylamide-bisacrylamide， Acr-Bis， 体积比29∶1)、 10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、一抗稀释液等Western-blotting试剂均产自Beyotime (中国)；甘氨酸和Albumin Bovine V产自Solarbio (中国)；抗LC3B抗体、抗P62/SQSTM1抗体和抗β-actin抗体产自Sigma (美国)；抗P-AMPK抗体、抗AMPK抗体、抗FOXO1抗体和抗P-FOXO1抗体产自CST (美国)，抗TOM20抗体产自Abclonal (中国)。
1.2 试验方法
1.2.1 体质量和血糖监测
试验当天，8： 00撤走食物开始禁食处理，记为试验第0小时，称取各组小鼠体质量，此后，24 和48 h禁食组小鼠分别测定24和48 h时的体质量。同时，0 h用采血针刺破小鼠尾静脉，用干净纱布吸去第1滴血，取第2滴静脉血，使用Roche血糖仪测量并记录血糖值，此后，每隔8 h测定1次血糖，即：24 h禁食组小鼠测定0、8、16、24 h的血糖，48 h禁食组小鼠测定0、8、16、24、32、40、48 h的血糖。
1.2.2 组织取材和脏器指数测定
饥饿试验结束后，小鼠在麻醉状态下用75%乙醇进行体表消毒，用眼科剪沿腹中线剪开，于冰上快速取心、肝、脾、肺、肾、脑和胸腺，称量各脏器质量，然后按照公式计算各只小鼠的脏器指数：脏器指数=脏器质量/小鼠体质量。
1.2.3 过碘酸雪夫染色
为检测禁食对小鼠肝糖原的影响，进行肝脏组织的过碘酸雪夫 (periodic acid-Schiff，PAS)染色。将肝脏组织浸于10%中性福尔马林中固定24~48 h，之后进行石蜡包埋、切片(3 μm)和晾干。石蜡切片脱蜡后，经自来水冲洗，置于氧化剂中室温氧化5~8 min；用自来水清洗后，将样本放入Schiff Reagent染料中，置于室温阴暗处浸染10~20 min，用苏木素染细胞核1~2 min，再用酸性分化液分化2~5 s，自来水冲洗返蓝，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，置于显微镜下观察并采集图像。
1.2.4 透射电镜观察
用2.5%戊二醛对肝脏组织进行预固定，漂洗后去除残留血迹，将组织修剪至1 mm3，放入新固定液于4 ℃固定过夜；之后，在4 ℃条件下，用1% OsO4固定2 h，梯度乙醇脱水后用Epon-812树脂包埋，使用Leica UC-7超薄切片机制备厚约60 nm的连续切片，将超薄切片加载到100目铜网上，并用2%乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色，最后用JEM-1400plus透射电子显微镜在120 kV下观察并拍照，以进一步观察饥饿后各组小鼠肝脏的糖原颗粒和线粒体状态。
1.2.5 q-PCR检测
称量肝脏组织50~100 mg，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，再使用超微量分光光度计检测总RNA浓度；使用逆转录试剂盒(Takara，RR047A)将RNA逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR (q-PCR)扩增。以GAPDH作为内参基因，采用2−△△Ct法计算目的基因/内参基因的相对表达量。通过q-PCR法检测小鼠肝脏组织中与糖代谢、脂代谢和自噬相关的基因mRNA表达水平。
1.2.6 Western-blotting检测
切取组织蛋白样品约50 mg放入1.5 mL离心管中，加入通用蛋白抽提试剂(含1 μmol/L的PMSF蛋白酶抑制剂，检测蛋白磷酸化时，再加入1 μmol/L的蛋白磷酸化酶抑制剂) 50 μL，使用高频组织匀浆仪于70 Hz研磨35 s，然后冰上静置30~60 min，分离出总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，再制备蛋白样品。采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，随后将蛋白转印到PVDF膜上，室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗(LC3B、P62、TOM20、AMPK、 P-AMPK、 FOXO1和P-FOXO1)过夜。清洗未结合的一抗，根据一抗种属室温孵育相应二抗2 h；清洗未结合的二抗，加入显影剂，通过化学发光成像系统进行蛋白显影。
1.3 数据处理与统计分析
使用SPSS 17.0进行数据的统计分析，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析，数据均以“平均值±标准差”表示；使用GraphPad Prism 5制图。
2. 结果与分析
2.1 饥饿对小鼠体质量和脏器指数的影响
由图1可知：与0 h对照组小鼠相比，24和48 h禁食组小鼠的体质量均极显著下降，降幅分别为9.05%和16.00%；与24 h禁食组相比，48 h禁食组小鼠的体质量显著下降，降幅为7.60%。由表1可知：与0 h对照组小鼠相比，24和48 h禁食组小鼠的肝脏指数分别显著和极显著降低，48 h禁食组小鼠的胸腺指数极显著增加，其余器官均无显著变化；与24 h禁食组相比，48 h禁食组小鼠的胸腺指数极显著增加，其余器官无显著差异。说明禁食导致小鼠体质量快速下降，肝脏指数随饥饿时间的延长而降低。
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图 1 禁食对小鼠体质量的影响注：“**”表示与对照组(0 h)相比差异极显著(P<0.01)；“#”表示48 h禁食组与24 h禁食组相比差异显著(P<0.05)；下同。Figure 1. Effects of fasting on the body weigh of miceNote: “**” indicates significant differences compared with the control group (0 hour) (P<0.01); “#” indicates significant differences between the 48 hours and the 24 hours fasting group (P<0.05); the same as below.表 1 禁食对小鼠器官指数的影响Table 1. Effects of fasting on the organ index of mice禁食时间/h
fasting time心
heart肝
liver脾
spleen肺
lung肾
kidney脑
brain胸腺
thymus0 0.106±0.011 1.250±0.082 0.052±0.008 0.136±0.020 0.218±0.030 0.378±0.015 0.108±0.005 24 0.116±0.020 0.923±0.110* 0.062±0.016 0.130±0.012 0.234±0.035 0.380±0.014 0.115±0.017 48 0.106±0.032 0.770±0.118** 0.050±0.014 0.158±0.045 0.262±0.048 0.390±0.020 0.140±0.008**## 注： “*”和“**”分别表示与对照组 (0 h) 相比差异显著 (P<0.05) 和极显著 (P<0.01)；“##”表示与24 h禁食组相比差异极显著 (P<0.01)。
Note: “*” and “**” indicate significant differences (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) compared with the control group (0 hour), respectively; “##” indicates extremely significant differences compared with 24 hours fasting group.2.2 饥饿对小鼠血糖和糖代谢的影响
与0 h对照组相比，饥饿组小鼠的血糖水平在各时间段均大幅降低(图2a)。PAS染色结果(图2b)显示：0 h对照组小鼠肝细胞内有大量的糖原颗粒沉积，而24和48 h饥饿组小鼠肝细胞内糖原颗粒减少，表明饥饿后肝糖原大量消耗。通过q-PCR检测小鼠肝组织中的糖代谢相关基因的mRNA表达情况，结果(图2c)显示：与0 h对照组相比，48 h饥饿组小鼠肝组织内糖原分解及糖异生途径关键基因G6pase和PEPCK的mRNA相对表达量显著升高，而抑制糖原分解和糖异生的APN和AdipoR2基因mRNA相对表达量分别呈降低和显著降低的趋势。
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图 2 禁食对小鼠糖代谢的影响注：a) 血糖变化。b) 肝糖原(→) PAS染色呈紫色。c) 肝细胞内糖脂代谢关键基因mRNA相对表达量，“*”表示与对照组(0 h)相比差异显著(P<0.05)；下同。Figure 2. Effects of fasting on the glucose metabolism of miceNote: a) changes of the blood glucose. b) PAS staining of glycogen (→) appears purple. c) relative mRNA expression levels of key genes involved in glucose and lipid metabolism, “*” indicates significant differences compared with the control group (0 hour) (P<0.05); the same as below.2.3 禁食引起小鼠肝脏自噬
Western-blot检测自噬标志物LC3B和P62蛋白的表达水平，结果(图3a~b)显示：与0 h相比，小鼠禁食24和48 h后，肝组织内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量随饥饿时间的延长而极显著升高，但P62蛋白水平显著下降；荧光染色结果(图3d)显示：随着饥饿时间的延长，小鼠肝脏细胞中的点状LC3B红色荧光增强。以上结果表明：禁食导致小鼠肝脏发生自噬，且自噬程度随饥饿时间的延长而增加，这可能与饥饿引起的能量代谢变化有关。
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图 3 禁食0、24和48 h后小鼠的肝细胞自噬注：a)~b) 肝细胞内LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62蛋白的表达；c) 免疫荧光检测各组小鼠肝细胞内的LC3定位。Figure 3. Occurrence of hepatocyte autophagy in mice after fasting 0, 24 and 48 hoursNote: a)-b) expression of LC3-Ⅱ, LC3-Ⅰ and P62; c) localization of LC3B in hepatocytes of mice in each group detected by immunofluorescence.2.4 饥饿处理导致小鼠肝细胞发生脂噬
透射电镜结果(图4a)显示：0 h对照组小鼠肝细胞胞浆内脂滴主要分布于脉管附近，向外逐渐减少，同时胞浆内伴有大量糖原颗粒沉积；与0 h对照组相比，24和48 h禁食组小鼠肝细胞内糖原数量减少，而脂滴数量和体积增加；与24 h禁食组相比，48 h禁食组小鼠肝细胞内脂滴数量及体积均增加，但几乎没有糖原颗粒。q-PCR结果(图4b)显示：与0 h对照组小鼠相比，48 h禁食组小鼠的肝细胞内脂质代谢关键基因FAT/CD36、HSL和PLIN2的mRNA相对表达量显著升高，但ACACA和GPAM的mRNA相对表达量极显著降低。肝组织自噬相关基因(ATG) mRNA表达水平检测结果(图4c)显示：与0 h对照组相比，48 h禁食组小鼠肝细胞中ATG5、ATG16L2、ATG4D和ATG2A的mRNA相对表达量显著升高。以上结果表明：在饥饿0~24 h过程中，小鼠主要以分解糖原作为主要的能量来源；饥饿24~48 h，小鼠肝脏内储存的糖原量已不能满足小鼠代谢所需，储存于脂肪组织中的脂滴大量转运至肝脏，部分通过肝细胞内的脂肪酶分解，部分通过自噬过程被降解，生成大量游离脂肪酸供肝细胞氧化产生能量。
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图 4 禁食0、24和48 h后小鼠肝脏组织的脂质代谢注：a) 肝组织电镜图，着色均匀处为脂滴(LD)，部分或全部双层膜结构为自噬小体(→)，红色虚线框为糖原颗粒；b) 肝细胞内脂质代谢关键基因mRNA相对表达量；c) 肝细胞内脂噬相关基因mRNA相对表达量。Figure 4. Lipid metabolism of liver tissue in mice after fasting 0, 24 and 48 hoursNote: a) electron microscope images of liver tissue, the areas with uniform staining are lipid droplets (LD), partial or full bilayer membrane structure is autophagosome (→), and glycogen granules are marked by a red dashed box; b) relative expression levels of the lipid metabolism key genes mRNA; c) relative expression levels of lipophagy related genes mRNA in hepatocytes.2.5 饥饿处理激活AMPK信号通路
通过透射电镜观察小鼠肝细胞线粒体状态，对照组(0 h)小鼠线粒体结构完整，形态正常，嵴排列规则，细胞质中有大量糖原储存；而48 h禁食组小鼠肝细胞中能明显观察到线粒体体积普遍增大，发生肿胀，结构异常，嵴变短、紊乱且部分出现断裂，部分受损线粒体被双层膜的自噬体包围，细胞质中糖原颗粒显著减少，并出现脂滴与线粒体贴合分布的现象(图5a)，说明饥饿造成小鼠肝细胞线粒体大量受损，ATP产出率下降。与0 h对照组相比，24和48 h禁食组小鼠线粒体外膜转位酶(TOM20)蛋白的表达水平极显著升高(图5b)；荧光结果(图5c)也显示：随着饥饿时间的延长，线粒体表面TOM20蛋白表达逐渐增加，证实了线粒体自噬的发生。Western-blot检测结果(图6a~b)显示：与0 h对照组小鼠相比，24和48 h禁食组小鼠肝细胞内的P-AMPK/AMPK显著增加，说明饥饿导致肝细胞内线粒体形态发生改变，ATP产出减少，从而激活能量感受器AMPK。此外，编码溶酶体蛋白的DRAM1和DRAM2基因mRNA相对表达水平呈上升趋势(图6c)。Western-blot检测结果(图7a~c)显示：小鼠肝细胞中P-FOXO1/FOXO1相对表达量极显著增加，FOXO1 mRNA相对表达水平也极显著增加，FOXO1被磷酸化激活，证明脂滴通过自噬途径降解生成游离脂肪酸，以供肝细胞氧化产能。
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图 5 禁食0、24和48 h后小鼠肝细胞线粒体形态及TOM20蛋白表达注：a) 肝细胞线粒体形态变化，红色和蓝色实线框包围内容为对应上方图中虚线框局部放大视野；b) 肝组织TOM20蛋白的表达；c) 肝组织TOM20的免疫荧光检测结果。Figure 5. Morphology of mitochondria and TOM20 protein expression of mouse liver tissue in mice after fasting 0, 24 and 48 hoursNote: a) morphological changes of liver cell mitochondria, the contents surrounded by the red and blue solid lines represent the magnified views of the area enclosed by the dashed lines in the figures above; b) TOM20 protein expression in liver tissue; c) TOM20 immunofluorescence detection in liver tissue.![]()
图 6 禁食0、24和48 h后小鼠肝细胞内AMPK的激活情况Figure 6. Activation of AMPK in hepatocytes of mice after fasting for 0, 24 and 48 hours![]()
图 7 禁食48 h后小鼠肝细胞内FOXO1的表达Figure 7. Expression of FOXO1 in mice hepatocytes after fasting 48 hours3. 讨论
自噬通过响应营养感应的信号通路维持饥饿条件下生物机体内的能量稳态，脂质以脂滴的形式在机体内储存多余能量，以应对机体营养的缺乏。本研究将小鼠禁食24~48 h，检测饥饿过程中小鼠肝脏糖脂代谢的变化情况以及因饥饿诱导的自噬应答和相关分子机制，结果显示：饥饿超过24 h后，小鼠机体的主要能量来源由糖和糖原转换为脂肪，启动了脂噬过程。
肝脏能够合成脂质，但不能长期储存，肝细胞内合成的脂质转运至脂肪组织中储存，转运至脂肪组织中的脂肪酸随即酯化形成甘油三酯和胆固醇酯，即脂肪酸在细胞内质网双层膜之间的一个透镜状结构内不断沉积中性脂质，内质网外叶扩张，形成球形细胞器脂滴(LDs)，当中性脂质的体积增加超过了溶解度极限时，LDs便从内质网双分子层中被油化释放[12]。当饥饿导致机体营养缺乏时，细胞内储存的LDs被用于水解出游离脂肪酸，以供机体氧化供能[13]。本研究中，禁食48 h后小鼠肝细胞内存在大量脂滴，脂质分解相关基因的mRNA水平上升，脂肪酸和甘油三酯合成相关基因mRNA水平下降，说明此时机体储存的LDs被大量重新运送至肝细胞中进行分解。但此时糖异生关键基因G6pase和PEPCK的mRNA表达水平仍显著增加，说明脂代谢产生的部分能量仍需依赖于蛋白质的糖异生途径，因此，小鼠肌肉被大量消耗，从而造成随饥饿时间增加，体质量快速持续降低的现象。
既往认为，LDs的分解主要依赖于中性脂肪酶介导的脂解作用，逐步将LDs内的甘油三酯降解为甘油和脂肪酸。2009年，LDs首次被发现能通过自噬降解[14]，抑制自噬能显著增加肝细胞中LDs的数量和体积，肝组织中甘油三酯水平显著升高。之后，这种依赖自噬—溶酶体的LDs降解途径在多种细胞中被证实[15]。LC3B和P62是自噬的标志物。本研究也证实了在饥饿导致小鼠机体营养缺乏时，肝细胞内的自噬标志物LC3B极显著升高，P62显著降低，自噬ATG12-ATG5-ATG16L复合物中ATG16L2和ATG5的mRNA表达水平显著上调，ATG4D和ATG2A的mRNA表达水平也显著上调，表明禁食后小鼠的肝细胞发生自噬。同时，饥饿处理后，肝细胞内大量LDs聚集，并且脂肪代谢相关基因FAT/CD36、HSL和PLIN2的mRNA水平显著升高，脂肪合成相关基因ACACA和GAMP的mRNA水平极显著降低，表明机体在饥饿状态下开始通过脂肪酸氧化供能，肝脏内大量LDs通过自噬过程降解释放游离脂肪酸供机体使用。相关研究也报道了：脂噬发生时，细胞质中的LC3经具有内切酶活性的ATG4剪切后暴露甘氨酸残基，生成定位于胞浆的LC3-Ⅰ[16]，通过ATG7 (E1样酶)和ATG3 (E2样酶)泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺偶联，生成脂质化的LC3-Ⅱ附着于自噬囊泡膜上；同时，负责连接LC3和聚泛素化蛋白的自噬受体P62被包裹进自噬体[17]。ATG2是细胞自噬过程中的脂质转运蛋白，LDs可在ATG2介导的脂质转运过程中被运送至自噬囊泡内[18]。PLIN2属于LDs包被家族，在LDs形成和脂肪细胞分化过程中起到重要的调节作用[19]。脂噬发生时，P62蛋白可在PLIN2的引导下与LDs结合，将LDs封存于自噬体内，随后生成完整的自噬体与溶酶体融合，降解释放出游离脂肪酸[20]。在本研究中，饥饿48 h后小鼠肝细胞中的ATG2A和PLIN2 mRNA水平显著升高，进一步证明了饥饿处理后小鼠肝细胞发生脂噬。
AMPK是调节生物能量代谢的关键分子，已有大量研究证实：饥饿状态下自噬的发生与能量感受器AMPK有关[21]。本研究表明：经过饥饿诱导的小鼠肝细胞内P-AMPK/AMPK比值显著增加，说明AMPK信号通路被激活，由此启动了自噬。对于AMPK的激活，本研究发现：禁食后，小鼠肝细胞内大量线粒体结构改变，且受损线粒体被双层膜结构的自噬体包裹，说明自噬体被大量降解；而肝脏是生物体进行糖脂代谢的主要器官，且主要的产能过程(三羧酸循环、脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化)主要在肝细胞线粒体中进行，线粒体的大量受损和自噬降解，导致三羧酸循环和脂质氧化等途径受阻，ATP产出减少，进而激活AMPK，启动自噬[22]。研究表明：FOXO1可以通过诱导脂肪细胞中PNPLA2的表达调节脂质代谢过程，还通过上调LIPA在机体营养物质耗竭时诱导脂噬发生[23]。已有研究表明：AMPK/FOXO1信号通路的激活可以诱导骨肉瘤细胞发生自噬[24]。在本研究中，饥饿小鼠肝细胞内的FOXO1 mRNA水平和P-FOXO1/FOXO1蛋白相对表达量均极显著增加，说明饥饿处理可能是通过激活AMPK和FOXO1从而导致肝细胞脂肪发生自噬。
4. 结论
本研究将小鼠禁食24~48 h，检测饥饿过程中小鼠肝脏糖脂代谢的变化情况及因饥饿诱导的自噬应答和相关分子机制，结果显示：饥饿超过24 h后，小鼠机体的葡萄糖和糖原被耗尽，主要能量来源转换为脂肪，饥饿处理通过激活AMPK和FOXO1促进储存于小鼠肝细胞内的脂质发生脂噬降解，释放游离脂肪酸氧化供能，以维持饥饿条件下细胞内的能量供应和基础代谢。本研究可为揭示饥饿情况下肝脏脂噬对脂质代谢的调节作用及其关键信号通路奠定基础。
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图 1 禁食对小鼠体质量的影响
注：“**”表示与对照组(0 h)相比差异极显著(P<0.01)；“#”表示48 h禁食组与24 h禁食组相比差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 1. Effects of fasting on the body weigh of mice
Note: “**” indicates significant differences compared with the control group (0 hour) (P<0.01); “#” indicates significant differences between the 48 hours and the 24 hours fasting group (P<0.05); the same as below.
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图 2 禁食对小鼠糖代谢的影响
注：a) 血糖变化。b) 肝糖原(→) PAS染色呈紫色。c) 肝细胞内糖脂代谢关键基因mRNA相对表达量，“*”表示与对照组(0 h)相比差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 2. Effects of fasting on the glucose metabolism of mice
Note: a) changes of the blood glucose. b) PAS staining of glycogen (→) appears purple. c) relative mRNA expression levels of key genes involved in glucose and lipid metabolism, “*” indicates significant differences compared with the control group (0 hour) (P<0.05); the same as below.
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图 3 禁食0、24和48 h后小鼠的肝细胞自噬
注：a)~b) 肝细胞内LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62蛋白的表达；c) 免疫荧光检测各组小鼠肝细胞内的LC3定位。
Figure 3. Occurrence of hepatocyte autophagy in mice after fasting 0, 24 and 48 hours
Note: a)-b) expression of LC3-Ⅱ, LC3-Ⅰ and P62; c) localization of LC3B in hepatocytes of mice in each group detected by immunofluorescence.
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图 4 禁食0、24和48 h后小鼠肝脏组织的脂质代谢
注：a) 肝组织电镜图，着色均匀处为脂滴(LD)，部分或全部双层膜结构为自噬小体(→)，红色虚线框为糖原颗粒；b) 肝细胞内脂质代谢关键基因mRNA相对表达量；c) 肝细胞内脂噬相关基因mRNA相对表达量。
Figure 4. Lipid metabolism of liver tissue in mice after fasting 0, 24 and 48 hours
Note: a) electron microscope images of liver tissue, the areas with uniform staining are lipid droplets (LD), partial or full bilayer membrane structure is autophagosome (→), and glycogen granules are marked by a red dashed box; b) relative expression levels of the lipid metabolism key genes mRNA; c) relative expression levels of lipophagy related genes mRNA in hepatocytes.
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图 5 禁食0、24和48 h后小鼠肝细胞线粒体形态及TOM20蛋白表达
注：a) 肝细胞线粒体形态变化，红色和蓝色实线框包围内容为对应上方图中虚线框局部放大视野；b) 肝组织TOM20蛋白的表达；c) 肝组织TOM20的免疫荧光检测结果。
Figure 5. Morphology of mitochondria and TOM20 protein expression of mouse liver tissue in mice after fasting 0, 24 and 48 hours
Note: a) morphological changes of liver cell mitochondria, the contents surrounded by the red and blue solid lines represent the magnified views of the area enclosed by the dashed lines in the figures above; b) TOM20 protein expression in liver tissue; c) TOM20 immunofluorescence detection in liver tissue.
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图 6 禁食0、24和48 h后小鼠肝细胞内AMPK的激活情况
Figure 6. Activation of AMPK in hepatocytes of mice after fasting for 0, 24 and 48 hours
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图 7 禁食48 h后小鼠肝细胞内FOXO1的表达
Figure 7. Expression of FOXO1 in mice hepatocytes after fasting 48 hours
表 1 禁食对小鼠器官指数的影响
Table 1 Effects of fasting on the organ index of mice
禁食时间/h
fasting time心
heart肝
liver脾
spleen肺
lung肾
kidney脑
brain胸腺
thymus0 0.106±0.011 1.250±0.082 0.052±0.008 0.136±0.020 0.218±0.030 0.378±0.015 0.108±0.005 24 0.116±0.020 0.923±0.110* 0.062±0.016 0.130±0.012 0.234±0.035 0.380±0.014 0.115±0.017 48 0.106±0.032 0.770±0.118** 0.050±0.014 0.158±0.045 0.262±0.048 0.390±0.020 0.140±0.008**## 注： “*”和“**”分别表示与对照组 (0 h) 相比差异显著 (P<0.05) 和极显著 (P<0.01)；“##”表示与24 h禁食组相比差异极显著 (P<0.01)。
Note: “*” and “**” indicate significant differences (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) compared with the control group (0 hour), respectively; “##” indicates extremely significant differences compared with 24 hours fasting group.
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[1] ESMAEILIAN Y, HELA F, BILDIK G, et al. Autophagy regulates sex steroid hormone synthesis through lysosomal degradation of lipid droplets in human ovary and testis[J]. Cell Death & Disease, 2023, 14(5): 342. DOI: 10.1038/s41419-023-05864-3.
[2] OHSUMI Y. Historical landmarks of autophagy research[J]. Cell Research, 2014, 24(1): 9. DOI: 10.1038/cr.2013.169.
[3] XU C C, FAN J L. Links between autophagy and lipid droplet dynamics[J]. Journal of Experimental Botany, 2022, 73(9): 2848. DOI: 10.1093/jxb/erac003.
[4] JUSOVIĆ M, STARIČ P, JOVIČIĆ J E, et al. The combined inhibition of autophagy and diacylglycerol acyltransferase-mediated lipid droplet biogenesis induces cancer cell death during acute amino acid starvation[J]. Cancers, 2023, 15(19): 4857. DOI: 10.3390/cancers15194857.
[5] FAN J L, YU L H, XU C C. Dual role for autophagy in lipid metabolism in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2019, 31(7): 1598. DOI: 10.1105/tpc.19.00170.
[6] CHEN L P, JIN Y, WU J, et al. Lipid droplets: a cellular organelle vital for thermogenesis[J]. International Journal of Biological Sciences, 2022, 18(16): 6176. DOI: 10.7150/ijbs.77051.
[7] LIU M X, XU L, ZHU P F, et al. Two-photon excited red-green “discoloration” bioprobes for monitoring lipid droplets and lipid droplet-lysosomal autophagy[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2023, 11(14): 3186. DOI: 10.1039/D2TB02621J.
[8] CHUNG J, PARK J, LAI Z W, et al. The troyer syndrome protein spartin mediates selective autophagy of lipid droplets[J]. Nature Cell Biology, 2023, 25(8): 1101. DOI: 10.1038/s41556-023-01178-w.
[9] PARK J M, LEE D H, KIM D H. Redefining the role of AMPK in autophagy and the energy stress response[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 2994. DOI: 10.1038/s41467-023-38401-z.
[10] YAO Y, JIA W K, ZENG X F, et al. FAT10 combined with miltefosine inhibits mitochondrial apoptosis and energy metabolism in hypoxia-induced H9C2 cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2022, 2022: 4388919. DOI: 10.1155/2022/4388919.
[11] LU J Y, HUANG J Q, ZHAO S S, et al. FOXO1 is a critical switch molecule for autophagy and apoptosis of sow endometrial epithelial cells caused by oxidative stress[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2021, 2021: 1172273. DOI: 10.1155/2021/1172273.
[12] 史琳娜, 王柯, 邓玉娣, 等. 脂噬对脂质代谢的调节作用及其分子机制[J]. 南方医科大学学报, 2019, 39(7): 867. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.07.19. [13] BOSCH M, SÁNCHEZ-ÁLVAREZ M, FAJARDO A, et al. Mammalian lipid droplets are innate immune hubs integrating cell metabolism and host defense[J]. Science, 2020, 370(6514): 309. DOI: 10.1126/science.aay8085.
[14] EASTMAN S W, YASSAEE M, BIENIASZ P D. A role for ubiquitin ligases and Spartin/SPG20 in lipid droplet turnover[J]. The Journal of Cell Biology, 2009, 184(6): 881. DOI: 10.1083/jcb.200808041.
[15] PU M M, ZHENG W H, ZHANG H T, et al. ORP8 acts as a lipophagy receptor to mediate lipid droplet turnover[J]. Protein & Cell, 2023, 14(9): 653. DOI: 10.1093/procel/pwac063.
[16] AGROTIS A, PENGO N, BURDEN J J, et al. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells[J]. Autophagy, 2019, 15(6): 976. DOI: 10.1080/15548627.2019.1569925.
[17] FRUDD K, BURGOYNE T, BURGOYNE J R. Oxidation of Atg3 and Atg7 mediates inhibition of autophagy[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 95. DOI: 10.1038/s41467-017-02352-z.
[18] NODA N N. Atg2 and Atg9: intermembrane and interleaflet lipid transporters driving autophagy[J]. Biochimica Et Biophysica Acta: Molecular and Cell Biology of Lipids, 2021, 1866(8): 158956. DOI: 10.1016/j.bbalip.2021.158956.
[19] KIMMEL A R, BRASAEMLE D L, MCANDREWS-Hill M, et al. Adoption of PERILIPIN as a unifying nomenclature for the mammalian PAT-family of intracellular lipid storage droplet proteins[J]. Journal of Lipid Research, 2010, 51(3): 468. DOI: 10.1194/jlr.R000034.
[20] FANG C L, LIU S J, YANG W Q, et al. Exercise ameliorates lipid droplet metabolism disorder by the PLIN2-LIPA axis-mediated lipophagy in mouse model of non-alcoholic fatty liver disease[J]. BBA-Molecular Basis of Disease, 2024, 1870(3): 167045. DOI: 10.1016/j.bbadis.2024.167045.
[21] HERZIG S, SHAW R J. AMPK: guardian of metabolism and mitochondrial homeostasis[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19(2): 121. DOI: 10.1038/nrm.2017.95.
[22] LIN S C, HARDIE D G. AMPK: sensing glucose as well as cellular energy status[J]. Cell Metabolism, 2018, 27(2): 299. DOI: 10.1016/j.cmet.2017.10.009.
[23] ZHANG L Q, ZHANG Z G, LI C B, et al. S100A11 promotes liver steatosis via FOXO1-mediated autophagy and lipogenesis[J]. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 2021, 11(3): 697. DOI: 10.1016/j.jcm-gh.2020.10.006.
[24] DAI L N, LI S M, LI X, et al. Propofol inhibits the malignant development of osteosarcoma U2OS cells via AMPK/FOXO1-mediated autophagy[J]. Oncology Letters, 2022, 24(3): 310. DOI: 10.3892/ol.2022.13430.
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