花身副丽鱼性腺发育组织学观察与初步分析
掌握花身副丽鱼(Cichlasoma managuense)的性腺分化和发育规律，系统描述其各期精巢和卵巢的形态结构、特征及变化。
利用石蜡切片对花身副丽鱼性腺发育的结构和时相进行研究。
花身副丽鱼的精巢和卵巢发育分为6个时期，约30日龄性腺出现分化。卵巢发育属于分批不同步型，为分批不同步产卵，第Ⅰ期最早出现在34日龄；第Ⅱ期出现在64日龄；第Ⅲ期分为前、中、后期，分别出现在120、140、165日龄；第Ⅳ期也分为前、中、后期，分别出现在180、200、247日龄；第Ⅴ期出现在282日龄，达到性成熟，此时鱼体质量为(9.70±2.20) g；之后逐渐进入第Ⅵ期。精巢属于小叶型，发育略晚于卵巢，第Ⅰ期出现在64日龄；第Ⅱ期出现在110日龄；第Ⅲ期出现在180日龄；第Ⅳ期出现在320日龄；第Ⅴ期出现在350日龄，达到性成熟，此时鱼体质量为(40.77±18.20) g；之后逐渐进入第Ⅵ期。
花身副丽鱼的卵巢发育早于精巢且发育速度快于精巢，导致雌、雄成熟不同步，需要对雄鱼进行人工催产等技术加快精巢发育以提高人工繁殖效率。本研究对花身副丽鱼人工繁育和精准性别控制育种技术研究提供了数据支撑。
Histological Observation and Preliminary Analysis of Gonadal Development in Cichlasoma managuense
To grasp the gonadal differentiation and development law of Cichlasoma managuense, and to systematically describe the morphological structure, characteristics and changes of the testis and ovary in each stage.
Paraffin section was used to study the structure and phase of gonadal development in C. managuense.
The development of testis and ovary of C. managuense could be divided into six stages. At 30-day of age, the gonads began to differentiate. The development of ovary belonged to batch asynchrony type, which meant the egg-laying was in batch asynchrony. Stage Ⅰ of ovary development appeared at 34-day of age; stage Ⅱ appeared at 64-day of age; stage Ⅲ was divided into the primary, middle and later periods, appearing at 120-, 140- and 165-day of age; stage Ⅳ was also divided into the primary, middle and later periods, appearing at 180-, 200- and 247-day of age; stage Ⅴ appeared at 282-day of age, reaching sexual maturity, and the body weight was (9.70±2.20) g; and then got into stage Ⅵ gradually. Testis belonged to lobular type and developed a little later than the ovary. Stage Ⅰ of testis appeared at 64-day of age; stage Ⅱ appeared at 110-day of age; stage Ⅲ appeared at 180-day of age; stage Ⅳ appeared at 320-day of age; stage Ⅴ appeared at 350-day of age, reaching sexual maturity, and the body weight was (40.77±18.20) g; and then got into stage Ⅵ gradually.
The development of ovary of C. managuense is earlier and faster than the testis, resulting in the asynchronous maturation of male and female. It is necessary to accelerate the development of testis by artificial induction and other techniques to improve the efficiency of artificial reproduction. This study provides data support for C. managuense breeding and research on precision sex-controlled breeding techniques.
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Keywords:
- Cichlasoma managuense /
- histological observation /
- gonadal development /
- lobular type
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随着社会的不断发展，肥胖及相关代谢性疾病的发生已成为危害人类健康的重要因素之一。在肉鸡行业，鸡体内脂肪的过度沉积对饲料转化率、鸡蛋产量和孵化率造成的影响也不容忽视[1-2]。鸡的脂肪组织具有天然高血糖以及对外源性胰岛素低敏感的特性，是研究人类肥胖、胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病的常用模型[3-5]。深入了解鸡脂肪生成的分子机制，对于改善鸡肉品质、培育低脂系家禽具有重要的理论意义和实际应用价值，也可为控制人类脂肪组织过度沉积和肥胖提供参考。
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3 (cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)属于激酶抑制蛋白CIP/KIP基因家族，位于人类第14号染色体，在细胞周期调控中发挥着重要作用[6]。研究发现：CDKN3与肾癌、卵巢癌等多种癌细胞的增殖密切相关[7-8]。脂肪细胞增多受前脂肪细胞增殖速率控制，而脂肪细胞肥大受前脂肪细胞分化程度控制[9-11]。转录因子KLF7是脂肪形成的负调控因子，能够抑制前脂肪细胞分化，促进增殖[12]，但CDKN3是否影响前脂肪细胞的分化尚不清楚。为此，本研究检测了CDKN3在鸡前脂肪细胞中的亚细胞定位以及在鸡前脂肪细胞分化过程中的表达模式，并通过qRT-PCR、油红O等方法验证了过表达CDKN3对鸡永生化前脂肪细胞系(immortalized chicken preadipocyte cell line，ICP1)分化的影响，研究结果有助于进一步了解肉鸡脂肪沉积的分子机制，也可为哺乳动物的肥胖研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
ICP1由东北农业大学农业农村部鸡遗传育种重点实验室惠赠。制备ICP1时，首先分离鸡的原代前脂肪细胞，然后将带有鸡端粒酶逆转录酶(chTERT)基因的逆转录病毒感染原代前脂肪细胞，再通过药物筛选导入chTERT基因的细胞[13]。该细胞系广泛用于鸡的脂肪生物学研究[2, 14-15]，与鸡的原代前脂肪细胞具有相同的分化特性。
pCMV-HA质粒购自美国Clontech公司；pCMV-HA-CDKN3载体根据参考文献[16]构建并保存；pECFP-N1质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。
1.2 ICP1培养
用含10%胎牛血清(Biological Industries，以色列)和1%青霉素—链霉素溶液(Beyotime，上海)的 DMEM/F-12培养基(Gibco，美国)培养ICP1，并将培养皿置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱 (Thermo，美国)中。
1.3 PCR扩增及纯化CDKN3目的片段
根据实验室前期构建的pCMV-HA-CDKN3载体序列，利用Primer Premier 5.0设计CDKN3引物(表1)。以pCMV-HA-CDKN3载体为模板，使用高保真聚合酶Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme，南京)进行PCR扩增，反应条件和反应体系按说明书设置。PCR产物经过电泳后，使用胶回收试剂盒 (天根，北京)纯化。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence扩增基因 amplified gene 引物序列 (5′→3′) primer sequences PPARγ F：TGCTGTTATGGGTGAAACTCT R：CGCTTGATGTCAAAGGAATGC C/EBPα F：CAAGAACAGCAACGAGTACCG R：GTCACTCGTCAACTCCAGCAC FABP4 F：ATGTGCGACCAGTTTGT R：TCACCATTGATGCTGATAG FAS F：AAGGCGGAAGTCAACGG R：TTGATGGTGAGGAGTCG NONO F：AGAAGCAGCAGCAAGAAC R：TCCTCCATCCTCCTCAGT pECFP-CDKN3 F：CTACCGGACTCAGATCTCGAG
ATGTACCCATACGATGTTCCAR：GGATCCCGGGCCCGCGGTACCCA
CCGTGATACTGATCTCTGTACTGT1.4 连接与转化
使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (Vazyme，南京)构建重组质粒pECFP-N1-CDKN3，连接体系和条件按说明书进行。质粒转化至大肠杆菌后，挑取单菌落至10 mL LB (Ampr)培养液中过夜培养；使用质粒DNA小量试剂盒(天根，北京)提取质粒，具体步骤按照试剂盒说明书操作。将连接好的pECFP-N1-CDKN3重组质粒用XhoI和KpnI-HF进行双酶切鉴定。测序鉴定由安升达生物科技有限公司完成。
1.5 细胞转染与诱导分化
细胞长至70%~80%时，用无血清的DMEM细胞培养基125.0 µL稀释质粒2.5 µg，混匀后加入Lipo8000™ 转染试剂(Beyotime，上海) 4.0 µL，再次混匀后立即滴加至6孔板中，摇匀，将转染后的细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中继续培养；24 h后更换为含有 160 μmol /L 油酸钠(Sigma，美国)的DMEM/F-12 培养基进行诱导分化。
1.6 间接免疫荧光观察CDKN3的亚细胞定位
按照1.5节的方法转染pECFP-N1 (淼灵，武汉)和pECFP-CDKN3，培养24 h后弃DMEM/F-12培养基，PBS漂洗2次，加入4%多聚甲醛500 μL，于室温环境下固定30 min，再加入DAPI (Beyotime，上海) 100 μL，室温避光染核10~15 min。用激光共聚焦扫描系统观察458 nm激发光处的青色荧光(ECFP荧光蛋白)以及400 nm激发光处的蓝色荧光(DAPI染剂)。
1.7 油红O染色观察脂滴蓄积
向诱导分化后的细胞加入固定液，室温固定30 min；弃固定液，置于60 ℃烘箱中烘烤1 min ；取出细胞后加入过滤好的油红O工作液，避光染色50 min；弃染色液，加入60%异丙醇后弃掉，最后加入PBS并于倒置显微镜下拍照观察；之后，弃PBS并加入异丙醇，室温孵育15 min，用酶标仪测定 510 nm处的吸光度值。
1.8 总RNA提取与反转录
使用RNAiso Plus (Takara，大连)提取ICP1的RNA，具体步骤参考文献[2]。在RNA 1 μg中加入基因组DNA去除液4 µL、10 μmol/L Oligo (dT) 23VN 1 µL和50 ng/μL Random hexamers 1 µL，再用RNase-free ddH2O 定容至16 µL；42 ℃反应2 min。反应结束后，向反应液中加入5×HiScript Ⅱ Select qRT SuperMix Ⅱ 4 µL；反应程序为：50 ℃、15 min，85 ℃、5 s。
1.9 实时荧光定量PCR检测CDKN3 mRNA水平
以ICP1 cDNA为模板，使用ChamQTM SYBR® qPCR Master Mix (Vazyme，南京)进行qPCR检测，引物见表1。以无POU域八聚体结合蛋白(non-POU domain containing octamer-binding protein，NONO)为内参基因，采用2−ΔΔCt法将原始Ct值转换为基因相对表达量。
1.10 Western-blot测定CDKN3蛋白表达
按照1.5节的方法转染pCMV-HA和pCMV-HA-CDKN3，48 h 后使用含1% PMSF的 RIPA裂解液(Beyotime，上海)提取细胞总蛋白，4 ℃、12000 r/min离心5 min；取上清液，加入5×蛋白上样缓冲液(Beyotime，上海)，煮沸5 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳结束后电转至PVDF膜(biosharp，中国)，室温封闭1 h，加入anti-HA (CST，美国，#3724)，4 ℃孵育过夜，PBST漂洗5次，加入二抗孵育1 h (LI-COR， 680LT，美国)，利用Odyssey双红外激光成像系统测定CDKN3蛋白表达水平。内参为β-actin抗体(Beyotime，AF003，上海)。
1.11 数据统计与分析
使用SPSS 22.0统计分析数据；使用Graphpad Prism 7.0绘图。用t-test比较模型内2组数据间的差异，用 Duncan’s 多重比较2组以上的数据。体外试验均进行3次独立重复试验，每次试验设置3个生物学重复。
2. 结果与分析
2.1 CDKN3蛋白的亚细胞定位
XhoI和KpnI-HF可特异性识别并成功切割pECFP-CDKN3重组质粒，目的条带与预期大小一致(图1)；克隆序列与实验室前期构建的pCMV-HA-CDKN3载体序列一致，表明CDKN3已插入到pECFP-N1荧光载体。对照组在细胞核和细胞质上均出现青色荧光信号，而转染了重组表达载体pECFP-CDKN3的细胞仅在细胞核中有青色荧光信号(图2)，表明CDKN3在鸡前脂肪细胞中主要定位于细胞核。
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图 1 重组质粒pECFP-CDKN3的鉴定注：M. DL5000 Marker；1. pECFP-CDKN3质粒的XhoI和KpnI-HF双酶切产物；2. 阴性对照。Figure 1. Identification of recombinant plasmid pECFP-CDKN3Notes: 1. double digestion products of plasmid pECFP-CDKN3 by XhoI and KpnI-HF; 2. negative control.![]()
图 2 CDKN3的亚细胞定位注：DAPI染色中细胞核呈蓝色，箭头所指方向为CDKN3蛋白的位置；标尺=10 μm。Figure 2. Subcellular localization of CDKN3Note: The nucleus is stained with DAPI (blue), and the arrow indicates the location of the CDKN3 protein; scale bar =10 μm.2.2 CDKN3在ICP1分化过程中的表达模式
由图3a可知：诱导分化96 h，经油红O染色可观察到脂滴形成，表明ICP1具有分化为脂肪细胞的能力。qRT-PCR结果(图3b)显示：在前脂肪细胞分化过程中，CDKN3 mRNA表达水平逐渐升高，提示CDKN3在ICP1分化过程中可能发挥作用。
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图 3 CDKN3在ICP1分化中的表达注：a) 油酸钠诱导细胞分化0和96 h后进行油红O染色的结果(标尺=100 μm)；b) CDKN3在ICP1分化过程中的相对表达量，不同字母表示差异显著(P<0.05)。Figure 3. Expression of CDKN3 during the differentiation of ICP1Note: a) result of oil red O staining after sodium oleate induced cell differentiation 0 and 96 hours (scale bar =100 μm); b) the relative expression level of CDKN3 in ICP1 differentiation, different letters indicate significant differences (P<0.05).2.3 过表达CDKN3对ICP1分化的影响
由图4a可知：转染pCMV-HA质粒的ICP1未表达特异条带，而转染pCMV-HA-CDKN3质粒的细胞表达出1条约23 ku的特异蛋白条带，且与对照组相比，转染pCMV-HA-CDKN3的细胞中CDKN3蛋白表达极显著升高(P<0.01)，表明CDKN3过表达成功。油红O染色结果(图4b)显示：与对照组相比，过表达CDKN3组的细胞脂滴数量明显减少，吸光度值极显著降低(P<0.01，图4c)。qRT-PCR结果(图4d)显示：与转染pCMV-HA空载对照组相比，过表达CDKN3后，脂肪生成相关基因PPARγ和FAS的表达量极显著或显著下降(P<0.01或P<0.05)；C/EBPα和FABP4 mRNA的表达量呈降低趋势，提示CDKN3可抑制ICP1分化。
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图 4 过表达CDKN3可抑制ICP1分化注：a) CDKN3蛋白表达；b) 油红O染色结果(标尺=100 μm)；c) 提取染料在510 nm处的吸光度；d) qRT-PCR检测脂肪细胞分化标志基因mRNA的表达，以NONO为内参；*P<0.05，**P<0.01。Figure 4. Overexpression of CDKN3 inhibits differentiation of ICP1Note: a) expression of CDKN3 protein; b) result of oil red O staining (scale bar =100 μm); c) the absorbance of extraction dye at 510 nm; d) mRNA expression of adipocyte differentiation marker gene was detected by qRT-PCR, using NONO as the internal reference.3. 讨论
CDKN3是细胞周期调节蛋白，可直接或间接与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinase，CDK)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN)等相互作用，参与细胞周期调控[16]。在肾癌细胞中，CDKN3主要定位于细胞核[8]；在宫颈癌组织中，CDKN3 在细胞质和细胞核均有表达[17]；在 HPV16 阳性癌组织中，CDKN3主要分布在胞浆。说明CDKN3在不同组织亚细胞的定位可能不同，其功能具有复杂性。本研究发现：在鸡前脂肪细胞中，CDKN3主要位于细胞核，推测该基因可能与CDK或CDKN在细胞核中发挥相互作用从而影响细胞周期。
CDKN3作为CDKN家族成员之一，可同时促进及抑制细胞周期进程[18-19]。已有研究表明：CDKN3在细胞增殖[19-21]、凋亡[22]和侵袭[21]中发挥重要作用，但在细胞分化方面鲜有报道。本研究首次在体外试验中探究CDKN3在脂肪细胞中对细胞分化的影响，并发现在鸡前脂肪细胞的分化过程中，CDKN3持续表达，qRT-PCR以及油红O染色结果显示：过表达CDKN3可抑制脂滴数量增加，并促进 FAS、PPARγ、FABP4和C/EBPα下调，从而抑制脂肪形成，表明CDKN3对鸡前脂肪细胞分化具有抑制作用。但是，前脂肪细胞中CDKN3的表达模式与其他抑制因子的表达模式不同，GATA2[23]、MiR281[24]、KLF7[25]等负调控因子在分化过程中的表达量均呈下降趋势，而本研究中CDKN3表达量升高，推测其原因可能是CDKN3促进鸡前脂肪细胞增殖，故未进行细胞周期同步化[26]，尽管已诱导分化，但有些细胞仍处于增殖状态，因此CDKN3的表达呈升高趋势。此外，CDKN3在鸡前脂肪细胞中的表达量并不高，本研究并未开展干扰试验，今后有必要利用Crispr-Cas9技术在体内和体外开展CDKN3的缺失表达分析。
脂肪形成是一个复杂的网络调控过程，C/EBPα和PPARγ作为脂肪形成过程中最关键的因子，其他的转录因子或多或少会通过影响其表达进而影响脂肪形成[27]。有报道称Smad3[28]、KLF2[29]和KLF3[30]均可下调C/EBPα的表达，抑制脂肪细胞分化。本研究发现：过表达CDKN3可下调 PPARγ基因的表达，抑制脂肪细胞分化。CDKN3主要定位于细胞核，但该基因家族并不存在DNA结合基序，不能作为转录因子发挥作用。在胰腺癌细胞中，CDKN3可作为P53的辅助因子，与MdM2-P53结合增强其活性，从而下调P21的表达[31]。因此，推测CDKN3可能作为转录辅助因子，通过与转录因子GATA2/3或其他脂肪细胞分化负调控因子结合，抑制核受体PPARγ转录[32-33]，进而抑制鸡前脂肪细胞分化。
本研究购置了小鼠的CDKN3抗体，但经实验验证该抗体不适用于鸡的研究。今后有必要制备鸡的CDKN3抗体，开展Re-ChIP和co-IP分析，进一步探究CDKN3抑制前脂肪细胞分化的分子机制。鸡约60%的基因与人类基因相同[34]，鸡通常作为研究人类肥胖及相关疾病的潜在模型[35]。因此，本研究结果有助于深入了解人类脂肪形成的分子机制。
4. 结论
在鸡前脂肪细胞诱导分化形成脂滴的过程中，CDKN3作为核蛋白可抑制鸡前脂肪细胞分化，并下调脂质合成相关基因的表达。本研究为深入分析CDKN3对脂肪沉积的作用奠定了基础，也为鸡肉质量性状的遗传改良提供了新的候选基因。
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图 1 花身副丽鱼性腺发育组织学观察
注：a)和b)Ⅰ期卵巢；c) 第Ⅱ时相卵母细胞前期；d) 第Ⅱ时相卵母细胞后期；e) 第Ⅲ时相卵母细胞前期；f) 第Ⅲ时相卵母细胞中期；g) 第Ⅲ时相卵母细胞后期；h) 第Ⅳ时相卵母细胞前期；i) 第Ⅳ时相卵母细胞中期；j) 第Ⅳ时相卵母细胞后期；k)和l) Ⅴ期卵巢；m) Ⅵ期卵巢；n)和o)Ⅰ期精巢；p)和q)Ⅱ期精巢；r) 和s) Ⅲ期精巢；t)和u) Ⅳ期精巢；v)和w)Ⅴ期精巢；x) Ⅵ期精巢。n. 细胞核；nu. 核仁；yv. 卵黄泡；yg. 卵黄颗粒；zr. 放射带；sg. 精原细胞；ps. 初级精母细胞；ss. 次级精母细胞；st. 精子细胞；sp. 精子。
Figure 1. Histology observation of gonadal development of Cichlasoma managuense
Note: a) and b) stageⅠof ovary; c) the primary period of oocytes in Ⅱ phase; d) the later period of oocytes in Ⅱ phase; e) the primary period of oocytes in Ⅲ phase; f) the middle period of oocytes in Ⅲ phase; g) the later period of oocytes in Ⅲ phase; h) the primary period of oocytes in Ⅳ phase; i) the middle period of oocytes in Ⅳ phase; j) the later period of oocytes in Ⅳ phase; k) and l) stage Ⅴof ovary; m) stage Ⅵ of ovary; n) and o) stageⅠof testis; p) and q) stage Ⅱ of testis; r) and s) stage Ⅲ of testis; t) and u) stage Ⅳ of testis; v) and w) stage Ⅴ of testis; x) stage Ⅵ of testis. n. nucleus; nu. nucleolus; yv. vacuolus vitellioae; yg. yolk granule; zr. zona radiata; sg. spermatogonium; ps. primary spermatocyte; ss. secondary spermatocyte; st. spermatoblast; sp. sperm.
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