小麦4个WAKs/WAKLs基因的分子特征及其响应条锈菌侵染的表达
鉴定4个小麦WAKs/WAKLs基因，研究其响应条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)侵染的表达模式。
从小麦条锈病抗病材料云337和感病材料云402转录组差异表达的基因中筛选出4个WAKs/WAKLs基因，对其基因结构、蛋白质理化性质、保守结构域和进化进行分析，通过RT-qPCR验证4个基因在小麦接种条锈菌后的表达模式。
所鉴定的TraesCS1B02G004100、TraesCS6B02G459100、TraesCSU02G079300和TraesCS3A02G122300基因长度分别为3 194、5 117、3 208和2 934 bp，分别编码714、960、737和652个氨基酸，均包括胞外GUB结构域和胞内激酶结构域，均位于细胞膜。系统进化分析表明：TraesCS6B02G459100与水稻Os05g04460、TraesCSU02G079300与水稻Os02g02120、TraesCS3A02G122300与拟南芥AtWAKL15、TraesCS1B02G004100与大麦HORVU.MOREX.r3.5HG0503880的亲缘关系分别最近。激酶部位氨基酸序列分析表明：TraesCS1B02G004100和TraesCSU02G079300为与植物先天免疫机制相关的非RD激酶，TraesCS6B02G459100和TraesCS3A02G122300为RD激酶。基因表达分析表明：4个WAKs/WAKLs基因在小麦接种条锈菌后均差异表达，其中TraesCS1B02G004100在抗病材料中的表达被抑制、在感病材料中不表达。
TraesCS3A02G122300和TraesCSU02G079300在小麦与条锈菌亲和及非亲和互作体系中均差异表达；TraesCS6B02G459100和TraesCS1B02G004100仅在非亲和互作中特异表达。非RD激酶TraesCS1B02G004100表达受到抑制，其调控抗病性的功能和机制需进一步研究。
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关键词:
- 小麦 /
- WAKs/WAKLs基因 /
- 表达分析 /
- 条锈菌
Molecular Characteristics of Four WAKs/WAKLs Genes in Wheat and Their Expression in Response to Puccinia striiformis f. sp. tritici Infection
To identify four wheat WAKs/WAKLs genes and analyze their expression patterns responding to Puccinia striiformis f.sp. tritici (Pst) infection.
Four WAKs/WAKLs genes were screened from transcriptome differentially expressed genes of wheat, which inoculated Pst in resistant variety Yun337 and susceptible variety Yun402. The gene structure, physicochemical property of protein, conserved domains and phylogenetic relationship were analyzed, and the expression patterns of four genes in wheat inoculated Pst were verified by RT-qPCR.
The full lengths of TraesCS1B02G004100, TraesCS6B02G459100, TraesCSU02G079300, and TraesCS3A02G122300 were 3194, 5117, 3208, and 2934 bp, respectively; they encoded 714, 960, 737 and 652 amino acids, respectively; they all included extracellular GUB domain and intracellular Ser/Thr kinase domain; and they were all located on the cell membrane. Phylogenetic analysis showed that TraesCS6B02G459100 with Os05g04460, TraesCSU02G079300 with Os02g02120, TraesCS3A02G122300 with AtWAKL15, TraesCS1B02G004100 with HORVU.MOREX.r3.5HG0503880, had a close relationship, respectively. The kinase site amino acid analysis showed that TraesCS1B02G004100 and TraesCSU02G079300 were non-RD kinases related to plant innate immune mechanism, while TraesCS6B02G459100 and TraesCS3A02G122300 were RD kinases. Gene expression analysis showed that four WAKs/WAKLs genes in wheat were expressed differently upon infection of Pst, and TraesCS1B02G004100 was down-regulated in resistant variety but scarcely expressed in susceptible variety.
TraesCS3A02G122300 and TraesCSU02G079300 are expressed differently in both compatible and incompatible interactions between wheat and Pst; TraesCS6B02G459100 and TraesCS1B02G004100 are only respectively expressed in incompatible interaction. The expression of non-RD receptor kinase gene TraesCS1B02G004100 is inhibited, and its function and mechanism in disease resistance deserve further investigation.
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水体形成季节性的稳定物理分层是水库的重要特征[1]。水库中水体停留时间长，流速缓慢，水库整体更新慢，因而水库是人为形成的容积巨大的停滞水域[2]。夏季，气温的升高会使表层水体水温升高，但一定的水深又使水体在垂直方向上的传热不均，因此导致水体形成上高下低的水温结构，引起水体密度在垂直方向上的上轻下重，借助于水库的大水力停留时间，形成垂直方向上的物理分层[3]。尤其夏季太阳辐射强烈时期，水体垂直方向上的温差进一步加大，垂直方向密度差异随之进一步加大，因此在夏季高温时期会形成最为稳定的分层结构[4-5]。所以，水温分层的形成和演变过程是明确水体季节性分层的基础。
长时间和大温差的稳定分层结构会影响水库水体的物理性质、化学反应过程和生物活动[4, 6-8]。水库水体稳定分层结构的形成，使水体在垂直方向上具有了温度梯度最大的温跃层。温跃层的存在减弱或阻碍了上下水体的对流和混合，抑制了水体垂直方向上的物质交换，尤其引起溶解氧向下传输的减少，造成底层水体形成缺氧或厌氧的还原环境[9-11]。沉积物中的金属元素和营养盐等在微生物的作用下释放进入底层水体，形成内源污染，使水质恶化[12-13]。在气温下降的秋冬季时期，表层水体水温降低，而底层水体由于表层水体的覆盖，受气温的影响滞后，水温高于表层水体，水层的密度差异形成“翻库”，导致底层水体携带还原性金属元素及营养盐上浮，对水库整体造成污染[14]。同时，湖库的稳定分层附加传统的底层取水方式会对下游的生态环境产生负面影响。湖库稳定分层时期，底层水体溶解氧含量和水温均较低，理化指标较差，对于河道内水生生物的生长和繁殖形成抑制，对下游农作物的生长机能产生不利影响，也不利于景观用水的使用[15]。
水温、水体透明度和水深与水体热分层参数(如温跃层深度、厚度和强度)有一定的相关性[16]。其中，一定的水深能够保证夏秋季节稳定分层时期形成完整的3层结构，同时能够维持恒温层较为恒定的低温，而温度对于微生物的活性和化学反应过程具有较大影响。相反，较浅的水深可能在一定时期不能形成完整的3层结构，同时会导致不同季节底层水温受气温的影响而波动，从而影响微生物活性、水化反应速率以及沉积物释放，进而对于水库水质的作用程度产生影响[17]。
鉴于大型深水型水库对于区域经济和社会发展的重大意义，近年来对于此类水库的热分层形成机理、水质响应特征以及水质原位修复改善的研究颇多。如贵州高原红枫湖水库(最大水深45 m)[18]、亚热带特大山谷型水库−千岛湖(正常水位106~107 m)[16-17]、北方峡谷型水库−黑河水库(平均水位70~90 m)[11]和金盆水库(正常水位94 m)[19]等，以上水库的深度一般均在30 m以上，能够形成完整和典型的3层结构，是研究热分层结构的典型样本。实际上，水体水深超过7 m的水库就有可能形成温跃层[20]，而水深更深的深水型水库会形成完整的3层结构。对于深度在10~30 m以下的亚深型水库，水体的分层结构必然会出现受水深影响的变化特征，进而会呈现出有别于深水型水库的水体物理、化学和生物指标的响应特征。
亚深型水库具有数量众多和分布广泛的特点，对于区域经济发展和水环境保护具有重要作用。以位于浙江省台州市的长潭水库为例，该水库是集供水、灌溉、防洪和发电于一体的大(Ⅱ)型水库，为地区经济发展和生态环境改善提供了重要保证。该水库虽然最大水深为42 m，但由于位于亚热带台风多发区，年降水量达到2 000 mm左右，且降雨量主要集中在夏秋的梅雨季节，降雨、台风及高温等多种气候现象叠加，为保证防台和防洪要求，水库蓄水水位长期位于30 m以下，因此实质上运行水深较浅。由于热分层的影响，长潭水库的水质会出现季节性变化，近年来其水质的季节性变化逐渐受到关注。因此，长潭水库是一座较为典型的亚深型热分层水库。随着台州市对于长潭水库周边生态环境治理的持续投入，森林覆盖率较高，面、点源污染输入基本绝迹，入库河流的水质持续改善。因此，内源污染成为长潭水库水质季节性恶化的根本原因[13]。
为加强长潭水库供水水质的可预测性，推动水库水质修复改善技术研究，对水库进行科学管理，有必要对于类似于长潭水库的亚深型水体的热分层结构尤其是温跃层的形成规律进行研究。以长潭水库为研究对象，探讨浅层水库(水深在10~30 m)热分层结构的形成及水质响应特征，以期对亚深型水库的内源污染形成机制以及原位水质改善技术研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 研究区域概况
长潭水库(N28°30′~28°40′，E121°00′~121°04′)位于浙江省台州市西部的永宁江上游。水库集水面积441 km2，年均降水量1 948 mm，入库水量5.65×109 m3。坝高43 m，最高水位42 m，总库容7.32×109 m3。长潭水库灌溉面积6.95万hm2，防洪面积1.87万hm2，水电站总装机容量9 920 kW，供水范围覆盖台州市南部五县区和数万家企业。
1.2 采样及测试
库区内靠近大坝的深水区是长滩水库分层结构比较明显的区域，也是水库出水口所处位置。如图1所示：本次试验水样采集地点设置在长潭水库大坝处(N28°36′36″，E121°04′23″)。
2018年1—12月在采样点持续进行监测采样。采集频率为每月3次，设置在每月的上旬(5日 ±2 d)、中旬(15日 ±3 d)和下旬(25日 ±3 d)各采样1次，采样的时间集中在每日上午的9：00—11：00，然后取3次的平均值。采用便携式多参数水质测定仪(意大利产HANNA)现场测定水温、pH和溶解氧(DO)。水样取回实验室后首先经0.45 μm醋酸纤维膜过滤，然后进行叶绿素a的测定，测定方法为丙酮萃取分光光度法[21]。
1.3 数据处理
水体相对稳定性(relative water column stability，RWCS)采用以下公式计算的结果进行判别[22]。
$ {\rm{RWCS}} = \left( {{D_{\rm{h}}} - {D_{\rm{s}}}} \right)/\left( {{D_4} - {D_5}} \right) $
(1) 式中，Dh为底层水体密度；Ds为表层水体密度；D4和D5分别为纯水4 ℃和5 ℃时的密度。
垂直方向温度梯度大于0.2 ℃/m的水层定义为温跃层，相应地，该水层上部水深定义为温跃层上界，该水层下部水深定义为温跃层下界，上下界的差值定义为温跃层的厚度，温跃层的垂直方向温度梯度定义为温跃层的强度[23]。
2. 结果与分析
2.1 水温垂直分层与季节变化
如图2所示：2018年春季，长潭水库水体剖面平均水温从大到小的顺序是1月>3月>2月。从表层水体温度变化来看，1月最高，3月次之，2月最低；底层水温变化与表层基本相同，表底层水温差异不大，最大在1月，为2.43 ℃。从垂直方向水温变化来看，1—3月的水温剖面分布温差变化不大，1—3月的温度分别为 (13.33±0.12) ℃ (平均值±平均偏差，下同)、(11.46±0.04) ℃和(12.16±0.08) ℃，可认为整体垂直方向掺混均匀，水温无明显分层。
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图 2 长潭水库水温的垂直剖面变化Figure 2. Vertical profile variation of water temperature in Changtan Reservoir4月的表层水温为14.35 ℃，与底层水温相差3.24 ℃；垂直方向来看，其温度变化可分为3个水段，在0~2.5 m范围内，平均温度为(14.34±0.01) ℃，温度基本不变；在2.5~14.5 m范围内，平均温度为(13.03±0.16) ℃，垂直方向温差逐渐增大；在14.5~25.5 m范围内，平均温度为(11.54±0.25) ℃，垂直方向温差较上一层有所减少。同样，5—6月具有类似的规律，即虽然随着水深的增加，水体垂直方向上的温度逐渐降低，但是在3种不同的深度范围内，降低的速率不同。由此可见，4—6月虽然表层水体温度升高较快，但底层水温基本维持在11.21~12.25 ℃范围内，受表层水体温度升高的影响较小。
7—9月是长潭水库气温最高的3个月份。该时期水温的剖面分布特征与5、6月相比，既有相同的变化趋势又有不同的水层结构特征。与5、6月相同的是，随着水深的增加，水温明显下降；区别在于7—9月期间如果按照垂直方向水温的差异进行水层的分类，那么长潭水库在该时期只有2个明显水层。以8月为例，在0~3.5 m的垂直水段内，平均温度为(33.51±0.10) ℃，温度基本保持不变；进入3.5~26.5 m的水段内，平均温度为(24.57±3.73) ℃，温度在33.36~17.72 ℃之间变化。同时可以看出：随着气温升高，底层水温受到了气温影响，由6月的12.25 ℃升高到了8月的17.72 ℃，随着9月的气温降低，底层水温回落到15.38 ℃。
表层水温受气温影响，表现为10月>11月>12月。在10—11月，同7—9月的情况类似，长潭水库继续维持2层结构特征。以10月为例，在0~11.5 m的水层范围内，平均水温为(24.83±0.19) ℃，温度在24.57~25.08 ℃之间变化，温度差异较小；在11.5~25.5 m的水层内，平均水温为(19.45±1.81) ℃，温度在24.57~16.84 ℃之间变化，温度差异较大。而在12月，长潭水库垂直方向水体已经完全混合，分层结构已经消失。10—12月，长潭水库底层水温趋向于一致，在15.86~16.84 ℃之间变化。
2.2 水体稳定性和降雨量变化
如图3所示：长潭水库的RWCS自1—12月呈现单峰变化。在1—3月，RWCS值的变化较为平稳，在3.5~13.25之间变化；自4月开始，随着气温升高，表层水温提升，RWCS随之升高，最大值出现在8月，为521；进入9月以后，气温降低，表层水体温度降低，表层和底层水温差异减小，在12月水体达到完全混合，RWCS降为10.13。从降雨量的月份分布来看，全年总降雨量为1 835.5 mm，其中雨季集中分布在5—6月以及8—10月，占全年降雨量的70.55%，与热分层期基本重叠。
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图 3 水体相对稳定性(RWCS)及月平均降雨量Figure 3. Relative water column stability (RWCS) and average monthly rainfall in Changtan Reservoir2.3 温跃层结构的季节性变化
如图4所示：温跃层上界初期位置较浅，后期位置下降明显。5—8月，温跃层上界距离水体表层较小，温跃层深度较浅，主要在3~4 m左右变动。进入9月以后，温跃层下潜，深度增加，温跃层上界与表层水体的距离增加，从9月的7.5 m一直下降至11月的17.5 m。
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图 4 水体相水体温跃层强度及厚度的季节性变化Figure 4. Seasonal variation of strength and thickness of thermocline in Changtan Reservoir在分层结构形成后，温跃层下界不断下降，直至水库底部。5—6月，温跃层下界不断向下延伸，从5月的17.5 m延伸至6月的22.5 m，7月，温跃层下界继续下降，对恒温层形成持续的挤压作用，直至温跃层下界触及水库底部，恒温层消失。因此，在不同的稳定分层时期内，长潭水库分层呈现不同的结构特征，在5—6月为3层结构分层期，7—11月为2层结构分层期，而恒温层只存在于5—6月。
在分层期内，温跃层厚度变化较为复杂。5—8月，温跃层的厚度处于不断增加的时期，从14 m (5月)→19 m (6月)→21 m (7月)向23 m (8月)变化，厚度最大的8月占水深的85.19%。9—11月，温跃层处于不断变薄的时期，厚度从9月的19 m一直减少至11月的8 m。
温跃层强度是衡量和判别热分层结构的重要指标之一。5—6月，随着水温升高，温跃层强度从5月的0.38 ℃/m达到最大值0.70 ℃/m。进入7月，温跃层的强度开始下降至0.53 ℃/m。8月，温跃层的强度回升至0.68 ℃/m。9月，随着水温的下降，温跃层强度又降至0.57 ℃/m，10月，温跃层强度继续降低至0.55 ℃/m。11月，温跃层强度突然有所上升，达到自9月以来的最高值，为0.63 ℃/m。
2.4 长潭水库溶解氧(DO)及pH的季节性变化
如图5所示：长潭水库中DO的垂直方向分布呈现出明显的季节性特征。
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图 5 长潭水库溶解氧(DO)垂直方向分布的季节性变化Figure 5. Seasonal variation of dissolved oxygen (DO) vertical distribution in Changtan Reservoir在1—2月，表层水体和底层水体的DO差别不大。进入3月后，随着气温的升高，水温随之上升，在表层的0~8 m处出现DO跃层，DO的质量浓度为0.11 mg/L。
进入4月，虽然长潭水库依然没有形成稳定的分层结构，但是由于藻类在真光层内的光合作用，DO在水体的5 m左右达到最大值(11.08 mg/L)，随后，DO值持续下降，至底层水体时降为8.33 mg/L，在5~26 m之间的平均DO质量浓度梯度为0.13 mg/(L·m)。进入5月后，长潭水库DO的垂直方向分布继续维持4月的单峰分布特征，即在5 m左右达到DO质量浓度的最大值(12.08 mg/L)，随后DO质量浓度持续下降，但平均质量浓度梯度增大至0.29 mg/(L·m)，且由于稳定的分层结构的形成(图2)，底层水体DO下降至6.56 mg/L。进入6月后，由于真光层内藻类作用导致的DO极大值达到12.42 mg/L，垂直方向平均DO质量浓度梯度较5月增加至0.45 mg/(L·m)，而底层水体的DO进一步降至3.84 mg/L。
进入7—9月，长潭水库的DO垂直方向分布自上而下呈现出明显的3峰特征，第1峰为藻类在5~8 m的范围内由于光合作用使DO增加的缘故；随着水深增加，由于处于温跃层内，水温较高，有机物的分解速率加快，耗氧速率增加，DO含量迅速下降，在12~14 m范围内形成第2峰，如9月DO质量浓度在13 m处低至2.06 mg/L，这可能与水温降低，藻类大量死亡有关；有机物消耗后，水体内DO含量逐渐上升，至19~21 m处，由于底层水体沉积物还原物质释放过程中的耗氧作用，因而形成第3峰。7—9月的最大DO梯度均由水体有机物矿化贡献，分别为0.52、0.83和0.71 mg/(L·m)，底层水体DO质量浓度分别为2.35、2.65和1.83 mg/L。
在10月，DO在0~10 m范围内混合较为均匀，11月，DO混合质量深度增加至17 m，而进入12月，长潭水库整个水体剖面DO已经完全混合均匀。10—11月底层水体DO质量浓度分别为2.29和3.24 mg/L，而12月底层水体DO质量浓度已经恢复至7.43 mg/L。
如图6所示：1—3月水体垂直方向pH分别为7.53±0.07、7.02±0.26和7.18±0.08，整体呈现中性。
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图 6 长潭水库pH值垂直方向分布的季节性变化Figure 6. Seasonal variation of pH vertical distribution in Changtan Reservoir进入4月，pH的垂直方向分布较为均匀，为7.66±0.16。5—6月10 m以下水体的pH分别为7.54±0.11和7.51±0.16。5月，在表层水体0~5.5 m范围内，pH为8.82±0.25；6月，在表层水体0~7.5 m范围内，pH为8.93±0.08。因此，长潭水库4月水体垂直方向呈中性，5—6月表层水体由于藻类的光合作用而偏弱碱性，而底层水体呈中性。
7月，4.5 m以上水体的pH为9.04±0.12，8—9月在7.5 m以上水体的pH分别是9.43±0.05和9.19±0.10。7—9月底层水体的pH分别为6.86±0.07、6.42±0.01和6.63±0.01。所以，7—9月长潭水库表层水体呈弱碱性，底层水体由于温跃层的包裹和覆盖呈弱酸性。
10—12月，10 m以上水体的pH分别为7.69±0.038、7.48±0.039和7.39±0.036。10—11月，距库底3 m范围内的底层水体的pH分别为6.59±0.064和6.52±0.13。12月，pH垂直方向分布均匀，为7.40±0.032。因此，10—11月长潭水库表层pH呈现中性，底层水体pH呈现弱酸性，12月水体pH呈均匀分布，呈中性。
2.5 长潭水库叶绿素a的季节性变化
如图7所示：长潭水库叶绿素a的垂直方向分布特征的季节性变化较为明显。
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图 7 长潭水库叶绿素a质量浓度的季节性变化Figure 7. Seasonal variation of mass concentration of chlorophyll a vertical distribution in Changtan Reservoir1—2月长潭水库叶绿素a的垂直方向分布的离散性变化较大，整体有1月>2月的趋势。如1月叶绿素a质量浓度为(1.11±0.48) μg/L，2月叶绿素a质量浓度为(1.03±0.21) μg/L。3月，随着气温上升，同时，“翻库”后真光层中营养盐浓度增加，有利于浮游植物的生长，叶绿素a在表层3~5 m处出现极大值，随后，由于水体结构较为稳定，垂直方向混合减弱。
4月，叶绿素a基本维持了3月的分布规律。进入5月后，叶绿素a的质量浓度在表层水体3~4 m处达到极大值(4.37 μg/L)，是4月极大值的2.34倍。6月，长潭水库叶绿素a的质量浓度持续增大，最大值达到4.83 μg/L，分布在表层水体的2~3 m处，而在垂直方向分布上，整体离散性较大。
7—8月，长潭水库叶绿素a质量浓度在7~8 m处继续呈现极大值，分别达到2.64 μg/L 和 3.62 μg/L，9 月后此值减小至 1.68 μg/L，位置上抬至4~5 m处。
10月，叶绿素a质量浓度的垂直方向分布重复夏季的规律，并在表层水体5~6 m处达到极大值(3.41 μg/L)。11月，15 m以上水层叶绿素a的离散性增加；12月，叶绿素a的垂直方向分布离散性整体较大。
从叶绿素a的全年垂直方向分布来看，3、4、5、7、8、9和10月基本呈现单峰的变化特征，且极大值出现在表层水体3~8 m处，叶绿素a质量浓度的最大值出现在夏季长潭水库分层结构最为稳定的时期。
3. 讨论
3.1 长潭水库水温层化结构的演替模式
(1)水温分层结构的季节性变化
水温的季节性变化是水库形成稳定分层的必要条件[10]，而垂直方向水温的分布能够较为直观地反映水温的分层变化[24]。1月水温自表层至底层逐渐增加，表明不断降低的大气环境温度对于水温产生了自上而下的影响，2月随着气温的持续降低，水体上下混合均匀的程度在增加，而3月，随着气温升高，表层水温升高。整体来看，在1—3月低气温条件下，长潭水库表层和底层的水体得到了充分混合。4—6月，随着气温的逐渐升高，平均水温升高，同时水体垂直方向温差加大。长潭水库水体变温层、温跃层和恒温层的3层结构初步形成。6—7月，受气温持续升高的影响，水温变化的下潜深度持续增加，恒温层的上界不断被压缩，但由于水深所限，恒温层的厚度不断减小，直至消失。因此，7—9月长潭水库水层具有明显的变温层和温跃层2层结构特征，这与同处亚热带地区的深水型水库千岛湖的分层特征明显不同[16]。10—12月，随着气温降低，长潭水库水体垂直方向混合深度不断增加。但是与其他时期不同，该时期水温的剖面分布呈现2种不同的状态：一是在10—11月继续维持长潭水库夏季2层结构特征；二是在12月，随着气温的持续降低，垂直方向温度梯度不断减小，分层结构消失。
比照RWCS值的变化，长潭水库分层期为5—11月，混合期为1—4月以及12月，全年呈现单循环的混合模式。
(2)温跃层结构特征对于热分层及水深的响应机制
温跃层的上界主要受气温的影响，而温跃层下界受气温和水深的共同作用。5—8月，由于气温较高，辐射作用强烈，温跃层深度较浅。9月以后，气温降低，温跃层下潜，温跃层上界深度增加。5—6月，随着气温升高，温跃层下界不断向下延伸；7月，由于长潭水库深度限制，温跃层下界已经触底，恒温层消失，水库垂直方向呈现温变层+温跃层的2层结构。8月，气温继续升高，温跃层下界持续与底部接触。9月及以后，由于气温降低，温跃层整体下潜，因此温跃层下界并未出现向上抬升的趋势，而是继续与底部接触，维持长潭水库2层的分层结构。
温跃层的厚度主要受气温和水深支配。5—8月，气温逐渐升高，温跃层的厚度不断加大。进入7、8月后，虽然受水深限制，但是温跃层厚度的整体趋势是不断加大的。9—11月，随着气温的降低，表层水温下降(图2)，受温跃层上界下潜以及长潭水库有限水深的影响，温跃层厚度不断减少，温跃层变薄。
在不同的时期内，温跃层的强度受水温的影响或者水温与水深的共同作用[25]。在5—6月的3层结构存在期，温跃层的强度主要受水温影响，这与传统意义上温跃层形成的机制类似[14]。7—11月的2层结构存在期，温跃层的强度受水温与水深的共同作用。进入7月，由于温跃层下界触底，温跃层的垂直方向剖面没有完整呈现，气温对于温跃层内水温产生影响，促使其强度明显下降，这与千岛湖内随水深增加温跃层强度增加的结论相同[16]。8月，由于降雨影响(图3)，长潭水库水深有所增加，同时受水温升高以及长潭水库水深增加的影响，温跃层的强度较7月有所增加。9和10月，由于水温持续下降，水深有所抬升，温跃层继续下潜，温跃层强度继续降低。11月，温跃层强度突然有所上升，主要是受温跃层内在较薄的水层内产生较大的温差所致。由于气温降低，温跃层表层水温降到了全年分层期内的最低温度，而底层水体由于温跃层的阻挡，继续维持较高的水温，因此在垂直方向深度较小的范围内产生了较大的温差。
3.2 长潭水库特殊分层结构影响下的水环境效应
(1) DO和pH的响应特征
DO的变化主要受水体物理分层结构的阻隔、藻类释氧和有机物矿化耗氧的影响。
1—2月，由于气温降低，水体处于垂直方向混合期，DO在垂直方向上的分布较为均匀，进入3月后，DO垂直方向质量浓度之所以形成跃层，主要是藻类在真光层内光合作用所致[26]。
4月，底层水体DO的质量浓度下降主要是因为表层藻类等初级生产者在生命活动中产生的有机物向下层水体沉降，并在水温升高的水体中不断矿化耗氧所致。进入5—6月，底层水体的DO进一步下降，同时温跃层的阻隔致使表层和底层的DO质量浓度差异增大，垂直方向平均DO质量浓度梯度有所增加。
7—9月，长潭水库处于2层分层结构时期。进入温跃层范围内的底层水体，由于温跃层的包裹，其水温较5、6月有所上升，上升的水温有利于沉积物中氧化还原反应的进行，进一步促使底层水体环境向缺氧状态转变。
10—12月，随着气温的持续下降，水体垂直方向混合深度不断增加。10和11月，由于气温降低，藻类对于DO的贡献已经可以忽略，主要是水体有机物矿化和沉积物内源释放耗氧。10和11月底层水体DO质量浓度受到温跃层的包围和阻隔作用，呈现较低数值。
水体中的pH变化主要受表层水体中藻类的光合作用和底部沉积物中的有机物厌氧氧化反应的共同影响[16, 27]。在混合期的1—3月，由于水体垂直方向混合较为均匀，DO质量浓度较高且均匀，长潭水库表层与底层水体的pH差异不大。进入4月，藻类尚未进入大量繁殖期，同时水体垂直方向混合较好，长潭水库的垂直方向pH分布依然较为均匀。5和6月，水体形成了稳定的3层结构，但在底部的恒温层内，依然维持在较低温度范围内，对于微生物活性和耗氧化学反应起到了抑制作用，因此，此时期内10 m以下水体的pH虽然在不断降低，但无明显差异，依然维持在中性环境。而在表层，由于藻类利用水体中的CO2进行光合作用，促使pH明显增加。
进入7—9月，长潭水库形成了典型的2层分层结构，表层水体依然受藻类光合作用影响，而底层水体，由于受温跃层的包裹，温度较高，DO处于较低的水平，有机物的厌氧氧化反应活跃，产生的有机酸等降低了底层水体的pH。
10—12月，由于水温的降低，表层水体藻类的丰度降低，其光合作用对于pH的贡献减弱，因而pH分布较为均匀。10—11月，由于温跃层依然阻挡着底层水体DO的供应，底层依然处于厌氧还原环境，因此其pH依然较低。12月，长潭水库进入均匀混合期，pH垂直方向分布表现为整体均匀性。
(2)叶绿素a的垂直方向分布规律
叶绿素a是表征水体藻类等浮游植物生物量的重要指标，浮游植物在水体真光层中可利用营养盐、进行光合作用从而大量繁殖[28-30]。
1月长潭水库叶绿素a的垂直方向分布的离散性变化，主要是上一年度的12月长潭水库经“翻库”后水体整体混合，浮游植物在水库的垂直方向呈离散分布所致。进入2月后，随着水体混合程度减弱，叶绿素a的离散性减少。3月，叶绿素a的质量浓度主要受透光强度的影响，主要表现为随着水深的增加和透射光强度的下降，其质量浓度逐渐减小。
进入5月后，由于温度的进一步升高，叶绿素a的质量浓度进一步增加。6月，长潭水库叶绿素a整体离散性较大，可能与6月长潭水库集中降雨较多，入库径流量较大，垂直方向混合较为强烈有关。
7—9月，由于温跃层的阻隔和抑混作用，叶绿素a的下潜作用被遏制，质量浓度在表层水体呈现出较大数值。
10月，由于水体分层结构的持续影响，长潭水库的叶绿素a质量浓度的垂直方向分布基本重复夏季的规律。随着温跃层的下移，11月长潭水库温跃层以上水体垂直方向混合加剧，15 m以上水层叶绿素a的离散性增加，12月，分层结构消失，水体垂直方向混合程度达到全年最大，导致了叶绿素a的垂直方向分布呈现较大的离散性。
可见，水体垂直方向上的混合程度成为叶绿素a的垂直方向分布离散性最为直接的影响因素。
4. 结论
(1) 2018年长潭水库的分层期为5—11月，混合期为1—4月和12月，分层期为7个月，混合期为5个月，分层期中5—6月为变温层+温跃层+恒温层的3层结构，7—11月为变温层+温跃层2层结构，长潭水库呈现亚热带亚深型水库的特殊分层形式。
(2)水温分层的结构特征对于水体DO和pH的垂直方向分布产生了重要影响。受温跃层的包裹作用影响，2层结构分层期的底层水体水温、DO和pH与3层结构分层期明显不同，表现为水温升高，DO和pH下降。
(3)在水体混合期的1、2、6和12月，叶绿素a的垂直方向分布离散性较大。水体垂直方向上的混合程度成为叶绿素a的垂直方向分布离散性最为直接的影响因素。
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图 2 小麦与拟南芥、水稻、大麦 WAK/WAKLs基因中保守蛋白质的系统进化关系(a)、蛋白结构域(b)和基序结构(c)
注：红色框为从转录组中筛选的4个WAKs/WAKLs基因；下同。
Figure 2. Phylogenetic relationship (a), protein domain(b) and motifs structure (c) based on the amino acid sequences of WAKs/WAKLs from Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, and Hordeum vulgare
Note: In the red box are four WAKs/WAKLs genes screened from the transcriptome; the same as below.
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图 3 WAKs/WAKLs蛋白激酶催化域中的保守结构域基序
注：a) 蛋白激酶ATP结合位点；b) 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点或酪氨酸蛋白激酶活性位点。
Figure 3. Conserved domain motifs in the catalytic domain of WAKs/WAKLs protein kinases
Note: a) ATP binding; b) serine/threonine protein kinase active site, or tyrosine protein kinases specific active site.
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图 4 小麦与拟南芥、水稻、大麦 WAK/WAKLs基因氨基酸多序列同源比对
Figure 4. Homology alignment of amino acid sequences of WAKs/WAKLs genes in T. aestivum and A. thaliana, O. sativa, and H. vulgare
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图 5 4个WAKs/WAKLs基因在抗病品种云337 (Y337)和感病品种云402 (Y402)接种CYR32后的转录组表达量
注：“**”表示与上一个时间相比，在0.01水平上差异极显著；下同。
Figure 5. Transcriptome expression level of four WAKs/WAKLs genes in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32
Note: “**” indicate extremely significant differences at the 0.01 level compared to the previous time; the same as below.
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图 6 RT-qPCR验证4个WAK/WAKLs基因在抗病品种云337 (Y337)和感病品种云402 (Y402)接种CYR32后的表达模式
Figure 6. Expression patterns of four WAKs/WAKLs in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32 by RT-qPCR
表 1 供试引物
Table 1 Primers for test
引物名称
primer names引物序列 (5′→3′)
primer sequencesGAPDH-F GCCTTGCTCCTCTTGCTA GAPDH-R TCCACCTCTCCAGTCCTT TraesCS1B02G004100-F CAATCAGCGGACGGTCTA TraesCS1B02G004100-R ATGTCGCCGATGACTTGT TraesCS6B02G459100-F TTCATCGGAATGTGGTCAAG TraesCS6B02G459100-R GCTGAGTGGAGATAAGAAAGG TraesCSU02G079300-F GAGATGTCGCTGAGAGGTT TraesCSU02G079300-R CCATGCTGTCCAGTGCTA TraesCS3A02G122300-F AGCTCGACACAATGAAGG TraesCS3A02G122300-R CCCAGCCTCAATGTTGAT 
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表 2 4个WAKs/WAKLs 基因理化性质
Table 2 Physicochemical properties of four WAKs/WAKLs genes
基因
gene蛋白质序列号
accession number of protein多肽长度/aa
peptide length蛋白分子质量/ku
protein molecular weight等电点
pI氨基酸指数
amino acid
index蛋白亲水性
protein
hydrophilicityTraesCS1B02G004100 XP_044361219.1 714 78.68 8.50 89.59 −0.119 TraesCS6B02G459100 XP_044410226.1 960 106.29 5.98 85.33 −0.120 TraesCSU02G079300 XP_044407301.1 737 81.86 5.65 81.38 −0.214 TraesCS3A02G122300 XP_044339162.1 652 69.67 6.25 90.49 −0.024
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