磷是保障植物生长的主要养分，施用磷肥是保障作物生产和粮食安全的重要措施^[1-2]。然而，磷在土壤中迁移速度慢，易被固定，施用的磷肥大多转化为非有效态无机和有机磷，导致植物只能吸收少量的无机磷，磷肥当季利用率仅10%~25%^[3-5]。因此，减少土壤磷固定、促进土壤非有效态或难利用磷的活化和利用，对提高磷肥利用效率、实现作物增产和磷矿资源长期可持续供应具有重要意义^[6-8]。

土壤磷转化主要包括吸附—解吸、沉淀—溶解、矿化—固定等过程，微生物和酶作为主要驱动者发挥重要作用^[9]。研究表明：高达40%的土壤微生物对土壤非有效态磷具有溶解和活化作用，它们通过分泌质子和有机酸溶解、利用和转化难溶性无机磷，并可通过分泌磷酸酶和植酸酶矿化非有效态有机磷以增加土壤有效态磷^[10]。土壤磷酸酶是由高等植物和微生物分泌的可水解土壤有机磷胞外酶，主要包括酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、植酸酶和核苷酸酶^[11]，能够催化土壤有机磷化合物矿化为可供植物利用的正磷酸盐，在土壤磷素转化和磷循环过程中发挥着重要作用^{[10, 12-13]}。BÜNEMANN等^[10]报道：磷酸酶可水解60%的土壤有机磷供作物吸收利用，其中植酸酶溶解释放的量最大。有研究表明：添加磷酸酶能促进作物磷吸收并提高作物产量；外源植酸酶可显著提高根区土壤植酸酶活性、磷酸酶活性和速效磷含量，并显著提高甜茶幼苗根系活力、株高、茎粗、叶面积、光合速率及叶绿素含量^[14]。宋丹等^[15-16]研究表明：外源添加植酸酶可增加棕壤酸性磷酸酶、中性磷酸酶及土壤有效磷含量，并促进土壤有机磷向无机磷转化。曲博等^[17]研究表明：外源添加植酸酶可在短期内提高野鸭湖湿地土壤有机磷的有效性。以上研究主要集中在中性和碱性土壤，且主要探讨不同植酸酶添加量对有机磷组分的影响，而关于添加不同外源磷酸酶对红壤土壤磷库活化的影响尚未见报道。

红壤pH低、固磷能力强，导致其中的磷难以释放供植物吸收。减少红壤磷固定，促进红壤磷活化，是保障粮食安全、促进磷肥减施增效的关键。合理的磷肥施用量、磷肥形态及种植模式对促进红壤磷库转化和磷活化均有重要影响^[18-19]，研究不同外源酶添加对促进土壤磷库转化、促进作物磷吸收具有重要意义。因此，本研究选取西南典型低磷红壤，通过盆栽试验研究外源添加不同类型磷酸酶对红壤磷组分及玉米磷吸收的影响，探讨影响红壤磷活化的关键因子及磷组分对土壤有效磷的相对贡献，以期为促进西南红壤磷肥的高效利用提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

供试玉米(Zea mays L.)品种为云瑞88。

供试土壤取自云南省昆明市官渡区小哨村旱地红壤试验基地(24°54′N，102°41′E，海拔1820.0 m)，该地年均气温14.4 ℃，年均降雨量850.0 mm。土壤为山原红壤，强酸性，肥力较低，其基本理化性状为：pH 4.67，全磷含量0.22 g/kg，有机质含量5.58 g/kg，有效磷含量4.73 mg/kg。

供试酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)均购自上海伊卡生物技术有限公司；植酸酶(phytase，PHY)购自上海源叶生物科技有限公司。外源添加酶液现配现用，配制时将不同磷酶固体粉末分别溶解于灭菌蒸馏水中，摇匀后备用。

盆栽试验供试肥料的氮、钾施用量均为150 mg/kg，不施磷肥。氮肥为含N 46%的尿素，钾肥为含K₂O 51%的硫酸钾，均购自云南云天化股份有限公司。

1.2   试验设计

试验设置对照(无添加，CK)以及外源添加ACP、ALP和PHY共4个处理，每个处理4次重复，即4盆(盆规格为18.0 cm×11.0 cm×12.5 cm)。每盆装入过2 mm筛的风干红壤2 kg，并一次性施入混匀的肥料，随后浇足水，点播3~4粒玉米(点播深度为3~5 cm)，每隔2 d浇水1次。玉米发芽后(约1周)，每盆保留2株长势一致的壮苗并进行外源酶的添加。不同处理外源酶添加量均为每盆500 U，分5次施入，每次用量为50 mL，每隔4 d先浇水再将酶液与水混合后一同施入。CK每次浇入等量水。种植过程除浇水和间苗外，不进行其他处理。

1.3   样品采集与指标测定

玉米播种45 d (大喇叭口期)后进行破坏性取样，采集植株地上部和根系样品。先使用卷尺和游标卡尺测定玉米的株高和茎粗，然后经蒸馏水多次冲洗，擦干后称取鲜质量；105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒量，称量干质量。烘干植株和根系样品的磷浓度分别采用H₂SO₄-H₂O₂和消煮—钒钼黄比色法测定。

采用抖土法采集根际土，捡除根系残渣并过2 mm筛，一部分于4 ℃保存，用于酶活性的测定；另一部分风干，过1 mm筛，用于土壤有效磷和磷组分的测定。采用磷酸苯二钠法^[20]测定土壤磷酸酶活性；采用改进的偏钒酸铵钼黄法^[21]测定PHY活性。参考TIESSEN等^[22]改进的Hedley磷分级方法，将土壤磷组分分为Resin-P、NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po、NaOH-Pi、NaOH-Po、1 M HCl-Pi、conc.HCl-Pi、conc.HCl-Po和Residual-P共9种；根据各组分在土壤中的活性分为活性磷库(Resin-Pi、NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po)、中稳性磷库(NaOH-Pi、NaOH-Po、1 M HCl-Pi)和稳定性磷库(conc. HCl-Pi、conc. HCl-Po、Residual-P)^[23]。

1.4   数据处理与统计分析

使用Excel 2010处理数据；使用SPSS 24.0检验处理间的差异显著性和指标间的皮尔森相关分析；使用Origin 2018制图。使用CANOCO 5.0进行冗余分析；使用R语言的randomorest和rfPermute包进行随机森林模型分析，以探讨土壤磷组分对土壤有效磷的相对贡献^[24]。

2.   结果与分析

2.1   外源添加不同磷酸酶对玉米生长与磷吸收的影响

由表1可知：外源添加ACP和PHY可显著影响红壤玉米的农艺性状，而添加ALP无显著的促进作用。与CK相比，ACP处理的玉米地上部干质量和总干物质量显著增加18.6%和15.6%；PHY处理的玉米株高、地上部干质量、地下部干质量和总干物质量分别显著增加11.9%、40.6%、34.1%和38.7%。PHY处理对玉米生长的促进作用最显著，其地上部干质量、地下部干质量和总干物质量较ACP处理分别显著增加18.5%、23.4%和19.9%，玉米株高、地上部干质量、地下部干质量和总干物质量较ALP分别显著增加18.5%、 27.9%、29.3%和28.3%。

表  1  外源添加不同磷酸酶对玉米生长的影响

Table  1.  Effects of exogenous addition of different phosphatases on the growth of maize

处理 treatments	株高/cm plant height	茎粗/cm stem diameter	单株干质量/g dry weight of per plant			根冠比 root/shoot
			地上部干质量 dry weight of aboveground	地下部干质量 dry weight of underground	总干质量 total dry weight
CK	74.0±6.9 ab	11.0±2.0 a	2.9±0.5 c	1.2±0.1 b	4.2±0.5 d	0.43±0.11 a
ACP	74.1±2.3 ab	11.0±0.6 a	3.5±0.1 b	1.3±0.2 b	4.8±0.2 bc	0.39±0.06 a
ALP	69.9±8.8 b	10.6±0.5 a	3.2±0.4 bc	1.3±0.2 b	4.5±0.4 cd	0.40±0.09 a
PHY	82.8±3.7 a	12.3±0.6 a	4.1±0.2 a	1.7±0.1 a	5.8±0.2 a	0.40±0.03 a
注：CK. 对照，ACP. 添加酸性磷酸酶，ALP. 添加碱性磷酸酶，PHY. 添加植酸酶；同列不同小写字母表示处理间存在显著差异 (P<0.05)；下同。 Note: CK. control, ACP. added acid phosphatase, ALP. added alkaline phosphatase, PHY. added phytase; in the same column, different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05); the same as below.

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由图1可知：外源添加ACP和PHY可显著影响玉米磷吸收量。与CK相比，ACP处理的玉米地上部磷和总磷吸收量分别显著增加39.3%和31.6%；PHY处理的玉米地上部磷和总磷吸收量分别显著增加72.8%和66.2%；而ALP处理未显著促进玉米磷吸收。与ACP和ALP处理相比，PHY处理的玉米总磷吸收量分别显著增加26.3%和47.0%。

图  1  外源添加不同磷酸酶对玉米磷吸收量的影响

注：CK. 对照，ACP. 添加酸性磷酸酶，ALP. 添加碱性磷酸酶，PHY. 添加植酸酶；不同小写字母表示处理间存在显著差异 (P<0.05)；下同。

Figure  1.  Effects of exogenous addition of different phosphatases on phosphorus uptake of maize

Note: CK. control, ACP. added acid phosphatase, ALP. added alkaline phosphatase, PHY. added phytase; different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05); the same as below.

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2.2   外源添加不同磷酸酶对玉米根际土壤酶活性的影响

由图2可知：添加外源磷酸酶可显著改变玉米根际土壤酶活性。与CK相比，ACP、ALP和PHY处理的玉米根际土壤ACP活性分别显著提高24.4%、19.6%和69.8%，玉米根际土壤ALP活性分别显著提高16.8%、19.2%和20.9%；PHY处理的玉米根际土壤PHY活性显著提高95.3%。比较添加不同酶的处理可知：PHY处理的玉米根际土壤ACP活性最高，较ACP和ALP处理分别显著提高36.5%和42.0%，PHY活性分别显著提高72.2%和80.2%。可见，外源添加PHY不仅能提高低磷红壤玉米根际PHY活性，还能提高其ACP和ALP活性。

图  2  外源添加不同磷酸酶对玉米根际土壤酶活性的影响

Figure  2.  Effects of exogenous addition of different phosphatases on enzyme activity of soil in maize rhizosphere

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2.3   外源添加不同磷酸酶对玉米根际土壤磷库活化的影响

在红壤中，外源添加不同磷酸酶处理的玉米根际土壤无机磷含量占69.7%~72.0%，有机磷含量占28.0%~30.3% (图3a)。与初始土壤相比，不同处理下玉米根际土壤无机磷库含量减少3.45~7.67 mg/kg，有机磷库含量减少1.16~13.11 mg/kg。相较于初始土壤有机磷库，外源添加磷酸酶处理的土壤有机磷耗竭3.7%~10.6%；不同处理的土壤有机磷耗竭存在差异，与CK相比，ACP、ALP和PHY处理分别耗竭5.9%、2.8%和9.8%。

图  3  外源添加不同磷酸酶对土壤磷组分和磷库活化的影响

注：不同字母表示不同处理的同一磷组分差异显著 (P<0.05)。

Figure  3.  Effects of exogenous addition of different phosphatases on the soil phosphorus fraction and phosphorus pool activation

Note: Different letters indicate significant differences in the same phosphorus fraction among different treatments (P<0.05).

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按不同磷组分来看，稳定性磷库占比最大，为54.5%~56.4%；其次为中稳性磷库，占38.0%~39.0%；活性磷库占比最小，为5.6%~6.5% (图3b)。相较于初始土壤，ACP和ALP处理的玉米根际土壤活性磷库耗竭量分别为1.00和1.29 mg/kg，而PHY处理的活性磷库增加0.79 mg/kg；不同酶处理根际土壤的中稳性磷库耗竭量为0.96~3.62 mg/kg，稳定性磷库耗竭量为3.03~15.58 mg/kg。与CK相比，PHY处理对不同活性磷库间的转化作用最强，不仅能使稳定性磷库含量显著耗竭5.5%，还能使活性磷库含量显著增加13.1%；ACP和ALP处理则表现为耗竭稳定性磷库(分别耗竭3.0%和0.6%)、增加活性磷库(分别增加5.2%和3.9%)以及中稳性磷库(分别增加1.7%和0.2%)，且ACP处理效果明显高于ALP处理。

由图3c可知：相较于初始土壤，CK耗竭除conc.HCl-Po外的所有磷组分；ACP和PHY处理主要耗竭NaHCO₃-Po、NaOH-Po、1 M HCl-Pi、conc.HCl-Pi、conc.HCl-Po和Residual-P，增加Resin-P、NaHCO₃-Pi和NaOH-Pi；ALP处理主要耗竭NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po、NaOH-Pi、NaOH-Po、1 M HCl-Pi、conc.HCl-Po和Residual-P，增加Resin-P和conc.HCl-Pi。与CK相比，外源添加不同磷酸酶的玉米根际土壤Resin-P和NaHCO₃-Pi分别显著增加114.3%~337.8%和13.8%~65.2%；PHY处理的玉米根际土壤NaHCO₃-Po和NaOH-Po分别显著降低13.9%和6.8%，NaOH-Pi显著增加7.0%。在不同外源酶添加处理间，PHY处理对土壤磷组分的影响最大。相较于ACP和ALP处理，PHY处理的Resin-P分别显著增加90.1%和104.3%， NaHCO₃-Pi分别显著增加30.6%和45.2%，NaHCO₃-Po分别显著降低8.8%和11.4%，NaOH-Po分别显著降低3.5%和4.4%。以上结果表明：外源添加不同磷酸酶(尤其是PHY)主要通过将土壤有机磷(主要为NaHCO₃-Po和NaOH-Po)水解为水溶性无机磷(Resin-P和NaHCO₃-Pi)供给作物吸收和利用。

2.4   外源添加不同磷酸酶对玉米根际土壤磷有效性的影响

由图4可知：外源添加不同磷酸酶均可显著增加玉米根际土壤磷的有效性。与CK相比，外源添加ACP、ALP和PHY处理的玉米根际土壤Resin-P分别显著增加130.3%、114.3%和337.8%，NaHCO₃-Pi分别显著增加26.5%、13.8%和65.2%；PHY处理的红壤活性磷库显著增加13.1%。比较添加不同酶的处理可知：PHY处理对玉米根际磷有效性的影响最大，其Resin-P较ACP和ALP处理显著增加90.1%~337.8%，NaHCO₃-Pi较ACP和ALP处理显著增加30.6%~65.2%，活性磷库较ACP处理显著增加13.1%。

图  4  外源添加不同磷酸酶对玉米根际土壤有效磷含量的影响

Figure  4.  Effects of exogenous addition of different phosphatases on the content of available phosphorus in maize rhizosphere

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2.5   外源添加不同磷酸酶对低磷红壤磷活化的贡献

由图5a可知：PHY与Resin-P、NaHCO₃-Pi呈极显著正相关(P<0.01)，与NaOH-Pi呈显著正相关(P<0.05)，与NaHCO₃-Po、NaOH-Po、conc.HCl-Pi呈极显著负相关(P<0.01)；ACP与Resin-P、NaHCO₃-Pi、NaOH-Pi呈显著正相关(P<0.05)，与NaHCO₃-Po、NaOH-Po、Residual-P呈极显著负相关(P<0.01)，与conc.HCl-Pi、conc.HCl-Po呈显著负相关(P<0.05)；ALP与Resin-P、NaHCO₃-Pi呈显著正相关(P<0.01)，与Residual-P呈显著负相关(P<0.05)。由图5b可知：3种酶与Resin-P、NaHCO₃-Pi、NaOH-Pi的箭头呈相同方向，而与其他磷组分的箭头呈反方向，这说明磷酸酶可通过活化土壤难溶性磷(尤其是NaOH-Po和conc.HCl-Po)形成可溶性磷酸盐，促进红壤中有机磷向活性有效磷转化，增加土壤磷有效性及作物磷吸收。

图  5  土壤磷组分与磷酸酶的相关性分析(a)和冗余分析(b)

注：a) “**”表示极显著相关(P<0.01)；“*”表示显著相关(P<0.05)。b) 红色箭头表示解释变量，蓝色箭头表示因变量。

Figure  5.  Correlation analysis (a) and redundancy analysis (b) of soil phosphorus fractions and phosphatase

Note: “**” indicates extremely significant correlation (P<0.01); “*” indicates significant correlation (P<0.05). b) The red arrows represent explanatory variables, and the blue arrows represent the dependent variable.

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由图6可知：NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po和Resin-P对土壤有效磷的影响最大，且具有极显著促进作用，相对贡献率分别为10.0%、8.7%和8.4%；NaOH-Po和conc.HCl-Po对土壤有效磷也表现出显著促进作用，相对贡献分别为8.1%和4.2%。可见，低磷红壤有机磷的转化可增加土壤有效磷含量，磷酸酶在土壤有机磷转化和作物磷吸收方面发挥着重要作用。

图  6  红壤磷组分对玉米根际土壤有效磷的相对贡献

注：“**”表示具有极显著影响(P<0.01)；“*”表示具有显著影响(P<0.05)。

Figure  6.  Random forest analysis to identify the main predictors of P fractions to Olsen-P in red soil

Note: “**” indicates extremely significant effect (P<0.01); “*” indicates significant effect (P<0.05).

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3.   讨论

磷是植物生长必需但有效性较低的大量营养元素之一，土壤仅少量水溶态磷可供作物吸收利用^{[3, 6]}，而磷转化在土壤磷吸收利用过程中起着重要作用^{[7, 9]}。土壤磷转化过程中，速效磷—磷酸酶—磷组分间存在着密切联系，土壤磷酸酶可催化土壤有机磷释放有效磷供作物吸收利用^[25]。本研究表明：外源添加磷酸酶可显著增加玉米生物量和磷吸收量。杨萍萍等^[14]的研究也表明：外源添加PHY可显著增加甜茶幼苗的根系活力、株高、茎粗、叶面积、光合速率及叶绿素含量。

土壤中的ACP和PHY可由根系和微生物分泌，而ALP主要来自微生物^[26]。本研究表明：外源添加ACP、ALP和PHY后，根际土壤ACP和ALP活性均显著增加，而外源添加PHY处理还能显著增加根际土壤PHY活性。杨萍萍等^[14]研究表明：外源施入PHY后，根区土壤PHY活性、磷酸酶活性和速效磷含量均显著提高。宋丹等^[16]发现：外源添加不同用量PHY可提高土壤中的酸性和中性磷酸酶活性，并增加土壤有效磷含量。分析其原因，一方面可能是土壤中磷酸酶主要由根系和微生物分泌^{[17, 27]}，而外源磷酸酶的活化作用加大了根系与微生物对磷的竞争，进而增加土壤磷酸酶分泌；另一方面，外源酶在玉米发芽后1周才添加，且间隔4 d分5次添加，导致部分磷酸酶残留在土壤中。

土壤磷酸酶作为重要的有机磷水解酶，主要包括ACP、ALP、PHY和核苷酸酶^[11]，在磷素转化过程中发挥着重要作用^[12-13]。曲博等^[17]研究表明：湿地土壤添加PHY可在短期内提高土壤有机磷有效性，使稳定性较高的有机磷向活性较高的有机磷转化。宋丹等^[15]研究表明：在不同培养时期外源添加PHY可增加土壤活性和中稳性有机磷的含量和比例，并促进土壤稳定性有机磷向活性有机磷和无机磷转化，从而提高土壤磷的有效性。在本研究中，添加不同外源酶主要耗竭土壤有机磷库，且以PHY处理的转化作用最强。与CK相比，PHY处理可显著耗竭土壤稳定性磷库含量，显著增加活性磷库含量；而ACP和ALP处理表现出耗竭稳定性磷库，并增加活性磷库和中稳性磷库。本研究还发现：外源酶添加主要耗竭土壤中的NaHCO₃-Po、NaOH-Po和conc.HCl-Po，以增加红壤Resin-P、NaHCO₃-Pi和NaOH-Pi组分。相关分析和冗余分析均表明：外源添加磷酸酶可水解土壤有机磷，使其转化为可溶性无机磷；进一步分析不同磷组分对土壤有效磷的影响，发现NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po和Resin-P对土壤有效磷具有极显著贡献，NaOH-Po和conc.HCl-Po对土壤有效磷具有显著贡献。

本研究还表明：不同酶对土壤有机磷活化及作物磷吸收的影响为PHY>ACP>ALP，其中，外源添加ALP未能显著影响土壤磷活化及作物磷吸收。分析其原因，一方面是本研究土壤性质为酸性，ALP在土壤中降解较快，未能与植物根系形成有效互动反馈；另一方面，低磷红壤的PHY占比较高，导致由ALP水解的有机磷较少，难以满足作物需求。植酸类有机磷是土壤中重要的有机磷，其含量约占土壤有机磷的40%~80%，通过PHY水解释放无机磷供作物吸收^[17]。BÜNEMANN^[27]也报道：磷酸酶可水解高达60%的有机磷，并释放无机磷，其中PHY的矿化作用最强。本研究也证实添加PHY处理对玉米生长和磷吸收的效果最为明显，这与ZHU等^[21]的研究结果一致。

4.   结论

外源添加酸性磷酸酶和植酸酶可促进红壤中的有机磷转化为无机磷，增加红壤有效磷含量，进而促进玉米磷吸收。外源添加植酸酶对红壤磷活化的效果最好，可促进根际土壤中的有机磷(NaHCO₃-Po和NaOH-Po)水解，并转化为活性较高的无机磷(Resin-P和NaHCO₃-Pi)，从而增加根际土壤有效磷含量和玉米磷吸收。