工业生产中大量矿产资源的开发利用，以及农业生产中化肥和农药的不合理使用、污灌等均会造成土壤污染，使土壤中的重金属含量超标^[1]。云南农田土壤铅、镉、铜、锌均有不同程度的富集，通过与背景值进行比较，镉的富集程度最为严重^[2]。镉(cadmium，Cd)是一种生物毒性极强的有色重金属，具有移动性大、化学活性强等特点，易被植物吸收^[3]。一方面，过量Cd对植物生长发育产生抑制或毒害，当Cd穿过细胞膜时会破坏膜透性，造成细胞膜脂质过氧化损伤，细胞内丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢(H₂O₂)等过氧化物积累并产生大量自由基^[4-5]，此时植物为维持自身正常生理代谢会启动氧化应激防御系统，调动多种酶类物质如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)以及一些非酶类物质如抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等来维持自身氧化还原平衡，清除过量自由基，减少氧化损伤^[6-7]；另一方面，过量Cd还会影响烟草品质，降低烟叶可用性。烟叶积累的Cd无法自行降解，可通过抽吸时的主流烟气对人体健康造成潜在危害，如致癌、致畸、致突变等^[8]。因此，研究如何缓解烟草Cd胁迫对提高烟叶产质量和保障人体健康具有重要意义。

脱落酸(abscisic acid，ABA)是五大植物天然生长调节剂之一^[9]，在植物抗逆系统中具有重要作用^[10-11]。已有研究将其应用于缓解植物逆境胁迫。张慧等^[12]研究表明：外施ABA可明显减轻Cd²⁺对高等沉水植物菹草的毒害，使其叶片叶绿素、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加。喷施适量浓度外源ABA还能有效减轻铅胁迫对王族海棠的光合抑制，增强其光合作用效率^[13]；还可缓解NaCl对玉米生长和发育过程造成的生理胁迫^[14]，增强高羊茅耐盐性^[15]，诱导小豆幼苗提高渗透调节物质含量以减缓淹水胁迫危害^[16]等。大量研究表明：外源ABA对调控植物多种逆境胁迫具有积极作用，但鲜有针对ABA调节烟草Cd胁迫的研究报道。本研究采用盆栽试验，研究Cd胁迫下叶面喷施ABA对烟叶抗氧化特性及烟株Cd积累的影响，旨在为进一步探究ABA缓解烟草Cd胁迫机理提供理论参考，为降低植物Cd胁迫提供新途径。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试烟草品种为K326。供试土壤为红壤，其理化性质为：pH值5.84，有机质含量15.25 g/kg，有机碳含量10.59 g/kg，全氮含量0.26 g/kg，碱解氮含量7.23 mg/kg，全磷含量0.18 g/kg，速效磷含量4.22 mg/kg，全钾含量54.31 g/kg，速效钾含量97.34 mg/kg，Cd含量0.15 mg/kg。供试花盆规格为32 cm×19 cm×23 cm (上口径×下底径×高)。供试ABA为纯度98%的标准品(上海麦克林生化科技有限公司)；乙酸镉及其他化学试剂均为分析纯(西陇化工股份有限公司)。

1.2   试验设计

于云南农业大学烟草学院设施大棚进行盆栽试验。在前期预试验的基础上确定土壤Cd添加量为60 mg/kg，每盆装风干土10 kg、植烟1株，盆底放置接水盘避免Cd淋失。试验共设置5个处理：CK (正常生长)、Cd胁迫(Cd)、T₁ (Cd+50 mg/L ABA)、T₂ (Cd+100 mg/L ABA)、T₃ (Cd+150 mg/L ABA)。每个处理设置8个重复。

采用漂浮育苗法培育烟苗，锻苗后选择生长均匀一致的壮苗移栽至花盆，移栽时施入烟草专用复合肥($m_{{\mathrm{N}}} $∶$m_{{\mathrm{P}_2}{\mathrm{O}_5}} $∶$m_{{\mathrm{K}_2}{\mathrm{O}}} $=12∶12∶24) 15 g和菜籽有机饼肥30 g作基肥，移栽第7和14天各追施1次复合肥，每次15 g。移栽第15天，按照设计的处理模拟污灌方式，一次性均匀施入乙酸镉水溶液(每盆1 L)，CK处理浇灌等量蒸馏水。后期浇水、锄草等均按照常规管理进行。于打顶后1周晴朗的上午，按照设计的处理喷施ABA溶液，喷至每片叶片正反两面均匀湿润但不滴落，控制在1~2 min内喷完全部处理，随即开始计时。

1.3   测定指标与方法

1.3.1   烟叶生理指标

分别在喷施ABA后1、2、3、6、12和24 h，用打孔器取各处理中部叶(从下往上数6~9叶位)充分混匀后液氮速冻，用9号自封袋分装后移至−80 ℃超低温冰箱保存，用于测定AsA和GSH含量；在喷施24 h后以相同取样方式取样，用于测定SOD、POD、GR和APX活性以及MDA含量。AsA含量采用比色法测定，SOD活性采用硝基四氮唑蓝光还原法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，APX活性采用紫外吸收法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，具体方法参考文献[17]；GSH含量和GR活性使用苏州格瑞思生物科技公司试剂盒(分光光度法)测定，具体按照说明书进行操作。

1.3.2   Cd含量

于喷施ABA 15 d后，将烟株地上部和地下部分开收获，依次用自来水、0.01 mol/L EDTA溶液和去离子水洗净，放至烘箱105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干至恒量，粉碎过筛，混匀，按照《烟草及烟草制品 铬、镍、砷、硒、镉、铅的测定 电感耦合等离子体质谱法》(YC/T 380—2010)的方法测定烟株中的Cd含量，并按照公式计算Cd的富集系数(bio-concentration factor，BCF)和转运系数(transfer factor，TF)：BCF=烟株地上(或地下)部Cd含量/土壤中Cd含量；TF=烟株地上部Cd含量/地下部Cd含量。

1.4   数据处理与统计分析

采用Excel 2019统计数据；采用SPSS 19.0进行显著性分析；采用Origin 2018制图。

2.   结果与分析

2.1   外源ABA对Cd胁迫下烟叶抗氧化特性的影响

2.1.1   对烟叶MDA含量、SOD和POD活性的影响

由图1可知：Cd胁迫下，烟叶MDA含量、SOD和POD活性均显著升高，分别较CK处理高76.8%、105.0%和33.6%；喷施不同质量浓度ABA后，烟叶MDA含量显著下降，50、100和150 mg/L ABA处理分别较单一Cd处理下降38.5%、42.2%和18.9%；烟叶SOD和POD活性均随着ABA质量浓度的升高而逐渐下降，并在150 mg/L ABA处理时活性最低，分别较单一Cd处理下降60.7%和40.1%。说明喷施ABA可显著降低Cd胁迫下烟叶MDA含量、SOD和POD活性。

图  1  脱落酸(ABA)对Cd胁迫下烟叶丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的影响

注：CK. 对照，Cd. Cd胁迫，T₁. Cd+50 mg/L ABA，T₂. Cd+100 mg/L ABA，T₃. Cd+150 mg/L ABA；不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；下同。

Figure  1.  Effects of abscisic acid (ABA) on the malondialdehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activity in tobacco leaves under Cd stress

Note: CK. control, Cd. Cd stress; different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05); the same as below.

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2.1.2   对烟叶AsA-GSH循环的影响

由图2可知：Cd胁迫下，烟叶AsA和GSH含量总体水平均高于CK处理；喷施ABA后的24 h内，AsA和GSH含量总体水平较单一Cd处理进一步升高。其中，AsA含量在喷施ABA后的1~6 h逐渐上升，6~12 h剧烈升高；100和150 mg/L ABA处理的AsA含量在12~24 h逐渐下降，而50 mg/L ABA处理的AsA含量在12 h仍略有上升。GSH含量在喷施ABA后的1~6 h急剧上升，6~12 h缓慢上升，12 h后逐渐下降并趋于稳定，其中，100 mg/L ABA处理的GSH含量总体水平明显高于其他处理。

图  2  ABA处理后24 h内抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的动态变化

Figure  2.  Dynamic changes of ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH) content within 24 hours after ABA treatment

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由图3可知：Cd胁迫下，烟叶AsA和GSH含量、APX活性均显著升高，分别较CK处理升高45.0%、32.2%和17.9%。喷施不同质量浓度ABA (除150 mg/L外)后，AsA和GSH含量、GR和APX活性均高于单一Cd处理。其中，AsA含量随ABA质量浓度的增加逐渐降低；而GSH含量和GR、 APX活性随ABA浓度增加呈先升高后降低趋势，在100 mg/L ABA处理时最高，分别较单一Cd胁迫提高了3.2倍、18.1%和37.3%。总体来看，AsA含量、GSH含量、APX活性和GR活性的变化规律一致。

图  3  ABA对Cd胁迫下烟叶AsA和GSH含量以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响

Figure  3.  Effects of ABA on the contents of AsA and GSH, and the activities of ascorbate peroxidase (APX) and glutathione reductase (GR) in tobacco leaves under Cd stress

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2.2   外源ABA对Cd胁迫下烟株Cd积累的影响

由图4可知：正常生长条件下，烟株Cd积累量极低，且地下部>地上部；Cd处理后，烟株地上部和地下部的Cd含量分别为CK处理的54.5倍和31.5倍，Cd含量分布逆转为地下部<地上部；喷施ABA后，相较于单一Cd处理，烟株Cd含量整体下降，且随ABA质量浓度的增加呈逐渐下降趋势，150 mg/L ABA处理后，烟株地上部和地下部的Cd含量分别下降53.0%和42.3%。

图  4  ABA对Cd胁迫下烟株地上部和地下部Cd含量的影响

Figure  4.  Effects of ABA on the Cd content in the aboveground and underground of tobacco plants under Cd stress

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由表1可知：烟株地上部和地下部Cd富集系数在正常条件下低于0.1，且地下部>地上部，转运系数小于1；Cd胁迫下，烟株Cd富集系数显著增大，且地下部<地上部，转运系数显著增加69.23%；喷施ABA后，地上部与地下部的Cd富集系数均随ABA质量浓度增加而逐渐显著减小，转运系数亦不同程度降低。

表  1  脱落酸(ABA)对烟株Cd富集系数和转运系数的影响

Table  1.  Effects of abscisic acid (ABA) on the Cd bio-concentration factor and transfer factor of tobacco

处理 treatments	富集系数 bio-concentration factor		转运系数 transfer factor
	地上部 aboveground	地下部 underground
CK	0.05±0.00 e	0.07±0.00 e	0.65±0.03 d
Cd	2.54±0.02 a	2.30±0.03 a	1.10±0.02 a
T1	1.97±0.02 b	2.15±0.03 b	0.92±0.01 c
T2	1.56±0.04 c	1.61±0.01 c	0.97±0.02 b
T3	1.19±0.03 d	1.33±0.03 d	0.90±0.03 c
注：CK. 对照，Cd. Cd胁迫，T1. Cd+50 mg/L ABA，T2. Cd+100 mg/L ABA，T3. Cd+150 mg/L ABA；同列不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。 Note: CK. control, Cd. Cd stress; in the same column, different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05).

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2.3   外源ABA质量浓度与烟叶抗氧化及烟株Cd积累的相关性

ABA质量浓度与烟叶POD活性、地下部和地上部Cd含量呈显著负相关，相关系数分别为−0.964、−0.980和−0.964；与烟叶SOD、MDA、AsA、APX和Cd转运系数呈负相关，相关系数分别为−0.873、−0.400、−0.085、−0.126和−0.789；与烟叶GSH和GR呈正相关，相关系数分别为0.824和0.770。由图5可知：烟叶SOD与POD、MDA极显著正相关，与GSH极显著负相关；烟叶GR与SOD、POD显著负相关，与AsA显著正相关，与GSH极显著正相关；烟叶POD与MDA显著正相关，与GSH极显著负相关；烟叶AsA与GSH、地上和地下部Cd含量极显著正相关；Cd转运系数与地上和地下部Cd含量极显著正相关，与AsA显著正相关。

图  5  各指标的相关性

Figure  5.  Correlation between various indicators

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3.   讨论

3.1   外源ABA对烟草抗氧化特性的影响

MDA是膜脂过氧化主要产物之一，其含量高低可代表膜脂过氧化程度^[18]。本研究中，烟草受Cd胁迫后，MDA含量以及SOD、POD酶活性显著升高，这与闫寒等^[19]的研究结果一致。喷施不同质量浓度的外源ABA后，烟叶MDA含量、SOD和POD酶活性较单一Cd胁迫显著降低，表明外源ABA有效地调控了2种酶的活性，减弱了烟叶细胞膜脂过氧化损伤。相较于50和100 mg/L ABA处理，150 mg/L ABA处理的烟叶MDA含量显著升高，表明外源ABA质量浓度过高可能对烟叶产生膜脂过氧化威胁。

AsA-GSH循环在植物抵抗逆境过程中起关键作用，主要由抗氧化物质AsA和GSH及循环中关键酶如APX和GR等参与^[20-21]。本研究表明：Cd胁迫下，烟叶AsA和GSH含量及APX活性显著上升，说明烟草体内的氧化应激机制起到了作用；施用ABA后，上述3个指标继续升高，表明添加ABA进一步刺激了烟草体内的AsA-GSH循环，这与刘梅等^[22]的研究结果类似，也与其他外源物质(烯效唑和腐植酸)调节AsA-GSH循环，从而减轻大豆和稻谷氧化损伤的研究^[23-24]有相似之处；150 mg/L ABA处理下，APX活性下降，这可能是过高质量浓度的ABA起到了协同抑制作用。本研究也表明：施加ABA对烟叶AsA和GSH含量影响具有时间效应，即AsA含量在喷施ABA 6~12 h后剧增，而GSH含量在喷施ABA 1~6 h后剧增，这可能是因为ABA先刺激GSH积累，再催化循环中的代谢酶，进而影响AsA。此外，ABA施用12 h后对烟叶的刺激逐渐平缓，为烟叶取样时间提供了一定参考；但本研究在12~24 h设计的取样时段间隔较宽，若要进一步探究AsA和GSH在该时段内的具体变化，需要在后续研究中进一步细化取样时段，以明确喷施ABA的最佳时间。

3.2   外源ABA对烟草Cd积累的影响

Cd为植物生长发育的非必需元素^[25]，烟草首先通过根系吸收土壤Cd，然后向上运转到烟株各部位。本研究表明：Cd胁迫下，烟株地上部Cd含量高于地下部，地上部和地下部的Cd含量增幅分别为正常生长条件的54.5倍和31.5倍，说明土壤中大量积累的Cd可促使烟株Cd的吸收能力增强，Cd向地上部的运输能力亦增强，这不利于烟叶品质(即安全性)。超累积植物富集系数远大于1，而排斥型作物富集系数通常小于1^[26-27]，以此为判断标准可知：烟草K326对Cd有较强的富集能力，有望用于土壤Cd的污染修复。本研究还表明：喷施ABA能显著降低Cd胁迫下烟株体内的Cd积累，也能显著降低Cd向烟株地上部的运输，这与何莲等^[28]的研究结果类似。此外，已有研究表明：AsA和GSH均具有络合作用，可与结合在酶蛋白上的重金属离子络合^[29]。本研究显示：AsA含量与GSH、地上部和地下部Cd含量极显著正相关，而GSH与SOD、POD极显著负相关，SOD又与多种酶相关，由此推测，烟草Cd积累降低可能与ABA刺激烟草AsA-GSH循环，从而络合部分Cd离子有关。

4.   结论

外源喷施ABA可降低Cd胁迫下烟叶的SOD活性、POD活性和MDA含量，提高烟叶AsA含量、GSH含量和GR活性，降低烟株地上部和地下部的Cd积累，使烟株向地上部运转Cd的能力减弱。其中，外源喷施150 mg/L ABA能极大地降低烟株Cd积累，可为降低烟草重金属吸收的研究提供参考。