离缘蝽的触角转录组和嗅觉相关基因
获得离缘蝽(Chorosoma macilentum)成虫触角的转录组数据，通过功能注释鉴定嗅觉相关基因，以期为研究离缘蝽触角信息交流的分子基础提供理论依据。
采用Illumina HiSeq高通量测序平台对离缘蝽雌、雄成虫触角转录组进行测序，并对相关数据进行注释和表达差异分析。
经组装后获得93 395条unigenes，其中22 904条在NR数据库得到注释，与茶翅蝽(Halyomorpha halys)相似性最高，为42.84%。GO注释结果显示：26 769条unigenes根据其功能注释到细胞组分、分子功能和生物学过程3类53个亚类。KEGG代谢通路分析结果显示：10 831条unigenes参与了5类代谢通路，且以信号转导占比最高，为11.62%。基于注释信息，在离缘蝽触角转录组中挖掘出94个嗅觉相关基因，包括54个嗅觉受体基因、25个气味结合蛋白基因、7个化学感受蛋白基因、5个味觉受体基因和3个感觉神经元膜蛋白基因。表达差异分析显示：与雌虫触角转录组相比，离缘蝽雄虫触角转录组包括131个上调表达基因和171个下调表达基因，下调表达基因中包含1个化学感受蛋白基因，且有5个嗅觉受体基因仅在雄成虫触角中表达。
本研究测得了离缘蝽成虫触角转录组，筛选出嗅觉相关基因，推测雌、雄离缘蝽成虫对外界气味化合物的识别存在差异，差异表达基因可能在离缘蝽信息识别过程中发挥着重要作用。
Antennal Transcriptome and Olfactory-related Genes of Chorosoma macilentum
To obtain antennal transcriptome data of Chorosoma macilentum and identify the olfactory-related genes, providing theoretical foundation for the molecular function of antennal information communication.
The transcriptomic database of C. macilentum was established using Illumina HiSeq high-throughput sequencing, and the related data were annotated and expressed differently.
Totally 93 395 unigenes were obtained through assembling after transcriptome sequencing, of which 22 904 unigenes were annotated based on the NR database, and most of unigenes were optimally hit to genes of Halyomorpha halys (42.84%). Annotated results of GO database showed that 26 769 unigenes divided into 53 subcategories and three types (cellular components, molecular functions, and biological processes). KEGG metabolic pathway analysis showed that 10 831 unigenes were annotated into five metabolism pathways, and most unigenes were involved in signal transduction (11.62%). Based on the annotated information of unigenes, 94 genes encoding olfaction-related proteins of C. macilentum, including 54 olfactory receptor protein genes, 25 odorant binding protein genes, seven chemosensory protein genes, five gustatory receptor genes, and one sensory neuron membrane protein genes. Compared with the transcriptome of female antenna, the transcriptome of male antenna included 131 up-regulated genes and 171 down-regulated genes, and the down-regulated genes contained one chemoreceptor protein gene, and five olfactory receptor genes were expressed only in the antennae of male adults.
In this study, the antennal transcriptomes of adult bugs are determined, and the olfactory-related genes are screened out. The results indicate that female and male adults have different recognition of external odor compounds, and the olfactory differentially expressed genes may play an important role in the information recognition processes.
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植物叶蛋白又可称作绿色蛋白浓缩物，是从植物茎叶中提取的蛋白质[1]。植物叶蛋白含量较高且含有的氨基酸丰富多样，可作为蛋白质饲料或人类膳食蛋白质的补充物[2-4]，是一种利用价值较高的新型蛋白质资源，其材料来源广，开发潜力较大，在食品、饲料、医疗等方面具有较为广阔的应用前景[5-6]。烟草是中国重要的特种经济作物，其种植面积和产量均居世界首位。烟叶除了可以作为卷烟原料外，其叶蛋白的含量也十分丰富，尤其是可溶性蛋白的含量很高[7-8]。烟叶蛋白除了具有蛋白质的基本功能特性外，在饲用、食用、药用等方面都具有很高的应用价值[9-10]，是一种极具利用潜力和发展前景的植物蛋白资源[11]。植物叶蛋白直接利用的效率低，而经水解后其功能增强，利用效率提高，其水解产物具有更好的生物可吸收性和生物活性[12-14]。此外，植物叶蛋白经酶水解提取的活性肽具有抗菌活性和蛋白酶抑制活性，且稳定性较高，是制备抗菌肽的重要潜在资源[15-16]。
中国烟草类型多样，深入研究开发烟叶蛋白资源对于提高烟草的综合利用价值以及充分发挥烟草蛋白功能具有重要意义。本研究以雪茄烟为材料，采用碱溶酸沉法提取烟叶蛋白质，优化最适料液比、碱溶pH、碱溶时间、酸沉 pH 值等提取条件；通过胃蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解雪茄烟叶蛋白，分析不同酶解产物的氨基酸组成及含量，并对其抗氧化活性进行评价，以期优化雪茄烟叶蛋白提取以及水解物的制备方法，为烟叶蛋白资源的深度开发与利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试雪茄烟品种为J52，种植于中国农业科学院烟草研究所青岛试验基地。供试复合蛋白酶(1.2×105 U/g)、木瓜蛋白酶(8.0×106 U/g)、碱性蛋白酶(2.4×104 U/g)、中性蛋白酶(5.0×104 U/g)和胃蛋白酶(3.0×103 U/g)均购于北京索莱宝科技有限公司。
1.2 试验方法
采用碱溶酸沉法[17]提取雪茄烟叶蛋白，并参考饶国华等[18]和王芳等[19]的方法分别设计单因素试验和正交试验，确定雪茄烟叶蛋白最佳提取条件。
1.2.1 雪茄烟叶蛋白提取的单因素试验
选择料液比、碱溶pH、碱溶时间、提取温度、酸沉pH等5个因素，分别进行雪茄烟叶蛋白提取单因素试验 (表1)，并采用BCA法测定蛋白质提取率[20]。
表 1 单因素试验的因素与水平Table 1. Factors and levels of single factor experiment水平
level料液比 (g∶mL)
solid-liquid ratio提取温度/℃
extraction temperature碱溶时间/min
alkali dissolution time碱溶 pH
alkali dissolution pH酸沉 pH
acid deposition pH1 1∶5 30 20 6.0 1.5 2 1∶10 40 40 7.0 2.0 3 1∶15 50 60 8.0 2.5 4 1∶20 60 80 9.0 3.0 5 1∶25 70 100 10.0 3.5 6 1∶30 80 120 11.0 4.0 1.2.2 雪茄烟叶蛋白提取的正交试验
在单因素试验的基础上，对影响蛋白提取率的因素料液比(A)、碱溶pH (B)、碱溶时间(C)、提取温度(D)和酸沉pH (E)进行L16 (45)优化正交试验(表2和表3)。
表 2 正交试验的因素与水平Table 2. Factors and levels of orthogonal experiment水平
level料液比 (g∶mL)
solid-liquid ratio提取温度/℃
extraction temperature碱溶时间/min
alkali dissolution time碱溶 pH
alkali dissolution pH酸沉 pH
acid deposition pH1 1∶20 40 20 7.0 2.5 2 1∶25 50 40 8.0 3.0 3 1∶30 60 60 9.0 3.5 4 1∶35 70 80 10.0 4.0 1.2.3 雪茄烟叶蛋白的酶解
将提取的雪茄烟叶蛋白溶于蒸馏水50 mL中，参考张建萍等[21]的方法，利用不同蛋白酶在各自最适温度和pH值(表4)条件下对雪茄烟叶粗蛋白进行酶解，酶解6 h时取样，然后立即将酶解液置于85 ℃灭酶10 min。采用邻苯二甲醛法[22]，利用紫外可见分光光度计(UV-2450，岛津公司)测定不同酶解液的水解度(即340 nm处的吸光度值)，并以L-丝氨酸的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
表 3 烟叶蛋白提取工艺正交试验设计及结果Table 3. Orthogonal test design and results of tobacco leaf protein extraction process编号
number料液比 (A)
solid-liquid ratio碱溶温度 (B)
alkali dissolution temperature碱溶时间 (C)
alkali dissolution time碱溶 pH (D)
alkali dissolution pH酸沉 pH (E)
acid deposition pH蛋白质提取率/%
protein extraction rate1 1 1 1 1 1 51.73 2 1 2 2 2 2 68.73 3 1 3 3 3 3 66.37 4 1 4 4 4 4 49.79 5 2 1 2 3 4 49.09 6 2 2 1 4 3 55.95 7 2 3 4 1 2 78.74 8 2 4 3 2 1 64.20 9 3 1 3 4 2 69.11 10 3 2 4 3 1 52.58 11 3 3 1 2 4 62.11 12 3 4 2 1 3 51.51 13 4 1 4 2 3 58.84 14 4 2 3 1 4 48.51 15 4 3 2 4 1 50.84 16 4 4 1 3 2 62.44 K1 236.62 228.77 232.23 230.49 219.35 K2 247.98 225.77 220.17 253.88 279.02 K3 235.31 258.06 248.19 230.48 232.67 K4 220.63 227.94 239.95 225.69 209.50 k1 59.16 57.19 58.06 57.62 54.84 k2 62.00 56.44 55.04 63.47 69.76 k3 58.83 64.52 62.05 57.62 58.17 k4 55.16 56.99 59.99 56.42 52.38 R 6.84 8.07 7.01 7.05 17.38 注：各因素水平对应条件见表2。
Note: The corresponding conditions for each factor level are shown in Tab.2.表 4 不同蛋白酶的酶解条件Table 4. Enzymatic hydrolysis condition of different proteases酶的种类
types of enzymes温度/℃
temperaturepH w/% 复合蛋白酶 protamex 50 7.5 5 木瓜蛋白酶 papain 55 6.0 5 碱性蛋白酶 alkaline protease 55 9.0 5 中性蛋白酶 dispase 45 7.0 5 胃蛋白酶 pepsin 40 2.0 5 注：w为[E]/[S]，表示酶与底物 (烟叶蛋白) 的质量比。
Note: w is [E]/[S], indicating the mass ratio of enzyme to substrate (tobacco protein).1.2.4 不同酶水解产物氨基酸组成的测定
利用Biochrom30全自动氨基酸分析仪测定蛋白水解产物的氨基酸组成。按照《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124—2016)[23]的方法，称取酶解后的烟叶蛋白粉0.2 g置于10 mL离心管中，加入实验室制备的氨基酸提取液5 mL，将离心管于超声仪中超声40 min，5000 r/min离心10 min，取上清液，过0.45 μm有机相滤膜后转移至进样瓶，用氨基酸分析仪进行测定。
1.2.5 蛋白水解产物抗氧化活性的测定
为综合评价烟叶蛋白水解产物的抗氧化能力，分别测定其DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率。(1) DPPH自由基清除率的测定[24]：将待测水解液10 μL与DPPH乙醇溶液190 μL混合，测定515 nm处的吸光度和吸光度下降率，以反映样品对DPPH自由基的清除能力。(2) 超氧阴离子自由基清除率的测定[25]：将AP-TEMDE体系溶液250 μL与酶解溶液125 μL混合，再加入盐酸羟胺溶液250 μL并充分混合；37 ℃反应30 min，加入对氨基苯磺胺溶液250 μL和α-茶胺溶液250 μL，充分混合，37 ℃显色，测定530 nm处的吸光度。(3)羟自由基清除率的测定[26]：每个样品置于离心管中，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4) 0.15 mL、0.75 mmol/L FeSO4 0.30 mL和0.01% H2O2 0.30 mL，摇匀1 min，充分混合；加入烟叶蛋白酶水解样品0.15 mL、1.5 mmol/L邻二氮菲溶液0.15 mL和去离子水0.45 mL，测定每个样品536 nm处的吸光度。
2. 结果与分析
2.1 雪茄烟叶蛋白提取条件优化
单因素试验结果(图1)表明：随着料液比的增加，雪茄烟叶蛋白的提取率升高，自料液比1∶25后变化趋势趋于平缓，当料液比为1∶30时蛋白质提取率达到最高(73.24%)；随着碱溶时间的延长，蛋白质提取率也不断升高，到60 min时蛋白质提取率达到最高(75.08%)，80 min时蛋白质提取率稍有降低；随着提取温度、碱溶pH和酸沉pH的增加，蛋白提取率呈明显的先升高后降低的变化趋势，当温度达到60 ℃、碱溶pH为8.0和酸沉pH为3.0时蛋白质提取率均达到最高。
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图 1 不同因素对烟叶蛋白质提取率的影响Figure 1. Effects of different factors on the protein extraction rate of tobacco leaves在单因素试验结果基础上，通过正交试验确定了蛋白提取的最佳条件(表3，取决于k值大小)为A2B3C3D2E2，即料液比1∶25 (g∶mL)，碱溶温度60 ℃，碱溶时间60 min，碱溶pH为8，酸沉pH为3，在此提取条件下进行3次平行验证试验，所得烟叶粗蛋白的平均提取率为79.08%，均高于其他试验组。方差分析结果(表5)表明：酸沉pH对烟叶蛋白提取率有显著影响，料液比、碱溶时间、碱溶pH和碱溶温度对烟叶蛋白提取率的影响相对较小。
表 5 烟叶蛋白提取工艺正交试验结果多因素方差分析Table 5. Analysis of variance of orthogonal test results of tobacco leaf protein extraction process因素
factors平方和
quadratic sum自由度 (df )
degree of freedom均方差
mean square deviationF 值
F-valueP 值
P-value料液比 (A)
solid-liquid ratio94.41 3.00 31.47 0.23 0.87 碱溶温度 (B)
alkali dissolution temperature176.39 3.00 58.80 0.43 0.74 碱溶时间 (C)
alkali dissolution time106.50 3.00 35.50 0.26 0.85 碱溶 pH (D)
alkali dissolution pH120.96 3.00 40.32 0.96 0.45 酸沉 pH (E)
acid deposition pH709.57 3.00 236.52 5.64 0.02* 注：“*”表示影响达到显著水平 (P<0.05)。
Note: “*” indicates significant effect (P<0.05).2.2 雪茄烟叶蛋白的水解度
由图2可知：复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对雪茄烟叶蛋白的水解度有一定差异。随着酶解时间的延长，雪茄烟叶蛋白水解度呈逐渐上升的趋势，水解5 h后趋于稳定，其中胃蛋白酶对雪茄烟叶蛋白的水解度最高，水解度为15.52%，然后依次为复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，水解度分别为14.73%、12.00%、10.33%和9.89%。
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图 2 不同蛋白酶酶解烟叶蛋白的水解度Figure 2. Hydrolysis degree of tobacco leaf protein hydrolyzed by different proteases2.3 雪茄烟叶蛋白水解产物的氨基酸组成
由表6可知：不同酶水解雪茄烟叶蛋白的产物中均以谷氨酸的含量最高，半胱氨酸的含量最低；胃蛋白酶酶解雪茄烟叶蛋白后，其产物中氨基酸总量最高，然后依次是复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶；胃蛋白酶酶解产物的氨基酸组成比例也发生变化，其必需氨基酸、疏水性氨基酸、负电荷氨基酸和正电荷氨基酸含量均最高，其中，必需氨基酸与总氨基酸的比值、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值均高于FAO/WHO标准规定值(分别为0.4和0.6)[27]。
表 6 不同蛋白酶酶解产物的氨基酸含量和组成Table 6. Amino acid content and composition of different protease hydrolysatesmg/mL 氨基酸种类
kinds of amino acid胃蛋白酶
pepsin复合蛋白酶
protamex碱性蛋白酶
alkaline protease木瓜蛋白酶
papain中性蛋白酶
dispase异亮氨酸 isoleucine 25.25 11.14 17.41 19.84 13.74 亮氨酸 leucine 76.55 38.80 38.90 36.95 34.52 赖氨酸 lysine 27.02 22.70 16.20 14.96 15.21 蛋氨酸 methionine 36.75 21.57 24.93 23.90 14.53 苯丙氨酸 phenylalanine 32.65 31.90 20.81 20.92 25.34 苏氨酸 threonine 46.30 28.35 29.50 27.85 21.94 缬氨酸 valine 22.49 23.45 26.14 21.81 11.22 色氨酸 tryptophan 36.28 35.90 23.30 14.70 12.72 天冬氨酸 aspartate 86.95 42.50 40.20 43.80 36.26 丝氨酸 serine 43.65 19.40 21.30 28.57 21.43 甘氨酸 glycine 27.20 27.26 31.74 20.38 16.26 丙氨酸 alanine 41.20 37.28 32.47 30.21 14.67 谷氨酸 glutamate 107.50 79.78 71.86 66.51 60.57 半胱氨酸 cysteine 3.80 4.69 4.43 2.44 1.58 酪氨酸 tyrosine 32.40 19.66 11.96 15.30 14.48 组氨酸 histidine 19.25 26.80 19.54 17.33 28.36 精氨酸 arginine 41.45 29.28 24.28 23.56 11.28 脯氨酸 proline 25.05 21.99 30.12 24.40 16.56 TAA/(mg·mL−1) 731.74 522.45 485.09 453.43 370.67 EAA/TAA 0.41 0.41 0.41 0.40 0.40 EAA/NEAA 0.71 0.69 0.68 0.66 0.67 HAA/(mg·mL−1) 296.22 222.03 214.08 192.73 143.30 NCAA/(mg·mL−1) 194.45 122.28 112.06 110.31 96.83 PCAA/(mg·mL−1) 87.72 78.78 60.02 55.85 54.85 注：EAA. 必需氨基酸；TAA. 氨基酸总量；NEAA. 非必需氨基酸；HAA. 疏水性氨基酸；NCAA. 负电荷氨基酸；PCAA. 正电荷氨基酸。
Note: EAA. essential amino acids; TAA. total amino acid; NEAA. non-essential amino acids; HAA. hydrophobic amino acid; NCAA. negatively charged amino acids; PCAA. positively charged amino acids.2.4 雪茄烟叶蛋白水解产物的抗氧化活性
由图3可知：胃蛋白酶对雪茄烟叶蛋白水解后，其水解产物对超氧阴离子自由基、DPPH自由基及羟自由基的清除能力均得到提升，且随着酶解时间的延长呈逐渐上升的趋势，6 h后基本趋于稳定，其中，对超氧阴离子自由基清除率最高(57.54%)，其次是对DPPH自由基的清除率(36.65%)，对羟自由基的清除率最低(31.72%)。
3. 讨论
植物叶蛋白的提取方法有很多种，目前提取效率较高的方法主要有碱溶酸沉法、膜过滤法、发酵法等；另外还有直接加热法、酸沉法、碱沉法、盐析法等，但应用范围较窄，而且蛋白质提取率一般[28]。本研究采用碱溶酸沉法提取雪茄烟叶蛋白，由于试验所用材料为新鲜烟叶，在蛋白提取时首先进行冻干预处理，同时在研磨处理后进行超声辅助，提高了碱溶过程中蛋白质的提取率，获得了较好的蛋白提取效果，蛋白提取率达到79.08%，这与已有研究的植物蛋白提取率[29-30]相近。本研究优化的雪茄烟叶蛋白最佳提取方案可为烟叶蛋白的提取利用提供参考和依据。
蛋白质通过酶促反应水解，其氨基酸组成会发生一定的变化，能够产生游离氨基酸或短肽，对蛋白水解产物的营养价值以及生物活性产生一定的影响，目前酶水解已被用于生产生物活性肽及提高食品营养价值[31-32]。已有研究表明：不同蛋白酶对蛋白的水解效果具有一定的差异，如：许英一等[16]利用复合蛋白酶对苜蓿叶蛋白进行水解，水解产物中必需氨基酸和总氨基酸的含量均升高，同时增强了DPPH自由基的清除能力；王婷婷[33]采用胰蛋白酶水解大豆水溶性蛋白，其水解产物的自由基清除能力明显提升。本研究对比了5种蛋白酶对雪茄烟叶蛋白的水解效果，结果表明：胃蛋白酶对雪茄烟叶蛋白具有较好的水解能力，水解产物中游离氨基酸总量以及必需氨基酸、疏水性氨基酸、负电荷氨基酸和正电荷氨基酸含量均最高，且对超氧阴离子自由基具有较好的清除作用。可见，雪茄烟叶蛋白经胃蛋白酶水解后，能够改善其氨基酸组成和比例，提升营养价值，增强其水解产物的抗氧化能力。因此，在合适的反应条件下，胃蛋白酶可用于烟叶蛋白的高效水解，能够提升烟叶蛋白的生理活性，对于烟草蛋白资源的深度开发和高值化利用具有一定的应用价值。今后还需对雪茄烟叶蛋白水解产物的功能以及活性成分的分离纯化等继续开展深入研究，深度挖掘利用烟叶蛋白资源，提高烟草的综合利用价值。
4. 结论
碱溶酸沉法提取雪茄烟叶蛋白的最佳提取条件为：料液比1∶25 (g∶mL)，碱溶pH为8.0，碱溶时间为80 min，提取温度为60 ℃，酸沉pH为3.0。胃蛋白酶对雪茄烟叶蛋白的水解效果最好，其水解产物中的游离氨基酸总量最高，氨基酸组成和比例得到改善，提升了营养价值。雪茄烟叶蛋白经胃蛋白酶水解后，对超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟自由基的清除能力得到提高，抗氧化能力增强。
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图 1 离缘蝽触角转录组GO功能注释
Figure 1. Annotated unigenes in antennal transcriptome of Chorosoma macilentum in GO database
表 1 离缘蝽雌、雄成虫触角样品转录组测序结果
Table 1 Sequencing results of antennae transcriptome samples from female and male adults of Chorosoma macilentum
样本
sample原始总读数
total raw reads筛选后总读数
total clean reads筛选后总碱基数/Gb
total clean basesQ20占比/%
proportion of Q20Q30占比/%
proportion of Q30雌性 female 42 097 490 39 856 570 6.02 96.89 92.08 雄性 male 42 588 210 40 055 068 6.05 96.83 92.08 
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表 2 离缘蝽触角转录组组装结果
Table 2 Antennal transcriptome assembly results of C. macilentum
项目 items 转录本 transcript unigenes 总数 total number 195 063 93 395 总长度/bp total length 175 979 016 71 405 984 平均长度/bp average length 902 765 N50长度/bp length of N50 1 232 915 N90长度/bp length of N90 399 364
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表 4 离缘蝽触角转录组基因功能注释结果
Table 4 Results of the annotated unigenes in antennal transcriptome of C. macilentum
数据库
database数量
number占比/%
proportionNR 22 904 24.52 GO 5 590 5.99 KEGG 9 622 10.30 Pfam 11 861 12.70 eggNOG 20 171 21.60 Swissprot 14 311 15.32
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表 3 离缘蝽触角转录组序列长度统计
Table 3 Statistics of the antennal transcriptome sequence length of C. macilentum
长度范围/bp
length range转录本 transcript unigenes 数量 number 占比/% proportion 数量 number 占比/% proportion 301~500 53 241 27.19 37 315 39.95 501~1 000 46 833 24.01 29 498 31.58 1 001~2 000 45 375 23.26 15 335 16.42 ≥2 001 49 614 25.43 11 247 12.04
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