云南松原生质体制备及优化
优化与构建云南松原生质体制备与纯化技术体系，为云南松原生质体培养、融合及瞬时表达体系的建立奠定基础。
以云南松幼苗为试验材料，探索纤维素酶质量分数、离析酶质量分数、甘露醇浓度、真空处理时间、酶解条件和离心条件对云南松针叶原生质体制备的影响。
云南松幼嫩针叶酶解前真空处理是必要的，且先在1.00%纤维素酶+0.80%离析酶+0.3 mol/L甘露醇的酶解液中抽真空10 min，然后在26 ℃、130 r/min条件下酶解4 h，再以180 r/min离心5 min，原生质体产量达5.98×107个/g，活力为72.22%。此外，利用优化的原生质体制备程序，从云南松幼苗的根和茎中制备原生质体，其产量分别为4.35×107和5.27×107 个/g。
本研究以云南松幼苗为试验材料，建立了原生质体制备及优化技术体系，研究结果为云南松体细胞杂交、瞬时表达体系等研究的开展提供了技术支撑。
Preparation and Optimization of Pinus yunnanensis Protoplast
To establish an optimized preparation and purification system of Pinus yunnanensis protoplasts, laying a foundation for the establishment of protoplasts culture, fusion and transient expression system of P. yunnanensis.
Using P. yunnanensis seedlings as the experimental material, the effects of cellulose enzyme mass fraction, macerozyme mass fraction, mannitol concentration, vacuum treatment time, enzymatic hydrolysis conditions, and centrifugation conditions on the preparation of protoplast from P. yunnanensis needles were explored.
It was necessary to vacuum the young P. yunnanensis needles before enzymolysis, and after being vacuumized in the enzymolysis solution of 1.00% cellulase enzyme+0.80% segregation enzyme+0.3 mol/L mannitol for 10 minutes, the enzymolysis was carried out at 26 ℃, 130 r/min for four hours, and then centrifugation at 180 r/min for five minutes, the yield of protoplasts reached 5.98×107 per/g, and the vitality was 72.22%. In addition, the protoplasts were prepared from the roots and stems of P. yunnanensis seedlings by using the optimized protoplast preparation program, and the yields were 4.35×107 and 5.27×107 per/g, respectively.
In this study, the preparation and purification system of the protoplasts of P. yunnanensis is established, which will provide technical support for the studies of somatic hybridization and transient expression system of P. yunnanensis.
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植物原生质体是指通过质壁分离去除细胞壁后剩下的、由单层细胞膜包裹着的、有活力的原生质团[1]，它较易从木质化程度较低的植物组织材料中获得。叶片因易获得和易分解，是制备原生质体常用的理想材料[2]。原生质体无细胞壁的支撑和保护作用，外源大分子物质DNA、质粒、病毒、细胞器等容易摄入，是遗传操作和基因转移的良好材料，也是基因功能验证、亚细胞定位、蛋白互作等研究的理想受体[3-5]。保持活性的原生质体含有细胞的完整遗传信息，不仅可以进行体细胞杂交、细胞融合和突变体筛选培育，还能够克服远缘杂交不亲和的问题[6]。此外，由于具有细胞全能性，原生质体还是进行细胞壁再生、细胞分裂与分化、膜透性及离子转运等研究的基础材料[7]。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)等模式植物中，原生质体分离纯化体系较为成熟且应用广泛，而木本植物原生质体的制备和应用相较于草本植物、农作物、微生物等起步较晚[8]。草本植物因其生长周期短，在原生质体制备、培养等方面较为完善，特别是拟南芥、烟草等模式植物的原生质体，已广泛应用于基因功能研究[9]。木本植物原生质体研究以枣(Ziziphus jujuba)[10]、梨(Scurrula philippensis)[11]、桑树(Morus alba)[12]、茶树(Camellia sinensis)[13]等植物居多，而鲜有针叶森林树种的相关研究[14]。松科(Pinaceae)是裸子植物中最大的一类，且为主要的森林树种，具有重要的生态和经济价值[15]。近年来，随着分子生物学和生物化学的发展，松科松属(Pinus)植物的种质创新、遗传改良、次生代谢途径调控等研究得到快速发展[16]。虽然基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白互作等可以在模式植物(如烟草和拟南芥)的原生质体中异源表达和定位，但可能与本体表达存在差异[17-18]。此外，因植物物种间的基因型、幼嫩程度、细胞壁组成成分等不同，目前尚未建立通用的原生质体分离纯化体系[19]。因此，建立松属植物的原生质体分离纯化体系，对于其种质创新、遗传转化、基因功能验证及挖掘具有重要意义。
云南松(P. yunnanensis)为松科松属常绿乔木，是西南地区荒山造林的先锋树种和重要经济林木[20]。近年来，云南松遗传资源大量流失或消失，对现有遗传资源进行保存或改良尤为重要。云南松生长发育的相关基因功能鉴定及预测已成为研究热点[21-23]，建立高效的云南松原生质体分离纯化体系是进行种质资源改良、亚细胞定位、蛋白互作等研究的前提[24]，但目前未见云南松原生质体制备相关的研究报道，极大限制了云南松种质创新、基因工程等方面的研究。基于此，本研究使用酶解法，以云南松幼苗为试验材料，探究纤维素酶质量分数、离析酶质量分数、甘露醇浓度、真空处理时间、酶解条件和离心条件对原生质体制备的影响，以期为松科植物的体细胞杂交和基因功能研究提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试植物
云南松种子于2020年11月采自云南省宜良县花园林场(24º92′N，103º14′E，海拔
1600 m)，采后于4 ℃冰箱保存备用。种子经始温50 ℃热水热激浸泡48 h后，播种于组培瓶中萌发生长30 d。萌发条件为：温度(23±2) ℃，光照时间16 h/d，光照强度2100 ~2500 lx。试验地点为西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室。1.1.2 主要试剂
纤维素酶(cellulase R-10，CE)和离析酶(macerozyme R-10，MA)购自上海源叶生物科技有限公司(上海)；甘露醇、蔗糖、2-(N-吗啉)乙磺酸一水化合物[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate，MES]、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、固体台盼蓝、氯化钾、氯化钠、二水合氯化钙、磷酸二氢钾、碘化钾、硝酸钾、七水合硫酸镁、五水合硫酸铜、磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)等常规试剂均购自索莱宝科技有限公司(北京)。
1.1.3 供试溶液配制
W5溶液：含4.500 g/L氯化钠、9.190 g/L二水合氯化钙、0.186 g/L 氯化钾、0.213 g/L MES，溶剂为纯水，pH为5.8。
2×CPW缓冲液：含
0.0272 g/L磷酸二氢钾、0.0160 g/L碘化钾、0.1010 g/L 硝酸钾、0.2450 g/L七水合硫酸镁、0.0250 mg/L五水合硫酸铜，溶剂为纯水，pH为5.8。酶解液(现用现配)：在质量分数为1.0%的纤维素酶、质量分数为0.6%的离析酶、0.3 mol/L甘露醇、500 μL 2×CPW缓冲液、21.325 g/L MES、74.550 μg/L氯化钾中加入8 mL纯水，并于55 ℃恒温水中水浴溶解，溶液冷却至室温后加入
0.0147 mg/L二水合氯化钙、3.0000 g/L牛血清蛋白，调节pH至 5.8，加纯水定容至10 mL。0.1%台盼蓝(现用现配)：称取1.0 g台盼蓝，以PBS为溶剂溶解，pH为7.4，定容至1 L。
1.2 试验方法
1.2.1 原生质体的分离
待云南松种子萌发生长至约30 d，挑选长势良好且一致的实生幼苗，分别称取针叶、茎和根各(0.100±0.002) g，用预先灭菌的手术刀快速切成1~2 mm的小段后放入装有酶解液10 mL的离心管中，用锡纸包裹离心管，真空处理后置于不同条件的摇床上进行酶解。酶解结束后，用70 μm的细胞滤网分别过滤根、茎、叶的组织细胞酶解液混合物，得到组织细胞悬液并装入15 mL离心管备用。
1.2.2 不同因素对原生质体分离的影响
预试验发现：云南松幼嫩针叶在1.00%纤维素酶、0.60%离析酶和0.3 mol/L甘露醇的酶解液中真空处理10 min后，以4 h、28 ℃、180 r/min的条件进行酶解，再以180 r/min离心5 min，可以观察到有活力的原生质体。因此，根据预试验结果设计以下试验。
(1) 酶解液中酶的质量分数
① 酶解液中的纤维素酶质量分数设置为0.75%、1.00%、1.25%和1.50%，其他条件同预试验，制备原生质体；② 离析酶质量分数设置为0.60%、0.80%、1.00%和1.20%，纤维素酶质量分数为①中得到的最适质量分数，其他条件同预试验，制备原生质体。
(2) 甘露醇浓度
设置甘露醇浓度为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mol/L，纤维素酶和离析酶质量分数为(1)中得到的最佳质量分数，其他条件同预试验，制备原生质体。
(3) 真空处理时间和酶解条件
预试验发现：未进行真空处理的原生质体产量约为真空处理的1/3，且酶解时间相差约5倍。在(1)、(2)中得到的最适酶解液成分(纤维素酶、离析酶和甘露醇)及预试验离心条件的基础上探讨真空处理和酶解条件对原生质体分离的影响。真空处理时间设置为5、10、15、20和25 min，在5个真空处理时间条件下进行酶解条件(酶解温度、酶解转速、酶解时间)的L16(34)试验，其中酶解温度设置为24、26、28和30 ℃，酶解转速设置为80、130、180和230 r/min，酶解时间设置为3.0、3.5、4.0和4.5 h。
筛选出制备针叶原生质体的最佳条件后，以优化体系对云南松幼嫩根、茎进行原生质体分离与纯化，并对制备效果进行比较和评价。
1.2.3 原生质体的纯化
将1.2.1节得到的组织细胞悬液进行第1次离心，弃去上清液；加入等体积W5溶液进行第2次离心，弃去上清液；加入等体积0.3 mol/L甘露醇溶液进行第3次离心，弃去多余上清液，留下上清液约1.0 mL重悬沉淀，即可得到较为纯净的原生质体悬液。3次离心条件均为：先将离心时间设置为5 min (预试验结果)，探索600、800和
1000 r/min中的最佳转速；得到最佳转速后，在最佳转速下探索3、5、7和9 min中的最佳离心时间。1.2.4 原生质体的产量计算及活力检测
采用血球计数板计算原生质体产量，利用台盼蓝检测法测定细胞活力。取纯化后的原生质体悬液0.9 mL于试管中，再加入0.1%台盼蓝染液0.1 mL混匀，室温避光反应3 min，轻柔摇晃后吸取20 μL滴于血细胞计数板(25×16型)上，盖上盖玻片后在Axio Vision 系统下观察、拍照，并按照公式计算原生质体的产量和活力：原生质体产量=(5个中方格内原生质体总数/80×400×104×稀释倍数)/组织总质量；原生质体活力=(原生质体总数−显蓝色的原生质体数)/原生质体总数×100%。5个中方格指4个角和1个中央的中方格，1个中方格有16个小格，计数遵循计上不计下、计左不计右的原则。每组处理重复3次，每个重复计数3次。
1.3 数据处理与统计分析
采用Excel 2007整理数据；采用SPSS 19.0进行单因素方差分析；采用Origin 21.0制图。数据结果采用“平均值±标准误”表示。
2. 结果与分析
2.1 云南松不同组织原生质体的制备效果
云南松的不同组织在相同条件下进行酶解，其针叶组织细胞悬液绿色较深，茎段组织细胞悬液绿色较浅，根组织细胞悬液呈淡黄色；依次对针叶、茎段、根的染色结果进行观察发现：视野中呈绿色的原生质体逐渐减少，椭圆形细胞也逐渐减少，组织碎片逐渐增多(图1)。因此，在同一制备程序下，云南松实生幼苗针叶的原生质体制备效果优于茎和根，在后续研究中对针叶原生质体制备条件进行优化。
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图 1 云南松不同组织的原生质体制备效果注：a) 酶解后的原生质体悬液，从左到右依次为叶、茎、根；b)~d) 分别为叶、茎、根原生质体染色结果，红色箭头指示有活力的原生质体，白色箭头指示无活力的原生质体。Figure 1. Effects of protoplast preparation from different tissues of Pinus yunnanensisNote: a) protoplast suspension after enzymatic digestion, showing leaves, stems, and roots from left to right; b)-d) staining results of protoplasts from leaves, stems, and roots, respectively, with red arrows indicating viable protoplasts, and white arrows indicating non-viable protoplasts.2.2 酶质量分数对针叶原生质体产量和活力的影响
由图2a可知：在0.60%离析酶处理下，随着纤维素酶质量分数的升高，原生质体的产量和活力先升高后降低，当纤维素酶质量分数为1.00%时，产量达到最大值，为7.09×107个/g，活力为61.37%；当纤维素酶质量分数为1.25%时，活力达到最大值，为65.01%，产量为6.11×107个/g。因此，1.00%纤维素酶为制备原生质体的最适质量分数。由图2b可知：在1.00%纤维素酶处理下，随着离析酶质量分数的升高，原生质体产量呈先升高后降低的趋势，活力呈锯齿形变化，当离析酶质量分数为0.80%时，产量和活力都达到最大值，分别为5.71×107个/g和75.27%。综上所述，1.00%纤维素酶和0.80%离析酶的组合为云南松针叶原生质体制备的较适酶解体系。
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图 2 酶质量分数对针叶原生质体产量和活力的影响注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。Figure 2. Effects of enzyme mass fraction on the yield and vitality of needles protoplastsNote: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below.2.3 甘露醇浓度对针叶原生质体产量和活力的影响
由图3可知：甘露醇浓度过高或过低都会显著影响原生质体的活力。当甘露醇浓度为0.2和0.6 mol/L时，原生质体活力较低，约为50%，且这2个处理间差异不显著；随着甘露醇浓度的增加，原生质体产量呈先升高后降低的趋势，为4×107~6×107个/g；当甘露醇浓度为0.3 mol/L时，原生质体产量最高，为5.88×107个/g。
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图 3 甘露醇浓度对针叶原生质体产量和活力的影响Figure 3. Effects of mannitol concentration on the yield and vitality of needles protoplasts2.4 真空处理时间及酶解条件对针叶原生质体产量的影响
由图4可知：随着真空处理时间的延长，原生质体产量呈下降趋势，5~15 min是制备原生质体较适宜的真空处理时间，而真空处理25 min不利于原生质体的制备；当真空处理时间一定时，3.5和4.0 h是较适宜的酶解时间；当真空处理时间为10 min，酶解时间为3.5 h时，原生质体产量随着酶解温度和转速的升高而升高；当真空处理时间为10 min，酶解时间为4.0 h时，原生质体产量随着酶解温度和转速呈先升高后降低的趋势，在酶解温度26 ℃、转速130 r/min时达到最大值，为7.07×107个/g。综上所述，酶解前真空处理10 min，以26 ℃、130 r/min酶解4 h，原生质体的产量可达最大值。
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图 4 真空处理及酶解条件对针叶原生质体产量的影响Figure 4. Effects of vacuum treatment and enzymatic hydrolysis conditions on the protoplasts yield of needles2.5 离心时间及速度对针叶原生质体纯化的影响
由图5a可知：随着离心时间的增加，原生质体产量呈先升高后降低的趋势，离心5 min时，其产量(5.88×107个/g)和活力显著高于其他处理。由图5b可知：随着离心速度的增加，原生质体产量呈先升高后降低的趋势；当离心速度为800 r/min时，其产量(5.75×107个/g)和活力(72.98%)显著高于其他处理；当离心速度升至
1000 r/min时，原生质体活力较800 r/min时降低了约10%。综上所述，纯化过程中800 r/min、离心5 min是原生质体纯化的最佳条件。![]()
图 5 离心条件对针叶原生质体产量和活力的影响Figure 5. Effects of centrifugal conditions on the yield and vitality of needles protoplasts2.6 优化体系对根、茎原生质体制备效果评价
由图6a可知：对云南松幼嫩根、茎进行原生质体分离与纯化，其产量分别为4.35×107和5.27×107个/g，均显著低于叶的产量(5.98×107个/g)，且根的产量显著低于茎的产量。由图6b可知：根、茎的原生质体活力分别为67.69%和69.83%，均低于针叶原生质体活力(72.22%)，且根原生质体活力显著低于叶。可见，本研究建立的原生质体制备及优化技术体系为云南松不同组织的原生质体分离纯化提供了可行方案。
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图 6 不同组织原生质体制备效果比较注：“*”表示差异显著(P<0.05)；ns表示无显著差异。Figure 6. Comparison of protoplast preparation effects from different tissuesNote: “*” indicates significant differences (P<0.05); ns indicates no significant difference.3. 讨论
3.1 酶解液成分对植物原生质体制备的影响
采用酶解法高效分离、纯化大量有活力的植物原生质体，受到多种因素的影响，其中，酶解液的酶种类及浓度、渗透压调节剂等是影响植物原生质体产量和活力的关键因素[25]。通常根据不同植物材料使用不同浓度配比的纤维素酶、离析酶、果胶酶和半纤维素酶中的2~3种进行酶解[26]。在酶解过程中，若酶浓度过低，可能酶解不完全，原生质体聚集成团；若浓度过高，原生质体破裂，活性不高[27]。以1.5%纤维素酶+0.3%离析酶+0.5%果胶酶的酶解液组合分离茶树(Camellia sinensis)叶片原生质体的效果最好[28]；以1.50%纤维素酶+0.75%果胶酶是酶解柳枝稷(Panicum virgatum)的最适组合[29]；使用不同质量分数的纤维素酶、离析酶和半纤维素酶组合处理梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝，结果发现：0.4%离析酶R-10+1.0%纤维素酶R-10是分离其原生质体的最优酶解组合[30]；对马铃薯(Solanum tuberosum)叶片原生质体的研究表明：纤维素酶和离析酶的酶解作用大于果胶酶[31]。本研究采用的云南松幼苗较为幼嫩，细胞壁去除相对容易，综合考虑成本等因素，选择纤维素酶和离析酶进行酶解，结果表明：与其他组织相比，针叶分离得到的原生质体产量和活力都较高。适宜的酶解液渗透压能维持原生质体活性和质膜稳定性，使酶和底物的结合更充分[32]。常用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇等作为分离原生质体的渗透压稳定剂[33]。在萱草(Hemerocallis fulva)原生质体的分离中，与甘露醇相比，蔗糖和葡萄糖作为渗透压调节剂时制得的原生质体产量较低[34]。在本研究中，当甘露醇浓度为0.3 mol/L时，分离的原生质体产量高达5.88×107个/g，活力达62.86%，与拟南芥[35]、杨树[36]和茶树[13]原生质体分离时的最适甘露醇浓度相差不大。此外，酶解液中的其他因素也会影响原生质体制备的效率，如酶解液的pH、pH稳定剂、牛血清蛋白等，这些因素在优化研究中值得进一步探索。
3.2 酶解条件对植物原生质体制备的影响
酶解前是否对材料进行预处理以及酶解条件对原生质体的分离效果有重要影响。对于叶面积较大且叶表皮易去除的组织材料，通常通过撕去叶片表皮，使叶肉细胞与酶解液充分接触，从而缩短酶解时间，提高原生质体的获得率[37]。在酶解前进行抽真空处理，也可提升酶解效率。在分离菊花(Chrysanthemum morifolium)花瓣和叶片的原生质体过程中，酶解前抽真空5 min，原生质体的产量相较于其他处理提高了579倍和14倍；与抽真空20 min处理相比，抽真空30 min处理获得的原生质体数量减少约40%[25]。在本研究的前期试验中，酶解前未进行抽真空的处理，能观察到原生质体的酶解时间至少为20 h；而进行真空处理后，酶解时间为原来的1/5，原生质体产量相差3倍。酶解时间随物种不同有较大差异，在木本植物中，酶解时间为3~24 h不等，随着原生质体制备方法的优化，酶解时间逐渐缩短[38]。在本研究中，真空处理、酶解温度及摇床转速一定时，原生质体产量随酶解时间的延长呈先升高后降低的趋势。酶解时振荡与否或摇床转速也会对原生质体的制备效率产生重要影响。在制备杜鹃(Rhododendron simsii)原生质体时，使用静置、振荡、静置与振荡相结合的方式进行酶解，酶解时间长达14 h，产量也较低[39]。与原生质体制备相关的纤维素酶、离析酶、果胶酶等，较适宜的反应温度为40~50 ℃，但一般植物材料最高耐受温度为35 ℃，所以酶解温度一般选择在35 ℃以下。本研究发现：酶解温度为24~30 ℃时，对原生质体产量的影响不大，这可能是酶解温度变化梯度不大或温度变化在云南松耐受温度范围内，在后续研究中需进一步优化。
3.3 分离材料对植物原生质体制备的影响
分离材料是影响植物原生质体分离效率的重要因素，有研究认为：选择合适的材料可以显著影响原生质体的制备效果[40]。材料的木质化程度、生理状态等均会影响原生质体分离的效果。使用相同制备条件分离和纯化同一材料、不同组织的原生质体，结果显示：兰花原生质体产量的顺序为叶基>根>嫩叶>花蒂[4]；茶树原生质体的产量和活力为嫩叶>根>枝条[28]。使用相同制备条件分离和纯化不同材料、同一组织的原生质体，结果显示：紫风车菊花花瓣的原生质体产量和活力均大于帝王水晶菊花花瓣[25]。本研究发现：幼嫩针叶制备的原生质体，其产量和活力均优于根和茎，这与对杉木(Cunninghamia lanceolata)的研究结果一致[41]。在后续研究中，可以利用建立的原生质体制备体系分离不同生长环境及不同幼嫩程度的云南松组织。
4. 结论
本研究以云南松幼苗为试验材料，通过探索原生质体制备的关键影响因素，建立了云南松原生质体制备及优化的技术体系。云南松幼嫩针叶原生质体的制备方法为：先置于1.00%纤维素酶+0.80%离析酶+0.3 mol/L甘露醇的酶解液中抽真空10 min，然后以4 h、26 ℃、130 r/min的条件进行酶解，再用180 r/min离心5 min，原生质体产量达5.98×107个/g，活力为72.22%。利用该技术体系可以为后续云南松原生质体培养、融合及瞬时表达体系等研究提供重要技术支撑。
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图 1 云南松不同组织的原生质体制备效果
注：a) 酶解后的原生质体悬液，从左到右依次为叶、茎、根；b)~d) 分别为叶、茎、根原生质体染色结果，红色箭头指示有活力的原生质体，白色箭头指示无活力的原生质体。
Figure 1. Effects of protoplast preparation from different tissues of Pinus yunnanensis
Note: a) protoplast suspension after enzymatic digestion, showing leaves, stems, and roots from left to right; b)-d) staining results of protoplasts from leaves, stems, and roots, respectively, with red arrows indicating viable protoplasts, and white arrows indicating non-viable protoplasts.
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图 2 酶质量分数对针叶原生质体产量和活力的影响
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 2. Effects of enzyme mass fraction on the yield and vitality of needles protoplasts
Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below.
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图 3 甘露醇浓度对针叶原生质体产量和活力的影响
Figure 3. Effects of mannitol concentration on the yield and vitality of needles protoplasts
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图 4 真空处理及酶解条件对针叶原生质体产量的影响
Figure 4. Effects of vacuum treatment and enzymatic hydrolysis conditions on the protoplasts yield of needles
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图 5 离心条件对针叶原生质体产量和活力的影响
Figure 5. Effects of centrifugal conditions on the yield and vitality of needles protoplasts
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