昭通牛mtDNA D-loop区遗传多样性分析
阐明昭通牛群体遗传背景信息。
采用 PCR 产物直接测序技术对 98头昭通牛样品的 mtDNA D-loop区全序列变异进行检测，进一步将昭通牛的数据与已发表的云南文山牛、德宏高峰牛、滇中牛和迪庆牛的mtDNA数据进行联合分析。
昭通牛mtDNA D-loop区序列共检测到73个核苷酸替换位点和3个插入/缺失。核苷酸替换位点约占检测核苷酸位点总数的8.13%，其中18个为单一信息位点，55个为简约信息位点，碱基替换主要为转换。在昭通牛群体中共确定36种单倍型，其中38.78%的个体属于H01~H09单倍型，源于瘤牛已发现的2个mtDNA世系，I1世系占37.76%，I2世系占1.02%；其余61.22%昭通牛个体分布于H10~H36单倍型中，都源于已发现的普通牛mtDNA世系，其中T2世系占5.10%，T3世系占43.88%，T4世系占12.24%。昭通牛群体的单倍型多样度为0.880±0.027，核苷酸多样度为0.024 43±0.000 94，群体内遗传距离为0.026±0.004，群体内遗传多样性指数为0.027±0.004。昭通牛与迪庆牛间的遗传距离和遗传分化最小，与德宏高峰牛间的遗传距离和遗传分化最大。
昭通牛遗传多样性较丰富，与云南本地其他牛种存在一定遗传分化，在母系起源上为瘤牛和普通牛2个血统的混合起源，但受普通牛的影响较大。
Genetic Diversity of mtDNA D-loop Region in Zhaotong Cattle
To clarify the genetic background information of Zhaotong cattle.
The variations in mtDNA D-loop complete sequences from 98 samples of Zhaotong cattle were detected by direct sequencing of PCR products. Further, the data of Zhaotong cattle were analyzed jointly with the published mtDNA data of Yunnan indigenous cattle, including Wenshan cattle, Dehong humped cattle, Dianzhong cattle and Diqing cattle.
A total of 73 nucleotide substitution sites and three indels were found in the mtDNA D-loop sequence of Zhaotong cattle. The nucleotide substitutions found accounted for about 8.13% of the total nucleotide sites detected and base substitutions were mainly transitions, of which 18 were single informative sites, 55 were parsimony informative sites. A total of 36 haplotypes were identified in Zhaotong cattle, of which 38.78% belonged to the haplotypes H01-H09 derived from two mtDNA lineages of Bos indicus been found: I1 lineage accounted for 37.76% and I2 lineage accounted for 1.02%. And the remaining 61.22% of this cattle was distributed in haplotypes H10-H36, which were derived from the discovered mtDNA lineages of B. taurus, of which T2 lineage accounts for 5.10%, T3 lineage accounts for 43.88%, and T4 lineage accounts for 12.24%. The haplotype diversity of Zhaotong cattle was 0.880±0.027, the nucleotide diversity was 0.024 43±0.000 94, the genetic distance within population was 0.026±0.004, and the genetic diversity index within the population was 0.027±0.004. The genetic distance and genetic differentiation between Zhaotong cattle and Diqing cattle were the lowest, and that between Zhaotong cattle and Dehong humped cattle were the highest.
The genetic diversity of Zhaotong cattle is rich, and this cattle has a certain degree of genetic differentiation with other indigenous cattle breeds in Yunnan. The cattle has mixed maternal origins of B. taurus and B. indicus, but it is greatly affected by B. taurus.
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Keywords:
- Zhaotong cattle /
- mtDNA D-loop /
- genetic diversity /
- matrilineal lineage /
- genetic differentiation
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牛属于脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Mammalia)偶蹄目(Artiodactyla)反刍亚目(Ruminar)洞角科(Covicornia)牛亚科(Bovedae)牛属(Bos)，可分为普通牛(B. taurus)和瘤牛(B. indicus) 2个类型。近年对世界范围内牛种线粒体DNA控制区(mitochondrial DNA control region，mtDNA D-loop)序列的研究表明：普通牛和瘤牛各自起源于独立的驯化事件[1-2]。普通牛的驯化中心位于近东地区，欧洲、非洲和东北亚地区也可能存在普通牛的驯化事件；瘤牛则可能起源于印度河流域[3-4]。在普通牛中主要存在5个mtDNA世系(T和T1~T4)，且这些世系存在明显的地理区域分布，近东和欧洲地区以T、T2 和 T3世系为主，非洲地区以T1世系为主，而T4世系为东北亚所特有；在瘤牛中存在2个mtDNA世系(I1和I2)，常见于印度次大陆，且以I1世系为主[1-3]。对中国家牛的mtDNA世系研究表明：中国家牛普遍存在普通牛和瘤牛2个血统[2, 5]，且普通牛血统构成主要包含T1~T4 mtDNA世系，瘤牛血统则包含I1和I2 mtDNA世系。
昭通牛因产于云南省昭通市而得名，在全市各县(区)均有分布。昭通市位于云南省东北部，地处云、贵、川三省结合部的乌蒙山腹地，群山林立，水资源和饲料资源丰富，为昭通牛遗传资源的形成和养殖提供了良好条件[6-7]。昭通牛属役肉兼用型牛种，体型中等，体质结实，结构匀称，短宽平直，被毛以黄色为主；对当地自然生态条件有良好的适应性，具有耐粗饲、抗逆性和抗病力强等优良种质特性[6]。昭通牛于1980年全国畜禽品种资源调查时定名，属云南省地方优良品种，于1987年列入《云南省家畜家禽品种志》，2011年列入《中国畜禽遗传资源志·牛志》。
畜禽的遗传多样性不仅可以描述群体的遗传背景信息，为其保种和选育提供参考，还对群体的亲缘关系、起源分化和基因渗入等研究具有重要意义[1]。近年来，多个遗传标记被用于遗传多样性的研究中，其中mtDNA D-loop序列主要用于畜禽母系遗传研究。mtDNA具有分子结构简单、不重组和高突变等特征，在哺乳动物中遵循严格的母系遗传，是物种鉴定和祖先母系起源研究的最佳遗传标记。mtDNA D-loop区是线粒体基因组中突变率最高的区域，因此被广泛用于畜禽遗传多样性研究[8]。2000年前，引入外来商业化牛品种进行的杂交改良对昭通牛的影响较大，导致其血统混杂，纯种牛数量急剧减少[6-7]。虽然已有研究对昭通牛的遗传多样性进行了报道[9-11]，但都是几年甚至10年前的研究，且当时研究的样品数量有限，不能准确反映当前该牛的群体遗传结构状况。考虑到当前昭通牛保种与选育利用的迫切需要，本研究利用mtDNA D-loop区序列为遗传标记，采用PCR产物直接测序技术对当前该牛的群体变异进行检测，进一步结合已发表的云南本地其他牛的mtDNA数据进行深入的群体遗传学分析，试图从母系遗传的角度阐明昭通牛的群体遗传结构、血统构成和起源分化，为该牛的保种和选育提供依据。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
在云南省昭通市昭阳区旧圃镇和彝良县洛泽河镇采集了98份昭通牛耳组织样品(45头母牛和53头公牛)，置于装有500 µL 95%酒精的1.5 mL离心管中带回实验室，−20 ℃保存，用于基因组DNA的提取。样品的采集由当地畜牧部门的专家负责纯种牛的鉴定，要求具备典型的品种特征、无直接血缘关系且在分布上具有代表性。为了更好地评价昭通牛的遗传多样性特征并弄清其与云南其他地方牛种的遗传差异，从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载了189条云南地方牛的mtDNA D-loop区序列(GenBank登录号：MF410466~MF410654)，其中包括53头文山牛、34头德宏高峰牛、49头迪庆牛和53头滇中牛，用于与本研究数据进行比较分析。
1.2 基因组DNA的提取
采用酚—氯仿法提取基因组DNA，并用TE液溶解，再用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA原液的完整性，用Nano Drop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)检测其质量浓度和OD值，并稀释成质量浓度为100 ng/µL的DNA工作液备用。
1.3 目的片段扩增及序列测定
所用引物为LOFTUS等[12]公布的特异性引物扩增D-loop全序列片段(Cattle-F_L15757：5 ′ -CTGCAGTCTCACCATCAACC-3 ′ ，Cattle-R_H496：5 ′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′)，目的片段扩增及测序所需引物相同。PCR反应体系为20.0 μL，包括10×buffer (Mg2+ 15 mmol/mL) 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各0.4 μL，5 U/μL rTaq DNA聚合酶0.1 μL和100 ng/µL的 DNA工作液模板2.0 μL，加ddH2O补足体系。反应程序为：95 ℃预变性3 min→34个循环(94 ℃变性30 s→60 ℃退火40 s→72 ℃延伸40 s)→72 ℃后延伸5 min。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向直接测序。
1.4 数据统计与分析
采用Lasergene软件包(DNA Star Inc.，USA)[13]中的SeqMan程序对昭通牛mtDNA D-loop序列进行人工校正和输出；采用ClustalX软件[14]进行序列比对，采用BioEdit软件[15]调整和编辑比对好的序列；采用MEGA6软件[16]对序列进行单倍型输出和碱基组成分析，计算群体内遗传距离和群体内遗传多样性指数等；群体间遗传距离采用最大似然法基于T92+G模型进行估算，采用Bootstrap法(5 000次)估算稳健的标准误差，然后采用邻接法根据群体间遗传距离构建群体间遗传关系树，并利用在线软件iTOL (https://itol.embl.de/#)对其进行美化；利用DNASP 6软件[17]计算群体遗传多样性参数(单倍型数、单倍型多样度和核苷酸多样度)，估算群体间的遗传分化指数(genetic differentiation index，Fst值)，根据公式Nm=(1/Fst−1)/4[18]计算基因流(gene flow，Nm值)；采用Network 10软件(https://www.fluxus~engineering.com/)的中接法构建昭通牛群体各单倍型遗传关系的中介网络图，其中赋予转换和插入/缺失的权重分别为10和15；采用MEGA6软件[16]构建昭通牛群体单倍型的系统发育树。
2. 结果与分析
2.1 序列变异
昭通牛mtDNA D-loop区的突变位点及定义的单倍型如图1所示。98头昭通牛的mtDNA D-loop区序列扩增片段长915 bp，去掉两端测序质量较差的序列后，用于分析的序列长度为898 bp。序列中A、T、C和G碱基的平均含量分别为33.30%、29.00%、23.90%和13.80%，序列A+T平均含量为62.30%，共检测到73个核苷酸替换位点和3个插入/缺失，核苷酸替换位点约占检测核苷酸位点总数的8.13%，核苷酸替换主要为转换。在发现的73个突变位点中，包含18个单一信息位点和55个简约信息位点。基于发现的核苷酸替换位点及插入/缺失信息，在昭通牛群体中共确定36种单倍型，单倍型H02和H22在群体中所占比例较高，其频率分别为29.59%和11.22%。昭通牛群体的单倍型多样度为0.880±0.027，核苷酸多样度为0.02443±0.00094，群体内遗传距离为0.026±0.004，群体内遗传多样性指数为0.027±0.004。
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图 1 昭通牛mtDNA D-loop区的突变位点及定义的单倍型注：H01~H36表示在昭通牛中发现的36种单倍型；“·”表示与参考序列核苷酸相同，“-”表示缺失的核苷酸；图中数字按列读取，每一列上的数值代表突变位点的位置信息；位置记录所用参考序列L27733.1也属于H01。Figure 1. Mutation sites and defined haplotypes based in mtDNA D-loop sequences of Zhaotong cattleNote: H01-H36 indicate the 36 haplotypes found in Zhaotong cattle; “·” indicates the same nucleotide as the reference sequence, “-” indicates the missing nucleotide; the numbers in the figure are read in columns, and the values on each column represent the location information of the mutation sites; the reference sequence L27733.1 used for position locating also belongs to H01.2.2 群体遗传多样性
云南5个本地牛群体共287条mtDNA D-loop区序列中A、T、C和G碱基的平均含量分别为33.40%、28.80%、24.00%和13.80%，A+T和C+G的平均含量为62.20%和37.80%，共发现93个变异位点，其中单一信息位点24个，简约信息位点69个，共确定86个单倍型；单倍型多样度为0.882±0.017，核苷酸多样度为0.02482±0.00030，群体内遗传距离为0.027±0.004，群体内遗传多样性指数为0.027±0.005 (表1)。
表 1 云南地方牛群体的遗传多样性Table 1. Genetic diversity of Yunnan local cattles群体
populations单倍型数
number of
haplotype单倍型多样度
haplotype
diversity核苷酸多样度
nucleotide
diversity群体内遗传距离
mean distance
within population群体内遗传多样性指数
genetic diversity index
within population昭通牛
Zhaotong cattle36 0.880±0.027 0.02443±0.00094 0.026±0.004 0.027±0.004 文山牛
Wenshan cattle23 0.823±0.052 0.02283±0.00196 0.024±0.003 0.025±0.005 德宏高峰牛
Dehong humped cattle11 0.585±0.100 0.00183±0.00054 0.002±0.001 0.002±0.001 迪庆牛
Diqing cattle27 0.963±0.012 0.02100±0.00270 0.022±0.003 0.023±0.004 滇中牛
Dianzhong cattle18 0.869±0.032 0.02266±0.00177 0.024±0.003 0.025±0.006 全部
total86 0.882±0.017 0.02482±0.00030 0.027±0.004 0.027±0.005 2.3 群体间遗传距离和遗传分化指数
由表2可知：昭通牛与迪庆牛间的遗传距离最小(0.024)，与德宏高峰牛间的遗传距离最大(0.031)。根据群体间遗传距离数据构建的遗传关系树(图2)可知：昭通牛与迪庆牛聚为一大支，德宏高峰牛与文山牛、滇中牛聚为另一支。
表 2 云南地方牛群体间遗传距离Table 2. Genetic distances between local cattle in Yunnan群体
populations德宏高峰牛
Dehong humped cattle迪庆牛
Diqing
cattle滇中牛
Dianzhong cattle文山牛
Wenshan cattle迪庆牛 Diqing cattle 0.037 滇中牛 Dianzhong cattle 0.019 0.029 文山牛 Wenshan cattle 0.019 0.030 0.024 昭通牛 Zhaotong cattle 0.031 0.024 0.027 0.028 ![]()
图 2 基于群体间遗传距离构建的聚类树Figure 2. Cluster tree based on the genetic distances between populations由表3可知：各群体间的遗传分化指数(Fst值)在−0.015 34~0.671 32之间，昭通牛与其他地方牛群体间的Fst值在0.023 32~0.552 10之间，其中，与迪庆牛的Fst值最小，与德宏高峰牛的Fst值最大；昭通牛与其他地方牛群体间的基因流(Nm值)在0.20~10.47之间。
表 3 云南地方牛群体间遗传分化指数和基因流Table 3. Genetic differentiation index and gene flow among of local cattle in Yunnan群体
populations德宏高峰牛
Dehong humped cattle迪庆牛
Diqing cattle滇中牛
Dianzhong cattle文山牛
Wenshan cattle迪庆牛 Diqing cattle 0.671 32/0.12 滇中牛 Dianzhong cattle 0.305 48/0.57 0.216 57/0.90 文山牛 Wenshan cattle 0.298 82/0.59 0.218 57/0.89 −0.015 34/−16.54 昭通牛 Zhaotong cattle 0.552 10/0.20 0.023 32/10.47 0.098 42/2.29 0.099 26/2.27 注：“/”前的数据为遗传分化指数，“/”后的数据为基因流。
Note: The data before “/” are genetic differentiation index, and the data after “/” are gene flow.2.4 世系组成
按照近年对普通牛和瘤牛mtDNA世系划分的标准[2-3]，云南5个本地牛的mtDNA世系划分结果(表4)显示：昭通牛存在普通牛和瘤牛2个mtDNA世系。就瘤牛世系而言，昭通牛在目前已发现的2个瘤牛mtDNA世系中都有分布，其中I1世系占37.76%，I2世系占1.02%；就普通牛世系而言，昭通牛群体中只含有T2、T3和T4世系，分别占5.10%、43.88%和12.24%。
表 4 云南本地牛群体的mtDNA世系及占比Table 4. mtDNA lineages and proportions of the Yunnan native cattle群体
populations个体数
number of individuals瘤牛
Bos indicus普通牛
Bos taurusI1世系
I1 lineageI2世系
I2 lineage总和/%
totalT2世系
T2 lineageT3世系
T3 lineageT4世系
T4 lineage总和/%
total昭通牛
Zhaotong cattle98 37 (37.76) 1 (1.02) 38.78 5 (5.10) 43 (43.88) 12 (12.24) 61.22 文山牛
Wenshan cattle53 31 (58.49) 3 (5.66) 64.15 3 (5.66) 13 (24.53) 3 (5.66) 35.85 德宏高峰牛
Dehong humped cattle34 32 (4.12) 2 (5.88) 100.00 0 0 0 0 迪庆牛
Diqing cattle49 7 (14.29) 6 (12.24) 26.53 2 (4.08) 29 (59.19) 5 (10.20) 73.47 滇中牛
Dianzhong cattle53 32 (60.38) 2 (3.77) 64.15 0 18 (33.96) 1 (1.89) 35.85 注：括号前的数据为数量；括号中的数据为占比，单位：%。
Note: The data before brackets are the number; the data in brackets are proportion, unit: %.2.5 单倍型遗传关系的系统发育树与中介网络图
由图3a可知：36个单倍型中，H01~H09属于瘤牛血统，其中H01~H07和H09属于瘤牛血统的I1世系，H08属于瘤牛血统的I2世系；H10~H36属于普通牛血统，其中H11 和H12属于普通牛血统的T2世系，H10、H13~ H24、H27~H30和H34~H36属于普通牛血统的T3世系，H25、H26和H31~H33属于普通牛的T4世系。昭通牛的群体遗传构成是普通牛和瘤牛mtDNA世系的混合组成，普通牛和瘤牛世系的占比分别为61.22%和38.78%。中介网络图(图3b)分析表明：普通牛mtDNA单倍型世系与瘤牛mtDNA单倍型世系间差异较大，两者间存在至少25个突变位点。
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图 3 昭通牛群体单倍型遗传关系的系统发育树(a)和中介网络图(b)注：b) 虚线框代表不同mtDNA世系，“|”代表变异位点，圆圈面积大小与单倍型频率成正比。Figure 3. Phylogenetic tree (a) and mediation network diagram (b) of genetic relationships among haplotypes in Zhaotong cattleNote: b) dashed regions represent different mtDNA lineages, the “|” represent variation sites, the circle area is proportional to the haplotype frequency.3. 讨论
中国多个地方黄牛群体的mtDNA D-loop区遗传多样性研究表明：中国地方黄牛群体具有丰富的遗传多样性[2, 11, 19]。本研究对98头昭通牛mtDNA D-loop区序列进行测定，共发现73个突变位点，定义了36种单倍型，单倍型多样度为0.880±0.027，核苷酸多样度为0.02443±0.000 94，群体内遗传距离为0.026±0.004，群体内遗传多样性指数为0.027±0.004。其中，单倍型多样度和核苷酸多样度是衡量群体遗传变异的重要指标[19]，它们的值越大，说明群体的遗传多样性越丰富。核苷酸多样度不受样本量和序列长度的影响，因此是衡量群体遗传多样性水平的首要指标。对中国57个地方牛群体的mtDNA D-loop序列进行变异分析发现：所有序列的单倍型多样度为0.904±0.008，核苷酸多样度为0.025 7±0.000 1；其中，26个牛种的单倍型多样度低于昭通牛(0.880)，36个牛种的核苷酸多样度低于昭通牛[2]。LEI等[5]对33个中国地方黄牛群体的研究表明：中国黄牛的mtDNA D-loop区序列的单倍型多样度为0.9148±0.0131，核苷酸多样度为0.0258±0.0126；其中19个黄牛群体的核苷酸多样度小于昭通牛。XIA等[20]对广西3个本地牛品种的mtDNA D-loop序列进行测定及分析发现：隆林牛、南丹牛和涠洲牛的单倍型多样度分别为0.957±0.030、0.876±0.063和0.949±0.037，核苷酸多样性分别为0.004 09±0.001 63、0.006 40±0.001 43和0.000 24±0.000 03，3个牛种的核苷酸多样度都低于昭通牛。昭通牛与本研究对比的云南其他4个地方牛群体相比，核苷酸多样度最高。以上结果表明昭通牛群体的群体遗传多样性在中国地方牛中处于相对较高的水平。
遗传距离可以衡量群体间的遗传关系和遗传差异[21]。本研究表明：昭通牛与迪庆牛间的遗传距离最小(0.024)，与德宏高峰牛间的遗传距离最大(0.031)，表明昭通牛与迪庆牛间的遗传关系最近，而与德宏高峰牛间的遗传关系最远，遗传差异较大。遗传分化指数(Fst值)是估测种群间和种群内遗传相似性的指数，以亚种群间的遗传分化占总的遗传多样性的比例来表示[22]，是群体间遗传分化的度量值。基因流(Nm值)是群体间的基因流动，是影响群体内和群体间遗传变异程度的重要因素[18]。本研究显示：昭通牛与迪庆牛间遗传分化最小，Fst值为0.023 32，Nm值为10.47；与德宏高峰牛间遗传分化最大，Fst值为0.552 10，Nm值为0.20。以上结果表明昭通牛与迪庆牛间的遗传分化最小，而与德宏高峰牛间的遗传分化最大。
本研究表明：昭通牛存在普通牛和瘤牛2个母系世系，普通牛血统占61.22%，瘤牛血统占38.78%。在遗传组成上，昭通牛与云南其他4个牛种存在一定的差异。迪庆牛、昭通牛、文山牛和滇中牛的普通牛mtDNA世系占比分别为73.47%、61.22%、35.85%和35.85%，其瘤牛mtDNA世系占比分别为26.53%、38.78%、64.15%和64.15%；而德宏高峰牛的血统构成有别于这4个牛种，仅存在瘤牛血统，占比为100.00%。形成这种遗传组成地理格局的原因可能与普通牛和瘤牛2种血缘世系在中国的扩散路线及其相遇混合的程度有较大关系。中国云南省的西部和南部与南亚瘤牛的主要扩散地缅甸、老挝和越南等东南亚国家接壤，这一地区的牛种受瘤牛血统的影响较大。就本研究中的5个牛种而言，德宏高峰牛、文山牛和滇中牛的瘤牛mtDNA世系占比较高，其分布地与东南亚地区相邻或较近，特别是德宏高峰牛，其分布地与缅甸相邻，离印度(瘤牛分布地)较近，其瘤牛血统占比最高(100.00%)；而分布于云南省北部的迪庆牛和东北部的昭通牛，其普通牛mtDNA世系占比较高，它们的分布地距离东南亚地区相对较远，与四川和贵州相邻，推测它们受中国内地牛种普通牛血统的影响更大。本研究发现：昭通牛的普通牛T2世系占5.10%，T3世系占43.88%，T4世系占12.24%；瘤牛I1世系占37.76%，I2占1.02%。推测昭通牛中的普通牛T2、T3和T4世系可能是在中原文化向云南的传播过程中由中国北方牛种混入，这些普通牛mtDNA世系最初起源于近东、欧洲和东北亚地区，而昭通牛中的瘤牛I1和 I2世系则来自由东南亚地区传入的南亚瘤牛血统。在一系列的文化传播与交流中，来自2个方向的普通牛血统和瘤牛血统在当地汇合，经过长期的人工选育和风土驯化，逐渐形成了现在的昭通牛。
周艳等[10]和JIA等[1]分别对7头和21头昭通牛mtDNA D-loop区序列进行了测定，结果显示：序列的单倍型多样度为0.952±0.096，核苷酸多样度为0.02504；普通牛和瘤牛血统分别占71.43%和28.57%。LI等[11]对云南地方牛mtDNA多样性及系统地理结构的研究结果显示：昭通牛群体的单倍型多样度为0.974，核苷酸多样度为0.02547；普通牛血统和瘤牛血统分别占60.9%和39.1%。与以上结果相比，本研究揭示目前的昭通牛群体遗传多样性水平有所下降，群体中普通牛和瘤牛mtDNA世系占比有一定变化，普通牛血统比例下降，瘤牛血统比例上升，说明该牛种近年可能存在更多瘤牛血统的基因渗入。昭通牛与瘤牛血统占比较高的云南文山牛、滇中牛群体间基因流较大，该牛近年是否与这2个牛种或云南其他牛种有过基因交流，导致其瘤牛血统比例上升，有必要进一步研究。
4. 结论
昭通牛群体遗传多样性丰富，存在普通牛和瘤牛2个母系起源，其血统占比分别为61.22%和38.78%，血统构成有别于云南其他地方牛种。本研究推测昭通牛群体中的普通牛T2、T3和T4世系可能是在中原文化的传播过程中由中国北方牛种中的普通牛世系混入所致；而瘤牛I1和I2世系则来自东南亚地区传入的瘤牛血统。现今的昭通牛与10年前的昭通牛在血统构成上有较大差异，推测近年可能存在一定瘤牛血统的基因渗入。
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图 1 昭通牛mtDNA D-loop区的突变位点及定义的单倍型
注：H01~H36表示在昭通牛中发现的36种单倍型；“·”表示与参考序列核苷酸相同，“-”表示缺失的核苷酸；图中数字按列读取，每一列上的数值代表突变位点的位置信息；位置记录所用参考序列L27733.1也属于H01。
Figure 1. Mutation sites and defined haplotypes based in mtDNA D-loop sequences of Zhaotong cattle
Note: H01-H36 indicate the 36 haplotypes found in Zhaotong cattle; “·” indicates the same nucleotide as the reference sequence, “-” indicates the missing nucleotide; the numbers in the figure are read in columns, and the values on each column represent the location information of the mutation sites; the reference sequence L27733.1 used for position locating also belongs to H01.
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图 2 基于群体间遗传距离构建的聚类树
Figure 2. Cluster tree based on the genetic distances between populations
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图 3 昭通牛群体单倍型遗传关系的系统发育树(a)和中介网络图(b)
注：b) 虚线框代表不同mtDNA世系，“|”代表变异位点，圆圈面积大小与单倍型频率成正比。
Figure 3. Phylogenetic tree (a) and mediation network diagram (b) of genetic relationships among haplotypes in Zhaotong cattle
Note: b) dashed regions represent different mtDNA lineages, the “|” represent variation sites, the circle area is proportional to the haplotype frequency.
表 1 云南地方牛群体的遗传多样性
Table 1 Genetic diversity of Yunnan local cattles
群体
populations单倍型数
number of
haplotype单倍型多样度
haplotype
diversity核苷酸多样度
nucleotide
diversity群体内遗传距离
mean distance
within population群体内遗传多样性指数
genetic diversity index
within population昭通牛
Zhaotong cattle36 0.880±0.027 0.02443±0.00094 0.026±0.004 0.027±0.004 文山牛
Wenshan cattle23 0.823±0.052 0.02283±0.00196 0.024±0.003 0.025±0.005 德宏高峰牛
Dehong humped cattle11 0.585±0.100 0.00183±0.00054 0.002±0.001 0.002±0.001 迪庆牛
Diqing cattle27 0.963±0.012 0.02100±0.00270 0.022±0.003 0.023±0.004 滇中牛
Dianzhong cattle18 0.869±0.032 0.02266±0.00177 0.024±0.003 0.025±0.006 全部
total86 0.882±0.017 0.02482±0.00030 0.027±0.004 0.027±0.005 
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表 2 云南地方牛群体间遗传距离
Table 2 Genetic distances between local cattle in Yunnan
群体
populations德宏高峰牛
Dehong humped cattle迪庆牛
Diqing
cattle滇中牛
Dianzhong cattle文山牛
Wenshan cattle迪庆牛 Diqing cattle 0.037 滇中牛 Dianzhong cattle 0.019 0.029 文山牛 Wenshan cattle 0.019 0.030 0.024 昭通牛 Zhaotong cattle 0.031 0.024 0.027 0.028
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表 3 云南地方牛群体间遗传分化指数和基因流
Table 3 Genetic differentiation index and gene flow among of local cattle in Yunnan
群体
populations德宏高峰牛
Dehong humped cattle迪庆牛
Diqing cattle滇中牛
Dianzhong cattle文山牛
Wenshan cattle迪庆牛 Diqing cattle 0.671 32/0.12 滇中牛 Dianzhong cattle 0.305 48/0.57 0.216 57/0.90 文山牛 Wenshan cattle 0.298 82/0.59 0.218 57/0.89 −0.015 34/−16.54 昭通牛 Zhaotong cattle 0.552 10/0.20 0.023 32/10.47 0.098 42/2.29 0.099 26/2.27 注：“/”前的数据为遗传分化指数，“/”后的数据为基因流。
Note: The data before “/” are genetic differentiation index, and the data after “/” are gene flow.
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表 4 云南本地牛群体的mtDNA世系及占比
Table 4 mtDNA lineages and proportions of the Yunnan native cattle
群体
populations个体数
number of individuals瘤牛
Bos indicus普通牛
Bos taurusI1世系
I1 lineageI2世系
I2 lineage总和/%
totalT2世系
T2 lineageT3世系
T3 lineageT4世系
T4 lineage总和/%
total昭通牛
Zhaotong cattle98 37 (37.76) 1 (1.02) 38.78 5 (5.10) 43 (43.88) 12 (12.24) 61.22 文山牛
Wenshan cattle53 31 (58.49) 3 (5.66) 64.15 3 (5.66) 13 (24.53) 3 (5.66) 35.85 德宏高峰牛
Dehong humped cattle34 32 (4.12) 2 (5.88) 100.00 0 0 0 0 迪庆牛
Diqing cattle49 7 (14.29) 6 (12.24) 26.53 2 (4.08) 29 (59.19) 5 (10.20) 73.47 滇中牛
Dianzhong cattle53 32 (60.38) 2 (3.77) 64.15 0 18 (33.96) 1 (1.89) 35.85 注：括号前的数据为数量；括号中的数据为占比，单位：%。
Note: The data before brackets are the number; the data in brackets are proportion, unit: %.
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