猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以呕吐、水样腹泻、脱水和生长缓慢为主要特征的急性、高度接触性传染病^[1]。PEDV是有囊膜的单条正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，包括1个5'非编码区(untranslated region，UTR)、1个3'UTR以及7个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N)^[2]。其中，ORF3蛋白基因长度为675 bp，是PEDV粒子中的非结构蛋白，分子质量为25.3 ku；它是PEDV基因组中唯一的辅助蛋白，也是病毒的通道蛋白，与病毒的毒力有关，能够影响病毒复制^[3]。ORF3蛋白还可通过延长细胞周期的S期、抑制早期细胞凋亡和促进自噬来调节细胞周期进程，从而为病毒繁殖提供适当的环境^[4-5]。近年来，随着毒株的遗传变异，ORF3基因出现突变、天然截短和翻译中断等现象，且不同毒株之间存在差异^[6-7]。膜糖蛋白(membrane glycoproteins，M)基因长度为681 bp，可翻译226个氨基酸，分子质量为27~32 ku，其保守性和结构稳定性很高，常被用于设计引物以检测PEDV^[8]。PEDV M蛋白是一种重要的结构蛋白，与病毒复制、感染和组装有关^[9-10]。

为进一步了解PEDV在云南的流行及演变情况，本研究于2022—2023年，从云南多个疑似暴发PED的猪场采集病料样品125份，采用RT-PCR法检测样品中是否存在PEDV；对PEDV阳性样品进行测序分析，构建M和ORF3基因的遗传进化树，旨在了解病毒的流行和遗传进化情况，为该病的防控提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   病料收集与贮存

2022年8月—2023年7月，从云南省禄劝彝族苗族自治县(以下简称“禄劝县”)、永平县、凤庆县、大理市和曲靖市9个暴发仔猪腹泻病的猪场采集发病仔猪小肠组织样品、粪便或肛拭子共125份。取适量样品于5 mL无菌离心管中，将样品与无菌PBS溶液按1∶5 (V∶V)充分混匀后置于−80 ℃反复冻融3次，12000 r/min离心10 min，取上清分装于新的离心管中，加入1%双抗，一部分用于提取RNA；另一部分冻存用于后续试验。

1.2   主要试剂

TransZol UP RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Super HiFi PCR Mix (KT212)、DL2000 DNA Marker、DL3000 DNA Marker、核酸染料、cDNA 第1链合成预混试剂盒等购自北京天根生化有限公司。

1.3   引物合成及PCR扩增

根据表1合成引物，将样品提取RNA后反转录为cDNA，用针对猪传染性胃肠炎病毒(porcine infectious gastroenteritis virus，TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine delta coronavirus，PDCoV)和PEDV M基因的引物进行PCR扩增，取PCR产物7 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，符合预期大小的样品送至上海生工有限公司进行测序。确定为PEDV M阳性的样品，用针对PEDV ORF3基因的引物进行扩增并测序。

表  1  供试引物序列

Table  1.  Primer sequences for test

引物名称 primer name	引物序列 (5'→3') primer sequence	片段长度/bp fragment length	退火温度/ ℃ annealing temperature	参考文献 references
PEDV M	F：AACGGTTTTATTCCCGTTGAT	663	55	[11]
	R：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATT
TGEV	F：TTACAAACTCGCTATCGCATGG	528	55	[11]
	R：TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC
PoRV	F：CCCCGGTATTGAATATACCACAGT	333	55	[11]
	R：TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT
PEDV ORF3	F：TCCTAGACTTCAACCTTACG	833	55	[12]
	R：GGTGACAAGTGAAGCACAGA
PDCoV	F：TCGGGAGCTGACACTTCTATTA	564	49	[13]
	R：GGTCTGGTTAACGACCGTATTG
注：PEDV. 猪流行性腹泻病毒，TGEV. 猪传染性胃肠炎病毒，PoRV. 猪轮状病毒，PDCoV. 猪德尔塔病毒；下同。 Note: PEDV. porcine epidemic diarrhea virus, TGEV. porcine infectious gastroenteritis virus, PoRV. porcine rotavirus, PDCoV. porcine delta corona virus; the same as below.

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1.4   序列比对及分析

将测序结果与GenBank中的相关序列(表2)进行比对，并将比对正确的毒株按照采集地、样品类型、日期进行命名。采用DNAstar软件对测序结果进行拼接；采用生物学软件Megalign分析序列同源性，并对核苷酸和氨基酸序列突变点进行统计分析；采用MEGA 11构建遗传进化树。

表  2  PEDV参考毒株

Table  2.  References strains of PEDV

序号 serial number	名称 name	登录号 accession No.	分离国家及年代 separation of countries and years
1	VNJFP1013-1	KJ960178.1	越南，2013 Vietnam
2	USA Minnesota271-2014	KR265813.1	美国，2014 United States
3	USA Iowa16465 2013	KF452322.1	美国，2013 United States
4	OH851	KJ399978.1	美国，2014 United States
5	MEX1242014	KJ645700	美国，2014 United States
6	LZC	EF185992.1	中国，2006 China
7	LC	JX489155.1	中国，2011 China
8	KNU-1406-1	KM403155.1	韩国，2014 Korea
9	JS2008	KC109141.1	中国，2012 China
10	GD S07	MH726370.1	中国，2018 China
11	GD-A	JX112709	中国，2012 China
12	CV777	AF353511.1	比利时，1988 Belgium
13	CH-YNKM-8 2013	KF761675	中国，2013 China
14	CH-S	JN547228.1	中国，2011 China
15	CHHB 2012	KC189944.1	中国，2011 China
16	CH ZMD ZY11	KC196276.1	中国，2012 China
17	AJ1102	JX188454.1	中国，2011 China
18	DR13	JQ023162.1	韩国，2011 Korea
19	SM98	GU937797.1	韩国，2010 Korea
20	83P-5	AB618618.1	日本，2011 Japan

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2.   结果与分析

2.1   PEDV检测及M基因扩增

由图1和表3可知：在检测的125份样品中，检出49份PEDV阳性样品(663 bp)，阳性率为39.2%；PoRV阳性样品14份(333 bp)，阳性率为11.2%；PoRV与PEDV混合感染率为10.4% (13/125)，未检测出TGEV和PDCoV。对符合目的基因大小的PCR产物进行测序，结果与Genebank上的参考序列进行比对分析，比对正确的毒株分别为：YNLPF2-1、YNLPF2-8和YNLPF2-15 (罗平县肛拭子)；YNQJF4-1、YNQJF4-3、YNQJF4-6、YNQJF4-7和YNQJF4-9 (曲靖市粪样)；YNDLF6-1 (大理市粪样)；YNDLC7-6和YNDLC7-8 (大理市肠样)。

图  1  PCR产物电泳结果

注：M1. DL3000 Marker；M2. DL2000 Marker；N. 阴性对照；P. 阳性对照；1~6. 部分猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品；7~8. 猪轮状病毒(PoRV)阳性样品。

Figure  1.  Electrophoresis results of PCR products

Note: N. negative control; P. positive control; 1-6. part of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)-positive samples; 7-8. porcine rotavirus (PoRV)-positive samples.

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表  3  PCR检测结果

Table  3.  Detection results of PCR

样品采集地 sample collection site	采集日期 (yyyy-mm-dd) collection date	样品数 number of samples	样品类型 sample type	阳性数 number of positives
				PEDV	PoRV	TGEV	PDCoV
永平县 Yongping County	2022-08-28	12	粪样 fecal samples	0	0	0	0
禄劝县 Luquan County	2022-10-12	13	粪样 fecal samples	0	0	0	0
永平县 Yongping County	2022-11-07	10	粪样 fecal samples	0	0	0	0
曲靖市 Qujing City	2022-12-05	14	粪样 fecal samples	0	0	0	0
凤庆县 Fengqing County	2022-12-22	27	肛拭子 anorectal swabs	3	0	0	0
罗平县 Luoping County	2023-02-16	15	肛拭子 anorectal swabs	12	3	0	0
曲靖市 Qujing City	2023-04-06	10	粪样 fecal samples	10	3	0	0
大理市 Dali City	2023-06-06	14	粪样 fecal samples	14	8	0	0
大理市 Dali City	2023-07-03	10	小肠 small intestine	10	0	0	0
合计 total		125		49	14	0	0

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2.2   PEDV ORF3基因片段的扩增

PEDV M阳性样品的ORF3基因引物扩增和电泳检测结果显示：得到长833 bp的片段，符合预期目的(图2)。

图  2  PEDV ORF3基因扩增电泳结果

注：M. DL3000 Marker；N. 阴性对照；P. 阳性对照；1. PEDV阴性样品ORF3基因扩增；2~13. PEDV阳性样品ORF3基因扩增。

Figure  2.  Electrophoresis results of PEDV ORF3 gene amplification

Note: N. negative control; P. positive control; 1. ORF3 gene amplification of PEDV-negative sample; 2-13. ORF3 gene amplification of PEDV-positive samples.

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2.3   PEDV M基因和ORF3基因的生物信息学分析

2.3.1   PEDV M基因的遗传进化分析

PEDV M基因序列的进化树(图3)显示：10株云南流行毒株同属GⅡ型。其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株亲缘关系较近；其余8株与GD S07亲缘关系较近，与GⅠ型CV777、DR13、SM98等疫苗株的亲缘关系较远。同源性分析结果显示：云南流行株M基因的核苷酸同源性为96.9%~100.0%，与国内外参考流行株的核苷酸同源性为96.2%~99.8%，与经典疫苗株CV777和DR13的同源性分别为97.1%~98.1%和96.9%~97.9%，与美国代表毒株OH851的同源性为98.1%~99.5%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为97.6%~99.7%和97.4%~99.5%。10株M基因氨基酸序列与参考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的比对结果显示：云南流行株有6个氨基酸突变位点，分别是第24位(C→R)、第53位(F→S)、第56位(T→I)、第76位(I→T)、第162位(T→M)和第183位(Q→P)，未出现氨基酸插入及缺失现象。

图  3  PEDV M基因的遗传进化树

注：●为本研究PEDV阳性样品扩增的基因；下同。

Figure  3.  Genetic and phylogenetic tree of PEDV M gene

Note: ● indicate the genes amplified from the PEDV-positive sample in this study; the same as below.

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2.3.2   PEDV ORF3基因遗传进化分析

PEDV ORF3基因序列进化树(图4)显示：10株云南流行毒株同属GⅡ型。其中，YNQJF 4-3和YNQJF 4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株以及越南株VN-JFP1013亲缘关系较近；其余8株与GD S07亲缘关系较近，与经典疫苗株CV777、DR13等亲缘关系较远。同源性分析结果显示：云南流行株ORF3基因的核苷酸同源性为95.6%~100.0%，与国内外参考流行株的核苷酸同源性为89.3%~99.6%，与经典疫苗株CV777和JS2008的同源性分别为96.3%~96.7%和89.3%~90.2%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为95.9%~98.8%和95.9%~99.1%。

图  4  PEDV ORF3基因的遗传进化树

Figure  4.  Genetic and phylogenetic tree of PEDV ORF3 gene

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2.3.3   PEDV ORF3蛋白氨基酸序列分析

将PEDV ORF3基因片段序列翻译为蛋白氨基酸序列，与经典疫苗株CV777、DR13和JS2008的ORF3蛋白氨基酸序列进行比对，结果显示：与CV777相比，10株毒株在第21位点(A→V)、第54位点(V→I)、第79位点(V→I)、第101位点(A→T)和第166位点(N→S)发生氨基酸突变；YNQJF4-3和YNQJF4-7在第168位点(D→N)、第25位点(D→L)、第70位点(I→V)和第107位点(C→F)发生氨基酸突变；YNDLC7-6、YNDLC7-8、YNDLF6-1、YNLPF2-1、YNLPF2-8、YNLPF2-15和YNQJF4-9在第182位点(H→Q)发生氨基酸突变；无氨基酸插入或缺失现象。与DR13和JS2008的ORF3蛋白氨基酸序列进行比对，结果显示：10株毒株均未出现氨基酸连续大片段缺失的现象。

3.   讨论

猪流行性腹泻于1971年在英国首次被报道，之后迅速在欧洲甚至亚洲蔓延，给世界养猪业造成巨大的经济损失^[14-15]。由于PEDV毒株易发生变异，导致现有疫苗免疫效果不佳，因此，有必要通过流行病学调查监测新出现的流行株，从而及时研发针对性的疫苗用于有效防控^[16-17]。本研究采集云南省部分地区9个猪场共125份小肠、粪便和肛拭子样品进行检测，结果显示：有49份PEDV阳性样品，14份PoRV阳性样品，PEDV与PoRV混合感染率为10.4%，未检测出TGEV和PDCoV。可见，PEDV仍是云南省新生仔猪肠道疾病的主要病原，迫切需要研制新型有效的疫苗来防治PEDV的变异情况^[14]。

对PEDV M基因进行遗传进化分析及同源性分析，结果表明：10株云南流行毒株均属于GⅡ型，其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7与中国的AJ1102、GD-A、LC株亲缘关系较近，其余8株与GD S07亲缘关系较近，与GⅠ型CV777、DR13、SM98等疫苗株的亲缘关系较远，现有疫苗可能无法完全覆盖云南省流行的PEDV毒株，从而影响疫苗的免疫效果。10株云南流行株M序列的核苷酸同源性为96.9%~100.0%，表明这些毒株在遗传上具有较高的相似性；与国内外参考流行株的核苷酸同源性为96.2%~99.8%，与经典疫苗株CV777和DR13的同源性分别为97.1%~98.1%和96.9%~97.9%，与GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中国株AJ1102的同源性分别为97.6%~99.7%和97.4%~99.5%，提示PEDV可能存在跨国流传的现象。10条云南流行株与参考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的M基因氨基酸序列有6个氨基酸突变位点，但未出现氨基酸插入及缺失现象，整体上M基因序列较保守，与已有研究结果^[18-19]一致。尽管M基因序列整体上比较保守，但这些突变位点可能影响病毒的生物学特性或免疫逃避能力，仍然需要引起关注，可能在未来成为疫苗研发或抗病毒药物设计的潜在靶点。

10株云南流行株ORF3序列的核苷酸同源性为95.6%~100.0%，与国内外参考毒株的核苷酸同源性为89.3%~99.6%；氨基酸序列主要有5个氨基酸突变位点，无氨基酸插入或缺失现象。研究表明：ORF3基因是否发生17个氨基酸缺失是区别野生型和弱毒株的关键分子特征，且与病毒的毒力和致病性密切相关^[20]。本研究中，PEDV 毒株的ORF3序列氨基酸未观察到疫苗株大片段缺失的特征，提示其为强毒株。

本研究揭示了云南省部分地区流行的PEDV遗传特征和流行状况，为了解PEDV的流行病学和致病机制提供了新视角。研究样本采自云南省部分地区的9个猪场，样本量相对有限且地域覆盖范围不够广泛，可能无法完全代表云南地区乃至全国的PEDV流行状况，未来的研究仍需进一步扩大样本量。此外，本研究主要关注了M基因和ORF3基因的遗传进化特征，而PEDV的其他基因片段也可能对病毒的生物学特性和致病机制有重要影响。因此，未来的研究需要综合考虑PEDV的全基因组特征，以更全面地理解其遗传多样性和致病机制。

4.   结论

云南流行的PEDV是以GⅡ型为主的强毒株，与中国其他地方流行的毒株亲缘关系密切，急需研制针对变异株的疫苗，降低其带来的经济损失。