不同介质、温度对中华鳖胚胎发育与幼鳖形态特征及运动机能的影响
探究介质和温度对中华鳖胚胎发育、初生幼鳖形态特征及运动机能的影响，优化孵化环境参数，为人工繁育和种质资源保护工作提供理论依据与技术参考。
通过正交试验设置了3组温度(28、30、32 ℃)和3种介质(蛭石、沙子、无介质)，采用双因素方差分析温度和介质对中华鳖孵化率、孵化期、幼鳖质量、背甲长、背甲宽、背甲高和游泳速度的影响。
随着温度的升高，孵化率显著升高(P<0.05)，孵化期显著缩短(P<0.05)；幼鳖质量、背甲长和游泳速度均显著提升(P<0.05)。孵化介质对孵化率、幼鳖质量、背甲长、背甲宽、背甲高和游泳速度均产生显著影响(P<0.05)，且蛭石组的上述指标均显著高于其他组(P<0.05)。介质和温度的交互作用对幼鳖质量和游泳速度有显著影响(P<0.05)。
温度为32 ℃、蛭石作为孵化介质时，中华鳖孵化率最高，孵化期最短，孵出的幼鳖个体相对较大，并表现出较强的运动机能。
Effects of Different Mediums and Temperatures on Embryonic Development, Morphological Characteristics and Motor Function of Larval Pelodiscus sinensis
To explore the effects of different mediums and temperatures on the embryonic development, morphological characteristics and motor function of larval Pelodiscus sinensis, and to optimize incubation environment parameters, providing theoretical basis and technical reference for artificial breeding and germplasm resources protection.
Three groups of temperatures (28, 30, 32 ℃) and three medium environments (vermiculite, sand and no medium) were set up by orthogonal test, and the effects of temperatures and mediums on incubation rate, incubation period, larval weight, carapace length, carapace width, carapace height, and swimming speed of P. sinensis were analyzed by two-way ANOVA.
As the temperature increased, the incubation rate significantly increased (P<0.05), the incubation period significantly shortened (P<0.05), and the larval weight, carapace length, and swimming speed all significantly increased (P<0.05). The incubation medium had significant effects on incubation rate, larval weight, carapace length, carapace width, carapace height and swimming speed (P<0.05); among them, the above indexes of the vermiculite group were significantly higher than other groups (P<0.05). The interaction between temperature and medium had significant effects on the larval weight and swimming speed of P. sinensis (P<0.05).
When incubating P. sinensis, the temperature sets at 32 ℃, and vermiculite is used as the incubation medium, the incubation rate is the highest, the incubation period is the shortest, and the incubating individual is relatively larger and shows stronger motor function.
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Keywords:
- Pelodiscus sinensis /
- temperature /
- medium /
- embryonic development /
- interaction
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玉米是世界上总产量最高的粮食和饲料作物[1]，在中国玉米的种植面积和产量均占主要粮食作物的30%以上[2]。种子的质量优劣直接影响了农业生产的成效，种子活力(seed vigor)是种子最重要的质量指标之一，高活力的种子具有明显的生长优势和生产潜力，能确保田间快速整齐一致的出苗，能影响作物在田间整齐一致的生长发育，影响最终收获的产量和质量[3]，尤其是在机械单粒播种越来越普及的区域，种子活力已成为最重要的种子质量指标[4]。筛选出高质量、高活力的种子满足农业生产的需要，对企业或农民都具有非常重要的意义。玉米种子活力测定大多采用种子发芽试验中的一些参数和指标，采用低温发芽试验和加速老化试验等实验室测定的方法，这些检测和评价的方法多与种子生理发芽指标和潜在的生理指标有关，测定程序较为复杂且时间较长，至少需要7~10 d[5-6]。近年来，随着光学技术的发展，高光谱成像作为一种无损、快速的种子质量和安全性评估方法，广泛应用于检测萝卜[7]、青椒[8]、西瓜[9]和玉米[10]种子的活力水平，但目前尚无成熟可商用的种子活力光学检测装备，且光学检测的技术成本较高。
种子生活力(seed viability)是指种胚潜在的发芽能力和种胚所具有的生命力，四唑染色法是其快速测定方法之一。四唑(2,3,5-三苯基氯化四氮唑，TTC或TZ)可被种子中活细胞的脱氢酶还原生成稳定的、不溶于水、不挥发的红色甲臜类物质，使活组织和细胞呈现红色，而种子中的死细胞由于缺乏脱氢酶则不会被染色，而呈现白色，同时根据染成红色的深浅程度表明种子生活力的高低。四唑法测定种子生活力由国际种子检验协会(ISTA)于1953年列入国际种子检验规程，是世界公认的最有效的种子生活力的测定方法[11]，被广泛应用于各种农作物、园艺和其他种子的生活力测定[12-15]。FRANÇA-NETO等[15]提出种子四唑染色后，依据染成红色的深浅程度以及种胚或组织染色结构来区分种子活力水平，把种子分为A (活力高)、B (有活力但活力低)、C (无活力水平) 三级，并把大豆种子分为1~5级有活力和6~8级无活力。徐本美等[16]利用TTC定量法测定不同作物种子的活力，并提取生成的红色甲臜类物质，利用分光光度计比色确定种子的活力，结果表明：在一般情况下TTC染色法测定种子活力是准确和可靠的；赵新子等[17]采用计算机图像处理与识别测定种子活力，计算机检测结果对四唑染色法人工测定结果准确度达93.7%以上。PEREIRA等[18]将光学和TTC染色法结合，通过计算机采集TTC染色后大豆种子的图像特征，并建立了一套有效的大豆种子活力分类等级。本试验尝试研究利用TTC染色图像测定和评价玉米种子活力水平的可能性，试图找到一种准确可靠、快速简便、重复性高、成本低廉以及与田间出苗率相关的玉米种子活力测定方法，以供种业公司、种子质量检验站和其他人员在快速测定玉米种子活力时使用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
玉米种子为正大619杂交种子，由云南正大种子有限公司2013、2014和2015年生产，2016年夏季收到种子后于4 ℃冰箱贮藏，试验时间为2018年3—9月。
1.2 方法
1.2.1 玉米种子四唑染色
玉米种子室温下预先浸湿16 h，沿胚纵切，留取其中一半，另一半舍去，保证留下的一半种子中包含种胚的各部分，且完整暴露出来。切好的种子置于小烧杯中，加入0.1%的TTC溶液(上海馨晟试化工科技有限公司生产)浸没，35 ℃避光染色6 h。染色结束后滤去溶液，清水清洗2次备用。每处理100粒种子，4次重复。
1.2.2 数码显微镜对四唑染色玉米种胚主要结构图像采集
开启数码显微镜Smart Zoom 5 (德国卡尔·蔡司股份有限公司)，将染色后的玉米种子放置到数码显微镜的载物台上，固定种子种胚使其切面朝上，将显微镜放大34倍并拍下种胚的图像，观察鉴定种胚中各主要结构的染色深浅，以RGB颜色模式为标准，划分为染色深、染色浅和未染色3个等级：当种胚颜色为珊瑚色(R：255；G：127；B：80)或深于珊瑚色时，判定种子染色深；当种胚颜色浅于珊瑚色时，判定种子染色浅。
1.2.3 种胚结构染色面积测定和染色面积划分
利用Smart Zoom 5的面积测量工具，分别测量种胚各结构[胚芽、胚轴、胚根和盾片(子叶)]未染色的面积以及种胚的总面积，计算种胚染色面积的百分率。
依据玉米种胚染色区域的面积大小划分为5个区间，分别为 [0，25%)、[25%，50%)、[50%，75%)、[75%，100%)和100%。
1.2.4 玉米田间出苗率试验
每个年份设置4个小区(重复)，每个小区播种100粒种子，3个年份共计12个小区。播种深度为3~4 cm，定期浇水和除草田间管理，第20天记录玉米出苗数，计算田间出苗率。
1.2.5 相关性分析
利用Microsoft Excel 2016进行数据处理，用IBM SPSS Statistics 25.0进行分析比较，用Graphpad Prism 8进行作图。
2. 结果与分析
2.1 玉米种子种胚结构四唑染色图像
染色后的玉米种胚各主要结构(胚芽、胚轴、胚根和盾片)均呈红色(图1)；根据染色颜色的深浅标准(图2)分为染色颜色深、染色颜色浅和未染色3类，并将试验中所获得的玉米种子种胚染色颜色进行区分和计数。其中，种胚部分未染色又包括盾片上部未染色、盾片中部未染色、盾片下部未染色、胚根未染色和胚轴未染色5类(图3)。
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图 1 玉米种胚主要结构四唑染色图注：pl. 胚芽；hy. 胚轴；ra. 胚根；sc. 盾片(子叶)。Figure 1. Tetrazolium staining imagination of maize seed embryo structureNote: pl. plumule; hy. hypocotyl; ra. radical; sc. scutellum.![]()
图 2 玉米种胚四唑染色图像分级注：a) 种胚主要结构全部染红色且色深；b) 种胚结构全部染色但颜色浅；c) 种胚结构全部未染色。Figure 2. Classification of tetrazolium staining imagination of maize seed embryo structureNote: a) the embryo structure staining and staining red; b) the embryo structure staining and staining pink; c) the embryo structure unstaining.![]()
图 3 玉米种胚结构未染色图示注：a. 盾片上部未染色；b. 盾片中部未染色；d. 盾片下部未染色；c和e. 胚根未染色；f. 胚轴未染色。Figure 3. Unstaining imagination of maize seed embryo structuresNote: a. tip part of scutellum unstaining; b. middle of scutellum unstaining; d. lower part of scutellum unstaining; c and e. radical unstaining; f. hypocotyl unstaining.2.2 不同年份玉米种子种胚四唑染色结果
2.2.1 玉米种胚主要结构染色及颜色分级
由表1可知：从玉米种子种胚染色情况来看，2015、2014和2013年的种胚中，盾片整体染色深的数量均低于胚芽、胚轴和胚根；盾片上部与下部染色浅的数量高于种胚其他结构。2015和2013年的玉米种胚各结构的染色深浅均存在显著性差异(P<0.05)，说明随着贮藏时间的延长，玉米种子的生活力逐渐降低。2015与2014年的种胚中，胚芽、胚轴和盾片上部未染色均存在显著性差异，其他种胚结构和染色深浅间不存在显著性差异，这说明在一定的贮藏时间内，玉米种子的生活力差异不显著。
表 1 不同年份玉米种子种胚结构染色深浅的比较Table 1. Comparison of staining in embryo structure of different year maize seeds年份
year胚芽 plumule 胚轴 hypocotyl 胚根 radical 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 2015 96.00±2.83 a 2.50±0.58 b 1.50±0.58 c 96.50±3.42 a 2.50±1.00 b 1.00±0.82 c 93.50±5.26 a 2.50±0.58 b 4.00±1.41 b 2014 94.50±5.97 ab 1.50±0.58 b 4.00±1.41 b 94.50±4.44 a 3.50±1.29 ab 4.00±1.41 b 95.00±4.76 a 1.00±0.82 b 4.00±1.63 b 2013 87.00±4.76 b 5.50±1.73 a 7.50±1.92 a 86.00±5.89 b 5.50±1.92 a 8.50±2.65 a 78.50±7.90 b 5.00±2.16 a 16.50±2.52 a 年份
year盾片上部 upper scutellum 盾片中部 middle scutellum 盾片下部 lower scutellum 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 深 red 浅 pink 未染色 unstaining 2015 88.50±1.92 a 9.00±2.58 b 2.50±1.00 c 91.50±5.26 a 7.00±2.16 b 1.50±0.58 b 83.00±3.83 a 13.50±3.70 b 3.50±1.00 b 2014 83.50±3.42 a 7.50±2.08 b 9.00±1.83 b 88.00±5.89 a 7.00±1.83 b 5.00±2.16 b 80.00±5.89 a 13.00±2.58 b 7.00±1.83 b 2013 49.00±4.76 b 25.00±4.16 a 26.00±4.32 a 71.00±4.76 b 19.00±3.83 a 10.00±4.32 a 46.50±5.51 b 39.50±6.61 a 14.00±4.32 a 注：同列数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。
Note: Different lowercase indicate significant differences in the same column of data (P<0.05); the same as below.2.2.2 不同年份玉米种胚染色面积比较
经四唑染色后未染色和染色浅的种子是死种子或生活力低的种子，表明其已经发生衰老劣变和死亡。由图4可知：在2015与2014年间，种胚染色面积为[50%，75%)和100%的玉米种子占比存在显著性差异，而其他染色面积的种子占比无显著性差异；2015和2014年种胚各染色面积的玉米种子占比均与2013年存在显著性差异；3个年份中，染色面积达100%的种子最多，分别为94.5%、88.5%和64%，且存在显著性差异，表明随着种子贮藏时间的延长，玉米种子活力逐渐降低。
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图 4 不同年份的玉米种胚染色面积注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。Figure 4. Stained area of maize embryo in different yearsNote: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below.2.2.3 不同年份玉米种子染色深浅比较
由图5可知：2015和2014年的玉米种子种胚染色变化均无显著性差异，其中种胚全部染色深的种子占比显著高于 2013年，种胚部分染色深、种胚染色浅和种胚未染色的种子占比显著低于2013年，表明随着贮藏时间的延长，种子衰老增加，种子活力水平逐渐下降。
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图 5 不同年份玉米种子种胚染色变化Figure 5. Staining variation of maize seeds embryo in different years2.3 玉米种胚四唑染色与田间出苗率
2.3.1 玉米种胚染色面积与田间出苗率的相关性
当玉米种子种胚部分染色，染色面积在[0，25%)、[25%，50%)、[50%，75%) 和[75%，100%)区间，即染色面积低于100%时，与玉米种子田间出苗率呈负相关关系，其相关系数(R)分别为−0.959、−1.000 (P<0.05)、−0.875和−0.998 (P<0.05)，玉米种子田间均不能出苗，为无活力的种子；而当玉米种胚全部染色，且染色面积为100%时，与田间出苗率呈正相关关系(R=0.986)，表明此时玉米种子能够出苗，为具有活力的种子。
2.3.2 玉米种子染色分级与田间出苗率的相关性
玉米种子种胚全部染色而且颜色深时，与田间出苗率呈显著正相关(R=1.000，P<0.05)；玉米种子部分种胚染色深时，种子与田间出苗率呈显著负相关(R=−1.000，P<0.05)；全部种胚染色浅和全部未染色时，与田间出苗率均呈负相关(R=−0.921和−0.905)。说明只有当玉米全部种胚染色深时，玉米种子在田间才具备出苗能力，为有活力的种子；其他染色情况下，种子则不出苗，为无活力的玉米种子。
3. 讨论
3.1 评价种子活力与田间出苗状况之间的关系
种子活力测定的目的是为种子提供准确的潜在生理能力差异的信息，尤其是发芽率相似，但经过贮藏无法断定田间播种后是否具备较好出苗状况的种子。而测定田间出苗状况并非易事，种子活力代表的是种子较多综合特性的总和。单一的活力指标是否能准确描述和表达真实的种子活力水平，一直是学者长期以来研究和追寻的目标[19]。100多年来，种子学家们提出的描述种子的活力和活力测定评价方法，可以说得上是一个世纪的编年史，直到20世纪80年代初，McDonald提出种子活力的概念得到了国际种子检验协会(ISTA)和美国官方种子分析家协会(AOSA)的认可[20]，即指在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和长成正常幼苗潜在能力的总称[21]，也即表明有活力的种子在广泛的田间条件能快速整齐出苗，而无活力的种子在田间条件下不能够出苗。因此，在实验室测定种子活力水平的方法，应最终与田间出苗率也即田间表现相关。
3.2 四唑染色法测定玉米种子活力的优势
种子活力测定的方法可以分为基于发芽试验方法的生理测定和生化测定，而理想的种子活力测定方法，需要满足结果准确、简单易行、快速省时、重复性好、成本低廉和与田间出苗率相关的要求[22]。周雷[23]曾做过探索测定玉米种子活力的最佳方法的研究，将常用的种子活力测定方法如标准发芽试验、低温测定、盐度测定、四唑染色和电导率测定等方法测出的结果与田间出苗率进行相关分析，其中低温测定法与田间出苗率的相关系数最高(0.979)，即该方法为最佳测定方法；张守润[24]曾做过玉米种子活力测定及其与田间出苗率的关系指出：对于鉴别早播条件下种子批的田间出苗能力，遇冷试验及活力指数均为有效的方法，与田间出苗率的相关系数分别为0.71和0.77，而电导率测定结果与田间出苗率的相关系数最高，达到了0.85，为最佳测定方法。本试验采用四唑染色测定玉米种子活力，种胚全部染色且染色深时与田间出苗率的相关系数达到了1.000，即在测定时只需观察玉米种胚是否全部100%染色以及是否染色颜色深就可以确定种子是否具备出苗能力，全部染色且颜色深的种子是有活力的种子，其他情况下种子都不具有活力，测定的方法更为简便和准确。本试验从预先湿润玉米种子开始到试验结束只需1 d (24 h)，而低温测定最少需要7 d，因此，四唑染色图像法大大缩短了检测时间。
目前，中国玉米种子活力测定的方法并未列入农作物种子检验规程，玉米种子活力测定在企业中并不普及，主要是因为大部分企业没有掌握种子活力测定的技术方法。本试验根据四唑染色法染色后的种胚是否完全染色而且染色颜色深，利用肉眼或者放大镜就能判定种子是否具有种子活力和田间出苗能力。该技术方法简化了玉米种子活力测定方法，在当前单粒机械播种区域越来越广、对整齐一致的出苗率要求越来越高的情况下，对保障高效和简化的农业生产和用种安全具有非常重要的意义。
4. 结论
玉米种子经四唑染色后，只有种胚结构全部染色且染色深的种子才能够在田间出苗，可判定为有活力的种子；而种胚部分结构染色或者全部染色但染色浅的种子在田间不能出苗，即为无活力的种子。这一结论可为快速测定玉米种子活力提供新的技术方法和指标，为玉米种子质量检验提供一种准确、实用、方便和廉价的测定方法，可供种子检验机构和种业公司采用。
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图 1 鳖受精卵孵化期与孵化温度拟合曲线
注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Figure 1. Fitting curve between incubation period (IP) of fertilized eggs and incubation temperatures (T)
Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).
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图 2 介质、温度对孵出幼鳖游泳速度的影响
Figure 2. Effects of mediums and temperatures on the incubating larval swimming speed of P. sinensis
表 1 不同介质和温度下鳖的孵化率与孵化期
Table 1 Incubation rate and incubation period of Pelodiscus sinensis under different mediums and temperatures
孵化温度/ ℃
incubation temperature指标
index介质类型
medium type同温度不同介质的平均值
mean value of different mediums
under the same temperature蛭石
vermiculite沙子
sand无介质
no medium孵化率/%
incubation rate孵化期/d
incubation period28 孵化率/% incubation rate 83.11±1.48 a 66.67±1.43 b 59.23±2.55 c 69.67±10.71 c 55.73±1.84 a 孵化期/d incubation period 56.31±0.98 a 55.55±0.80 a 55.33±0.73 a 30 孵化率/% incubation rate 83.14±1.07 a 60.52±0.74 c 77.32±1.22 b 73.66±10.21 b 41.55±1.77 b 孵化期/d incubation period 41.84±1.55 a 41.73±2.26 a 41.09±2.14 a 32 孵化率/% incubation rate 83.15±1.34 a 80.39±2.85 a 73.86±1.01 b 79.13±4.44 a 38.53±1.73 c 孵化期/d incubation period 39.42±0.66 a 38.65±2.00 a 37.53±2.18 a 同介质不同温度的平均值
mean value of different temperatures
in the same medium孵化率/% incubation rate 83.13±1.13 a 69.19±8.96 c 70.14±8.45 b — — 孵化期/d incubation period 45.85±7.97 a 45.31±6.52 a 44.65±8.30 a 注：“*”列数据为纵向比较，其他数据为横向比较。不同小写字母表示处理间有显著差异 (P<0.05)；下同。
Note: The “*” column data are compared vertically, and the other data are compared horizontally. Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05); the same as below.
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表 2 介质和温度对幼鳖质量、背甲长、宽、高的影响
Table 2 Effects of mediums and temperatures on the larval weight, carapace length, carapace width and carapace height of P. sinensis
孵化温度/ ℃
incubation temperature介质类型
medium type质量/g
weight背甲长/mm
carapace length背甲宽/mm
carapace width背甲高/mm
carapace height28 蛭石 vermiculite 3.27±0.07 a 20.33±0.63 a 19.15±0.60 a 8.53±0.17 a 沙子 sand 2.95±0.12 b 19.62±0.20 b 18.30±0.33 b 8.34±0.04 b 无介质 no medium 3.15±0.16 b 19.48±0.78 b 18.37±0.27 b 8.68±0.22 a 平均值 mean value 3.12±0.17 B 19.81±0.65 B 18.61±0.55 A 8.52±0.20 A 30 蛭石 vermiculite 3.28±0.13 a 20.76±0.31 a 19.19±0.31 a 8.58±0.14 a 沙子 sand 3.20±0.18 b 20.39±0.72 b 19.15±1.06 a 8.63±0.17 ab 无介质 no medium 3.06±0.17 b 19.67±0.36 c 18.25±0.56 b 8.44±0.27 b 平均值 mean value 3.18±0.17 A 20.27±0.65 A 18.86±0.77 A 8.55±0.19 A 32 蛭石 vermiculite 3.35±0.24 a 21.04±0.55 a 19.20±0.38 a 8.77±0.33 a 沙子 sand 3.36±0.10 a 20.54±0.76 ab 18.76±0.90 ab 8.61±0.34 a 无介质 no medium 3.21±0.20 a 19.94±0.22 b 18.21±0.26 b 8.60±0.26 a 平均值 mean value 3.31±0.18 A 20.51±0.68 A 18.72±0.66 A 8.66±0.28 A 综合评价 comprehensive evaluation 蛭石 vermiculite 3.30±0.15 a 20.71±0.54 a 19.18±0.39 a 8.63±0.23 a 沙子 sand 3.17±0.22 b 20.18±0.69 b 18.74±0.80 b 8.53±0.24 b 无介质 no medium 3.14±0.17 b 19.70±0.49 c 18.28±0.34 c 8.57±0.24 b P值 P-value 孵化温度 (T) incubation temperature 0.006 0.001 0.109 0.101 介质 (M) medium 0.000 0.000 0.000 0.009 T×M 0.023 0.828 0.477 0.073 注：不同大写字母表示不同温度下3种介质的平均值存在显著差异(P<0.05)。
Note: Different uppercase letters indicate there are significant differences in the mean value of the three mediums at different temperatures (P<0.05).
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