经皮给药系统(transdermal therapeutic system，TTS)是指在经皮肤给药后，药物迅速穿透皮肤，进入血液循环而起到全身治疗作用的控释制剂^[1]，其药物作用稳定持久，能有效避免肝脏首过效应，也可避免药物在人体胃肠道中被破坏，减轻毒副作用，用药方便。镇痛药物在全球临床上的应用非常广泛，但其胃肠道副作用极常见，常会引起胃肠道溃疡综合征^[2]，口服给药期间还会发生如便秘、呕吐、心动迟缓、消化障碍、胀气、食欲不振和意识模糊等不良反应^[3]。镇痛类药物口服发生不适症状时药物已入血，减少血液中的药物浓度比较困难，因此，镇痛类药物经皮给药外用制剂的研究受到广泛关注。

使用动物皮肤进行药物渗透试验，可以计算透皮给药的吸收速率和吸收量，是TTS体外评价的重要环节。药物透皮吸收的检测方法包括体外法和在体法，使用离体皮肤通过Franz扩散池法测定药物的体外释放速度和透过皮肤药物量是评估经皮吸收药物渗透性的经典方法^[1]。有研究通过Franz扩散池法比较了鼠、兔、蛇、猪、青蛙和泥鳅等动物皮肤与人体皮肤的药物渗透性，猪皮肤与人体皮肤对药物渗透性最为相似^[4]。此外，已有研究表明猪在生理学、皮肤组织学和解剖学等方面与人类有很多相似之处^[5]，因此，猪皮肤是进行药物皮肤渗透研究的理想载体^[6]。版纳微型猪近交系作为中国的特有及优势品种，是目前最理想的试验用小型猪之一^[7]。除了具有试验用小型猪共有的优势之外，版纳微型猪近交系还具有饲养成本低、发育成熟时形体较小、易于试验操作管理、基因纯合度高和个体间差异小等优势。目前，以版纳微型猪近交系作为动物模型来评估经皮吸收药物渗透性的试验尚未见报道。本研究首先通过HE染色、Masson染色、弹力纤维染色以及透射电镜技术比较版纳微型猪近交系皮肤(以下简称“猪皮肤”)和人皮肤组织形态的相似性；再选择水杨酸溶液、双氯酚酸二乙胺乳膏和利多卡因凝胶贴膏3种药物作为模型药物，通过Franz扩散池法比较24 h内猪皮肤和人皮肤药物质量浓度—时间曲线的相似性，从组织学形态和药物渗透性上验证猪皮肤与人皮肤的相似性，为版纳微型猪近交系作为经皮吸收药物评估的良好模型提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   临床皮肤组织

人皮肤样本来自乳腺癌患者手术治疗过程中切除的乳房皮肤组织，由昆明医科大学第一附属医院提供。去除皮下脂肪后，将皮肤裁剪为2 cm×2 cm的皮片，置于−80 ℃冰箱保存。皮肤用前放至磷酸盐缓冲溶液(PBS)中解冻，恢复室温后备用。

1.1.2   猪皮肤组织

选取健康8月龄雄性版纳微型猪近交系6头，经耳缘静脉注射丙泊酚(2 mg/kg)麻醉后，从猪的肩胛部、臀部、背部及侧腹部切取大小为2 cm×2 cm的皮片；猪乳房组织皮肤取自1头11月龄雌性版纳微型猪近交系。切取皮肤后，尽量去除皮下脂肪组织，用生理盐水冲洗后用吸水纸吸干，置于−80 ℃冻存。试验动物饲养和处理均符合实验动物福利和伦理要求，试验过程严格遵守云南农业大学生命科学伦理委员会相关要求。

1.2   试验试剂和仪器

主要试剂：1%双氯酚酸二乙胺乳膏剂，GSK Consumer Heathcare Schweiz AG；水杨酸，上海源叶；利多卡因凝胶贴膏(14 cm×10 cm，700 mg)，北京泰德制药股份有限公司；丙泊酚，江苏恩华药物股份有限公司；双氯酚酸二乙胺标准品、水杨酸标准品和利多卡因标准品，北京万家标准物质研发中心；PBS、HE染色试剂盒(G1120)、Masson三色染色试剂盒(G1340)和弹力纤维染色试剂盒(G1593)，北京索莱宝科技有限公司。

主要仪器：TP-6型透皮扩散仪(天津精拓仪器科技有限公司)；酶标仪(Thermo， MultiskanGo)；高效液相色谱仪(Agilent，1100)；显微镜(OLYMPUS，BX53)；透射电子显微镜(Japan Electronics，JEM-1400Plus)。

1.3   皮肤组织结构形态观测

1.3.1   HE染色、Masson染色和弹力纤维染色

将人和猪皮肤在4%多聚甲醛中固定，经石蜡包埋后，用石蜡切片机切取厚4 μm的切片；石蜡切片经过二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化处理后，分别按照HE染色、Masson三色染色和弹力纤维染色试剂盒说明书对切片进行染色；染色完成后，用中性树胶封片，置于烤片机上于62 ℃烤干，在显微镜下观察并采集图像。

1.3.2   透射电镜观察

于4 ℃下使用2.5%戊二醛溶液对新鲜采集的皮肤组织(1 mm³)进行固定过夜，用0.1 mol/L PBS洗涤3次，持续7 min；将皮肤组织用1%锇酸溶液于4 ℃下固定2 h，然后用去离子水洗涤3次，持续7 min，之后依次进行乙醇脱水和丙酮转化各5 min。将固定后的组织包埋在Epon812树脂中，在60 ℃下聚合48 h；使用Leica EM UC7超微切片机将样品制作成超薄切片(800 nm)，然后将超薄切片加载到铜网格上，并用2%乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色，然后在80 kV下使用透射电子显微镜进行观察。

1.3.3   皮肤组织厚度测量

分别使用游标卡尺和组织切片法测量供试皮肤的厚度。切取的皮肤组织，去除皮下脂肪组织后，首先通过游标卡尺测量皮肤厚度；然后通过显微镜采集Masson染色图片，使用显微镜自带的软件根据标尺测量和计算表皮、真皮以及全皮层厚度。

1.4   皮肤渗透试验

体外皮肤渗透试验使用透皮扩散仪进行。在6个透皮杯接受室中加入PBS 10 mL，放入搅拌子。将解冻后的皮肤固定于接受室上，皮肤角质层朝向供给室，分别将水杨酸溶液、双氯酚酸二乙胺乳膏和利多卡因凝胶贴膏置于皮肤表面。因水杨酸溶液透皮性较差，渗透试验前需在供给室中加入促渗剂(3%月桂氮卓酮) 1 mL，于32 ℃水溶液中作用1 h后吸出促渗剂，用PBS多次洗净后再进行渗透试验。设置搅拌子转速为350 r/min，分别在给药后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0 h吸取渗透液600 μL放于EP管中保存，每次取样后向接受室中加入等量的PBS。

1.5   药物质量浓度的测定

1.5.1   酶标仪检测

在电子天平上称取双氯芬酸二乙胺和利多卡因标准品各100 mg，分别使用PBS定容至50 mL，得到双氯芬酸二乙胺和利多卡因标准品溶液母液(2 mg/mL)，并配置双氯酚酸乙二胺(10、20、40、60、80、100和200 μg/mL)和利多卡因(50、100、200、300、400和500 μg/mL)的梯度标准品溶液。使用酶标仪分别在波长300和294 nm处读取双氯芬酸二乙胺和利多卡因梯度标准品溶液以及0~24 h的渗透液OD值。根据OD值和药物梯度绘制标准曲线，并计算药物质量浓度。

1.5.2   高效液相色谱法检测

因水杨酸溶液在水中的溶解度较低，故其质量浓度采用灵敏度更高的高效液相色谱法检测。试验条件为：色谱柱Hypersil BDS C₁₈ (3.9 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇—水—冰醋酸；检测波长300 nm；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。测定峰面积后，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线方程，并计算水杨酸溶液渗透0~24 h的药物质量浓度。

1.6   数据统计与分析

使用SPSS软件对数据进行统计分析，2组间比较采用t检验，3组以上采用单因素方差分析，结果均以“平均值±标准差”表示。

2.   结果与分析

2.1   猪皮肤与人皮肤组织学比较

HE染色和Masson染色结果(图1a)显示：猪皮肤和人皮肤的分层相同，均由角质层、表皮层和真皮层构成，但人乳房皮肤的角质层比较疏松，猪皮肤的角质层比较致密。猪皮肤表皮层极显著厚于人皮肤表皮层，其真皮层极显著薄于人皮肤真皮层(P<0.01，图1b)。2种皮肤的真皮层均由大量的胶原纤维和弹性纤维以及细胞成分较少的致密结缔组织构成，真皮层可见血管丛分布，但与猪皮肤相比，人皮肤的胶原纤维和弹力纤维较粗壮(图1a)。在电镜下，人和猪的皮肤组织均可见角质层、表皮层及真皮层，其中，表皮层细胞种类丰富，可见颗粒层细胞、棘层细胞、基底细胞和黑色素细胞(图2、3)。以上结果表明猪皮肤与人皮肤组织结构相似，但厚度上有差别。

图  1  人皮肤和猪皮肤组织形态(a)和厚度(b)

注：a) Masson染色图中H为角质层，E为表皮层，D为真皮层，红色方框为血管丛；弹力纤维染色图中黄色为胶原纤维，紫色为弹力纤维；b) “**”表示差异极显著 (P< 0.01)。

Figure  1.  Histomorphology (a) and thickness (b) of human and pig skins

Note: a) in the figure of Masson staining, H is horny layer, E is epidermis, D is dermis layer, and the venous plexus is shown in the red box; in the figure of elastic fiber staining, the yellow fibers are collagen fibers and purple for elastic fibers; b) “**” indicates extremely significant differences (P<0.01).

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图  2  人皮肤组织透射电镜图像

注：a) 角质层(H)和表皮层(E)，下同；b) 和c) 棘层细胞 (1)；d) 真皮层和黑色素细胞(2)。

Figure  2.  Transmission electron microscope image of human skin tissue

Note: a) horny layer (H) and epidermal layer (E), the same as below; b) and c) spinal layer cells (1); d) dermis layer and melanocytes (2).

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图  3  猪皮肤组织透射电镜图像

注：b)和c) 棘层细胞(1)和颗粒细胞(2)；d) 真皮层和黑色素细胞 (3)。

Figure  3.  Transmission electron microscope image of pig skin tissue

Note: b)和c) spinal layer cells (1) and granular cells (2); d) dermis layer and melanocytes (3).

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2.2   版纳微型猪不同部位的皮肤厚度

由图4可知：在测定的4个部位皮肤中，肩胛部皮肤最厚，臀部皮肤次之，背部和腹部皮肤较薄。由于腹部取皮容易导致猪伤口感染，故选择采集背部皮肤进行皮肤渗透试验。

图  4  版纳微型猪近交系不同身体部位的皮肤厚度

注：“*”和“**”分别表示与肩胛部皮肤厚度相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)；“#”和“##”分别表示臀部、背部和腹部皮肤之间相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

Figure  4.  Skin thickness in different body parts of Banna miniature pig inbred lines

Note: “*” and “**” indicates significant differences (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) comparing with the skin thickness of shoulder, respectively; “#” and “##” indicates significant differences (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) between buttock, back, and abdomen skin, respectively.

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2.3   猪皮肤和人皮肤的渗透性

渗透0~24 h内，各时间点猪皮肤和人皮肤渗透液中的水杨酸质量浓度均无显著差异(图5a~b)；渗透的第1和2小时，人皮肤扩散池中的双氯酚酸二乙胺质量浓度显著高于猪皮肤扩散池(P<0.05)，其余时间点2组扩散池中的双氯酚酸二乙胺质量浓度均无显著差异(P>0.05) (图5c~d)；渗透0~24 h内，各时间点猪皮肤和人皮肤扩散池中的利多卡因质量浓度均无显著差异(P>0.05) (图5e~f)。人皮肤与猪皮肤透过的水杨酸、双氯酚酸二乙胺和利多卡因质量浓度随着渗透时间的延长而升高，表明3种药物的缓慢和稳定释放。此外，在渗透试验的0~24 h，大部分时间点人皮肤与猪皮肤的水杨酸、双氯酚酸二乙胺和利多卡因的质量浓度均无显著差异，表明3种药物在2种皮肤的渗透性较为相似，可作为评价镇痛类经皮渗透药物的皮肤模型。

图  5  猪皮肤和人皮肤对水杨酸、双氯酚酸二乙胺和利多卡因的渗透性

注：a)、c)和e)为标准曲线；b)、d)和f)为药物质量浓度—时间曲线，“*”表示猪皮肤与人皮肤药物渗透质量浓度相比差异显著(P<0.05)。

Figure  5.  Permeability of salicylic acid, dichlorophenol diethylamine and lidocaine between pig skin and human skin

Note: a), c) and e) are standard curve; b), d) and f) are drug mass concentration-time curve, “*” indicates significant differences in drug penetration mass concentration between pig skin and human skin (P<0.05).

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3.   讨论

经皮给药系统是目前除了口服给药和静脉注射给药的第三大给药系统^[8-9]。镇痛类经皮吸收药物属于作用于全身的药物，外用药物必须经过皮肤吸收进入循环并在体液中达到一定浓度后才能发挥疗效，因此，需要保证药物能够渗透皮肤，并且持续、缓慢的释放。使用离体皮肤渗透试验评估经皮药物的吸收性是其开发过程的重要环节之一。然而，可用于科研的人类皮肤严重短缺，选择与人体皮肤渗透性接近的动物皮肤模型尤为重要。目前，在国际上已经将哥廷根小型猪和尤卡坦小型猪皮肤用于放射性治疗评估、药物透皮吸收效果评价^[9]和局部应用药物的毒性筛选^[10]等多个领域，但是中国云南省特有的版纳微型猪近交系尚未广泛应用于该领域。为促进云南省特有版纳微型猪近交系的实验动物化，本研究利用版纳微型猪近交系皮肤和人皮肤开展水杨酸溶液、利多卡因凝胶贴膏以及双氯芬酸钠二乙胺乳膏的体外渗透试验，比较猪皮肤与人皮肤在镇痛类经皮吸收药物渗透性的相似性。

本研究比较了版纳微型猪近交系和人皮肤的组织结构。人皮肤材料大部分来源于外科整形手术，多为腹部、乳房和背部皮肤，或是来源于捐献的遗体^[11-12]。本研究表明：猪皮肤由角质层、表皮层和真皮层组成，与报道的人类皮肤分层^[13-14]一致。可能由于人乳房皮肤组织来自年老个体，11月龄版纳微型猪近交系猪乳房皮肤的角质层较人乳房皮肤角质层更薄、更致密，人乳房皮肤角质层较为疏松。本研究还显示：猪与人皮肤的厚度有一定差异，猪皮肤表皮层较人的表皮层厚、真皮层较人的真皮层薄；猪皮肤中黑色素细胞较人皮肤中黑色素细胞多，与已有研究结果^[15]一致。

为了选取合适的取皮部位，本研究通过游标卡尺和组织切片显微镜测量法对4个部位的猪皮肤进行了厚度测量，结果显示：肩胛部皮肤最厚，臀部皮肤次之，背部和腹部皮肤较薄，可选择背部和侧腹部为供皮部位。由于猪习惯躺卧，切取侧腹部皮肤容易导致猪伤口感染，本研究选取了背部皮肤进行药物渗透试验。不同物种的皮肤组织结构具有差异，皮肤来源的异质性是一个限制条件，不可完全避免。尽管猪皮肤和人皮肤的取样部位不同，但本研究结果显示：猪背部皮肤对水杨酸和利多卡因的渗透性与人类的乳房皮肤相似，与已有研究^[16]具有相同的规律。在进行水杨酸溶液渗透时，先用3%月桂氮卓酮对猪皮肤和人皮肤促渗1 h，可使皮肤角质层细胞的排列变得疏松，提高皮肤的通透性^[17-18]，使扩散池下室的药物质量浓度可检测到，此步骤对试验具有重要意义，提示在经皮吸收药物的剂型设计中添加促渗剂具有重要作用^[19]。此外，在水杨酸溶液渗透试验的第24小时，组内3个样本的药物质量浓度差异较大，可能是由于渗透试验持续时间较长，液体挥发所致；相比之下，利多卡因凝胶贴膏未出现该现象，表明剂型稳定性对外用药物吸收具有重要意义。

在双氯酚酸二乙氨乳膏的渗透试验中，相同渗透时间下人皮肤药物渗透量比猪皮肤稍高，其原因可能与角质层、皮肤厚度、年龄、毛囊数量结构、渗透阻力和取样部位等有关^[20]。本研究中，所用人体皮肤是中老年皮肤，其角质层较为疏松；而猪皮肤来自青年猪，其角质层较为致密，且猪皮肤的表皮层显著厚于人皮肤表皮层，所以猪皮肤的渗透阻力略大于人皮肤的渗透阻力，这可能是导致人皮肤药物渗透量比猪皮肤药物渗透量高的原因之一。此外，猪皮肤的毛囊深度更深，其表面的被毛成簇分布，所采集皮肤的毛囊和毛孔大小不相同，其皮肤组成也会发生变化，进而影响渗透效果，提示在药物渗透性试验研究中应尽量选择皮肤较薄的部位。

4.   结论

版纳微型猪近交系皮肤和人皮肤的组织学形态和细胞构成相似，但厚度稍有差异，应尽量选择皮肤较薄的部位皮肤开展试验。水杨酸溶液、双氯酚酸二乙胺乳膏以及利多卡因凝胶贴膏在2种皮肤中的渗透性相似，表明版纳微型猪近交系皮肤可作为人皮肤的替代品，用于镇痛类经皮吸收药物的体外渗透性评估。本研究为版纳微型猪近交系用于镇痛类经皮吸收药物评估提供了理论依据。