吲哚丁酸对桃砧木GF677不定根形成过程中生理生化指标的影响
明确激素诱导对无性系砧木不定根形成的影响。
以清水为对照组(CK)，分别用200、500、800和1100 mg/L吲哚丁酸(3-indole butyric acid，IBA)处理桃无性系砧木GF677的 1 年生插穗基部，研究其扦插生根过程中生理生化指标的变化。
经200 mg/L IBA (T1)诱导的根系效果指数显著大于其他处理(P<0.05)，生根率达94.63%。处理组插穗全氮(total nitrogen，TN)、全磷(total phosphorus，TP)和全钾(total potassium，TK)含量均呈下降趋势，降幅均大于CK；插穗多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和吲哚乙酸氧化酶 (indoleacetic acid oxidase，IAAO)活性先增强后减弱，吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)含量先升高后降低，上述4个指标均在不定根形成期(21 d)出现峰值，且变幅最大为T1处理；处理组细胞分裂素(cytokinin，CTK)含量逐渐下降，且以T1处理降幅最大；处理组乙烯(ethylene，ETH)含量缓慢升高，且以T1处理变幅最小。相关性分析显示：生根率与插穗TN、TP、TK和CTK含量极显著负相关(P<0.01)，与IAA含量、IAAO活性和PPO活性极显著正相关(P<0.01)。
T1处理可显著提高插穗酶活性并加速IAA合成，说明200 mg/L IBA能更好地调节氧化酶和内源激素水平，促进不定根形成。
Effects of 3-Indole Butyric Acid (IBA) on the Physiological and Biochemical Indexes of Adventitious Root Formation in Peach Rootstock GF677
To clarify the effects of hormone induction on the formation of adventitious root of clonal rootstocks.
Clear water was used as the control (CK), the bases of 1-year-old spikes of peach clonal rootstock GF677 were treated with 200, 500, 800 and 1100 mg/L 3-indole butyric acid (IBA), the physiological and biochemical indexes changes during the rooting process of its cuttings were studied.
The root induction effect index of 200 mg/L IBA treatment (T1) was significantly higher than that of other treatments (P<0.05), the rooting rate reached 94.63%. The contents of total nitrogen (TP), total phosphorus (TP), and total potassium (TK) of cuttings showed a downward trend, with a decrease greater than that of CK. The activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), and indoleacetic acid oxidase (IAAO), and the content of indole acetic acid (IAA) in cuttings increased first and then decreased, and the peak value appeared at the formation stage of adventitious root (21 days), with the maximum amplitude of T1 treatment. The content of cytokinin (CTK) in the treatment groups gradually decreased, with T1 treatment showing the largest decrease. The content of ethylene (ETH) showed a slow increase, and the T1 treatment showed the smallest variation. Correlation analysis results showed that the rooting rate was extremely significantly negatively correlated with the contents of TN, TP, TK, and CTK (P<0.01), and extremely significantly positively correlated with IAA content, and the activities of IAAO and PPO (P<0.01).
T1 treatment increases the enzyme activity of cuttings significantly, and accelerates the synthesis of IAA. It indicates that the exogenous hormone 200 mg/L IBA can better regulate its oxidase and endogenous hormone levels and promote adventitious root formation.
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Keywords:
- clonal rootstock /
- cuttings rooting /
- nutrients /
- oxidase /
- endogenous hormones
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种猪病毒性传染病，患病的怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，其他年龄段的猪感染该病毒后出现严重的呼吸系统疾病[1-2]。由于 PRRSV具有易变异、抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement，ADE)和免疫抑制等特点，全球养猪业以及猪肉的食品安全面临着严峻的挑战。PRRSV主要在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)中复制繁殖[3]，因此，PAMs在PRRSV的研究中具有关键作用。
干扰素(interferon，IFN)是一类抗病毒细胞因子，在病毒感染早期，干扰素由病毒诱导细胞产生，具有较强保护力。根据分子结构、免疫原性和受体特异性的不同可将IFN分为I型、II型和III型，其中干扰素调节因子3 (interferon regulation factors 3，IRF3)和干扰素调节因子7 (interferon regulation factors 7，IRF7)在干扰素产生的信号通路中发挥着关键作用。IFN-γ作为先天性和适应性免疫反应的重要介质，能够清除外来病原体及肿瘤。 IFN-γ具有抗病毒作用，同时还能介导巨噬细胞活化，增加其吞噬作用，促进促炎细胞因子产生、增加微生物活性氧以及氮物质的产生，进而清除细胞内的病原体[4]。有研究发现：PRRSV感染宿主细胞后仅能检测到低水平的IFN-γ[5]，而重组pIFN-γ不但能有效抑制PRRSV，同时还对免疫抑制猪具有良好免疫调节作用，增强疫苗的免疫效果[6]。因此，本试验就PRRSV云南株体外感染PAMs后对IFN-γ及其信号分子mRNA转录量的变化进行检测，旨在为PRRSV的免疫抑制机制和防控提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒
TCID50为105.06 mL−1的PRRSV云南株YN-2011由本实验室分离纯化保存(登录号：JX857698)[7]。
1.1.2 细胞
PAMs从健康仔猪肺脏中分离得到[8]。
1.2 方法
1.2.1 试验分组
将分离的PAMs以2×106 mL−1的密度铺在6孔板于37 ℃、5% CO2培养。将培养的PAMs分为对照组和PRRSV组，PRRSV组加PRRSV病毒悬液100 μL，对照组加等量的1640培养液。分别在感染后的6、12、24、48、60 h收集 PAMs及其上清液，−80 ℃保存，每组设3个重复。
1.2.2 PAMs上清中IFN-γ的质量浓度检测
按照Swine IFN-γ ELISA Kit试剂盒说明书进行样品的处理和检测。
1.2.3 IFN-γ及其信号分子mRNA转录水平的检测
采用TRIzol提取各组细胞总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，并以其为模板，利用本实验室建立的 qPCR 进行检测。引物由上海生工合成(表1)。
表 1 荧光定量PCR引物序列Table 1. Real-tine PCR primer sequences基因gene 引物序列 primer sequence 退火温度/℃ T m 目的片段/bp fragment size β-actin F:5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′ 52 122 R:5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3′ PRRSV F:5′-GTCAGACATCACTTTACCCCTAG-3′ 60 123 R:5′-CTCCACAGTGTAACTTATCCTCC-3′ IFN-γ F:5′-GGCCATTCAAAGGAGCATGG-3′ 60 147 R:5′-AGTTCACTGATGGCTTTGCG-3′ IRF-3 F:5′-GGTGCCTACACTCCTGG-3′ 60 105 R:5′-GTGGTCCTCTGCTAAACG-3′ IRF-7 F:5′-CGCCTCCTGGAAAACCAA-3′ 60 76 R:5′-CCCTGAGTTGTCCTGCAACA-3′ 1.2.4 数据分析
所有数据用“mean±SD”表示，应用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。
2. 结果与分析
2.1 感染后第24小时不同处理组PAMs形态
图1显示：正常组贴壁的PAMs呈圆形，细胞质丰富；PRRSV感染组的PAMs在24 h可见细胞变圆、聚集，并随着时间的延长最后出现脱落、悬浮、崩解、破碎和死亡。
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图 1 24 h各组细胞的观察(200×)Figure 1. PAMs in different treatment groups for 24 h under inverted microscope2.2 PAMs上清液IFN-γ的质量浓度
检测不同时间点PAMs上清液中IFN-γ的质量浓度(图2)可知：PRRSV组IFN-γ的质量浓度与对照组相比无显著性差异。PRRSV组IFN-γ的生成量在6~48 h逐渐升高，48 h达到最大值，6 h时IFN-γ的质量浓度低于对照组。
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图 2 不同时间点不同处理IFN-γ质量浓度(ρ)变化Figure 2. The change of IFN-γ mass concentrations at different time points2.3 PRRSV mRNA转录水平的动态变化
由图3可知：PRRSV组PRRSV的mRNA转录水平在感染后的6~24 h逐渐升高，48 h时转录水平有所下调，60 h时再次升高。
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图 3 PRRSV mRNA转录水平注/Note: **. P<0.01。Figure 3. The transcription levels of PRRSV mRNA2.4 PAMs中IFN-γmRNA转录水平
由图4可知：PRRSV组IFN-γ的mRNA转录量在感染后6~48 h逐渐升高，48 h时达到最大值，在6 h时IFN-γ mRNA转录水平显著低于正常对照组，24、48 h时显著高于对照组IFN-γ mRNA转录水平，到60 h又恢复到正常对照组水平。
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图 4 IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平注/Note: **. P<0.01。Figure 4. The transcription levels of IFN-γ mRNA in each group at different time points2.5 PAMs中IRF3和IRF7mRNA转录水平
运用qPCR方法检测不同处理组IRF3和IRF7 mRNA相对转录量。根据2−ΔΔCt可以得出对照组的数据为1。结果(表2)显示：PRRSV组中IRF3的mRNA转录量在6、12、24 h时低于正常对照组，48 h时转录水平高于正常对照组IRF3的 mRNA转录量，而到60 h时又显著低于正常对照组；PRRSV组IRF7的mRNA转录量在24 h时达到最大值且显著高于对照组，但在12、48、60 h时均显著低于正常对照组。
表 2 IRF3和IRF7 mRNA在各组不同时间点的转录水平Table 2. The transcription levels of IRF3 and IRF7 mRNA in each group at different time points基因
gene培养时间/h culture time 6 12 24 48 60 IRF3 0.56±0.055 0.62±0.165 0.97±0.014 1.12±0.082 0.49±0.155* IRF7 1.02±0.189 0.43±0.066** 1.48±0.246** 0.41±0.034** 0.55±0.038** 注：与同一时间点的对照组比较，*.P<0.05，**.P<0.01。
Note: Compared with control group at the same time, *.P<0.05, **.P<0.01.2.6 IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关性分析
如图5所示：PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关系数分别为|R|=0.96和|R|=0.04。根据|R|∈[0.1, 0.3)为弱相关，|R|∈[0.3, 0.5)为中等相关，|R|∈[0.5, 1.0]为强相关，得出IFN-γ与IRF3基因mRNA转录水平呈强正相关与IRF3基因呈正相关。
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图 5 PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7基因转录水平相关性分析Figure 5. IFN-γ and IRF3 and IRF7 correlation with the transcription in PRRSV groups3. 讨论
PRRSV感染机体后出现的免疫学症状与适应性免疫应答的低效表达有关。研究表明：由病毒诱导产生的特异性IFN-γ可作为细胞免疫功能评价的重要指标，用于病毒感染后宿主免疫机制的研究[9]。本研究运用qRT-PCR和ELISA检测PRRSV感染PAMs后对IFN-γ的影响发现：PRRSV组IFN-γ mRNA转录水平在24、48 h时显著高于对照组，这一结果与前人研究的用PRRSV感染从支气管肺泡灌洗液中分离得的细胞后，其IFN-γ表达水平高于感染前的表达水平的结果[10]相类似。但IFN-γ的生成量与对照组相比却无显著性差异。研究发现：不同毒力的PRRSV毒株诱导IFN-γ的能力存在差异[11]。PATRICIA等[10]和HAN等[12]的研究发现：PRRSV高致病性毒株刺激IFN-γ生成的能力显著高于PRRSV经典毒株。IFN-γ主要是由活化的CD4+Th1 、CD8+T细胞产生，巨噬细胞产生IFN-γ的能力较弱。
IRF3和IRF7是主要的抗病毒转录因子，无论机体通过何种模式识别受体或何种信号通路来识别病原体，最终均能活化IRF3和IRF7。研究发现：PRRSV的Nsp1、Nsp2、Nsp11、结构蛋白N和GP5蛋白可以通过不同的途径来抑制IRF3的产生，尤其对于猪肺泡巨噬细胞和单核细胞等易感细胞[13-15]。本研究运用qRT-PCR检测PRRSV感染PAMs后对IRF3和IRF7的影响发现：PRRSV组中IRF3的mRNA转录水平随着感染时间的延长逐渐升高，但均低于对照组，IRF7mRNA转录水平在12、48、60 h时显著低于对照组，说明PRRSV体外感染PAMs后可抑制IRF3和IRF7 mRNA转录水平。另外，本研究发现PRRSV组中IFN-γ mRNA转录水平与IRF3 mRNA转录水平存在强正相关关系，与IRF7 mRNA存在弱正相关关系。研究表明：IFN-γ能增加巨噬细胞的吞噬作用和促进MHCI及II类分子的表达，提高抗原递呈功能[16]。
本研究表明：PRRSV在感染PAMs过程中不刺激IFN-γ的分泌，但对IFN-γ mRNA的转录在24 h内抑制，后上调其转录水平，在60 h时又被抑制。
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图 2 GF677不定根形成过程中营养成分变化
注：CK. 清水对照，T1. 200 mg/L IBA，T2. 500 mg/L IBA，T3. 800 mg/L IBA，T4. 1100 mg/L IBA；下同。
Figure 2. Changes of nutrient components during the formation of GF677 adventitious root
Note: CK. water control; the same as below.
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图 3 GF677 扦插不定根形成过程中插穗激素变化
注：IAA. 吲哚乙酸；CTK. 细胞分裂素；ETH. 乙烯。
Figure 3. Hormonal changes during cutting of adventitious roots formation of GF677
Note: IAA. indole acetic acid; CTK. cytokinin; ETH. ethylene.
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图 4 GF677 扦插不定根形成过程中插穗氧化酶活性变化
注/Note: PPO. polyphenol oxidase; POD. peroxidase; IAAO. indoleacetic acid oxidase.
Figure 4. Changes of oxidase activity during cutting of adventitious root formation of GF677
表 1 不同处理对插穗生根的影响
Table 1 Effects of different treatments on the rooting of cuttings
处理
treatments愈伤率/%
callus rate生根数
rooting number生根率/%
rooting rate平均根长/cm
average root length最大根长/cm
maximum root length根系效果指数
root effect indexT1 97.47±0.67 a 11.30±0.80 a 94.63±0.15 a 9.87±0.35 a 15.13±0.25 a 1.32±0.10 a T2 62.63±3.19 b 8.10±0.72 b 54.27±1.05 b 4.13±0.21 b 8.13±0.65 b 0.36±0.02 b T3 50.40±0.80 c 6.13±0.76 c 45.43±0.61 c 3.50±0.10 c 6.60±0.56 c 0.17±0.01 c T4 40.30±0.21 d 3.64±0.24 d 25.36±0.14 d 2.86±0.25 d 3.40±0.21 d 0.11±0.31 d CK 14.13±1.56 e 2.00±0.25 e 9.40±0.30 e 2.63±0.15 e 2.17±0.38 e 0.01±0.01 e 注：T1. 200 mg/L IBA，T2. 500 mg/L IBA，T3. 800 mg/L IBA，T4. 1100 mg/L IBA，CK. 清水对照；不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: CK. water control; different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05).
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表 2 GF677扦插生根指标间的相关性
Table 2 Correlation analysis among rooting indexes of GF677 cuttings
TP TK IAA CTK ETH PPO POD IAAO CR RN RR ARL REI TN 0.915** 0.918** −0.985** 0.971** −0.979** −0.993** −0.918* −0.966** −0.862 −0.977** −0.968** −0.966** −0.952** TP 0.963** −0.961** 0.961** 0.999** −0.997** −0.967** −0.984** −0.920* −0.990** −0.982** −0.946* −0.894* TK −0.945* 0.914* −0.998** −0.991** −0.982** −0.683* −0.920** −0.902** −0.856** −0.925** −0.661 IAA −0.772* −0.604* 0.824** 0.856** 0.770** 0.280* 0.177* 0.958** 0.541* 0.940* CTK 0.948** −0.565** −0.366* −0.794* −0.794 −0.912* −0.907** −0.965** −0.885** ETH −0.003 −0.141 −0.036 0.340 0.324 0.271 0.360* 0.05 PPO 0.943** 0.928** 0.715** 0.508** 0.503** 0.539** 0.366** POD 0.847** 0.543** 0.288 0.271 0.317 0.172 IAAO 0.826** 0.665** 0.636** 0.673** 0.495** CR 0.925** 0.886** 0.915** 0.681** RN 0.982** 0.926** 0.808** RR 0.923** 0.860** ARL 0.848** 注：TN. 全氮含量，TP. 全磷含量，TK. 全钾含量，IAA. 吲哚乙酸含量，CTK. 细胞分裂素含量，ETH. 乙烯含量，PPO. 多酚氧化酶活性，POD. 过氧化物酶活性，IAAO. 吲哚乙酸氧化酶活性，CR. 愈伤率，RN. 生根数，RR. 生根率，ARL. 平均根长，REI. 根系效果指数；“*”表示显著相关 (P<0.05)，“**”表示极显著相关 (P<0.01)。
Note: TN. total nitrogen content, TP. total phosphorus content, TK. total potassium content, IAA. indole acetic acid content, CTK. cytokinin content, ETH. ethylene content, PPO. polyphenol oxidase activity, POD. peroxidase activity, IAAO. indoleacetic acid oxidase activity, CR. callus rate, RN. rooting number, RR. rooting rate, ARL. average root length, REI. root effect index; “*” indicates significant correlation (P<0.05), “**” indicates extremely significant correlation (P<0.01).
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