铝是地壳中含量最丰富的金属元素，大部分以氧化铝和硅酸铝的形式存在，对牧草的生长不构成伤害，但当土壤 pH 值低于 5.5 时，土壤中的铝会被活化为离子态，在牧草根系周围富集，成为限制牧草生长的重要因子^[1-3]，影响牧草对营养元素的吸收、利用及代谢，导致牧草减产^[4-5]。有学者研究了酸、铝胁迫对牧草种子萌发和幼苗生长等生理特性的影响^[6-8]。研究表明：铝毒抑制牧草前期的根、茎、叶生长后，后期的花、果实和种子的生殖生长也会受到不同程度的影响，最终使植物地上部分干鲜质量、株高和产量下降，影响牧草种子的质量^[9-10]。铝毒对牧草的危害主要表现为牧草叶片变小、卷曲，叶缘褪绿，根系生长受阻^[11-12]。当土壤交换性铝含量大于2 cmol/kg时， 牧草就会出现铝毒害症状^[13]。近年来，中国南方大部分地区酸性土壤中的铝离子含量均超过2 cmol/kg，有些甚至达到3.15~6.52 cmol/kg^{[3, 14]}，严重影响了牧草的生长与品质，使牧草在南方酸性土壤上的推广种植受到限制。

楚雄南苜蓿(Medicago polymorpha L. ‘Chuxiong’)作为云南省优质的地方豆科牧草品种，可以在酸性土壤中快速生长，是近年来中国通过审定登记的一年生豆科牧草品种之一，在楚雄州禄丰市已推广种植超过60年，可以在冬春缺草季节为牲畜提供营养价值较高的青绿饲草，有效缓解了冬春蛋白饲草供应不足的问题。有研究表明：楚雄南苜蓿具有产量和营养价值高、易于栽培和管理等特点，可以为家畜提供优质的蛋白质饲料，值得在热区大力推广种植^[15]，对推动中国南方畜牧业的发展具有巨大的潜力。目前对楚雄南苜蓿的研究主要集中于其种子产量、 生长特性和高产栽培等方面^[16-17]，对其在酸性土壤中的推广利用研究较少，因此，本研究在酸性条件(pH=5)和不同铝质量浓度胁迫下，分析楚雄南苜蓿种子萌发及幼苗生长的生理响应特性，以期为楚雄南苜蓿在酸性土壤中的推广种植提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

供试种子为楚雄南苜蓿，由云南省草地动物科学研究院提供。

采用0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、六水氯化铝和Hoagland营养液^[18]配制不同铝离子(Al³⁺)质量浓度的处理液，用于种子的胁迫处理。

1.2   试验方法

1.2.1   种子萌发试验

挑选颗粒均一且饱满的楚雄南苜蓿种子，先用75%乙醇消毒5 min，再用蒸馏水反复冲洗干净备用。分别用Al³⁺质量浓度为0 (对照)、100、300、500、700和1000 mg/L的Hoagland营养液浸种12 h，然后将种子转移到铺有2层滤纸的干净培养皿中，每个处理滴加等量加有不同Al³⁺质量浓度的混合营养液，保持基质湿润并调节pH值为5。将培养皿置于温度25 ℃、昼16 h/夜8 h的光照培养箱中培养。每个处理5次重复，每个重复30粒种子。

1.2.2   指标测定

(1)种子萌发指标

每天观察种子发芽及幼苗生长情况，记录发芽种子数，发芽率按10 d计算。发芽率(GR)和发芽势 (GP)的计算公式为^[19]：GR=∑Gt/T×100%； GP=∑Gt′/T×100%。式中：Gt为10 d内的发芽数；T为供试种子数；Gt′为前 4 d 内的发芽数。

(2)幼苗生长指标

根鲜质量和根长的测定：发芽第15天，从每个培养皿中随机挑选10株幼苗进行测量和称量，并计算平均值。相对含水量的测定采用称重法^[20]。根系体积的测定采用排水法^[21]。

(3)幼苗生理指标

发芽第15天，从每个培养皿中随机选取长势一致的植株测量其各生理指标。可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定^[22]；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定^[23]；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定^[24]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定^[25]，过氧化氢酶(CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定^[26]，超氧化物歧化酶(SOD)活性按照WEN等^[27]的方法测定。

1.3   数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理和作图；采用SPSS 19.0进行方差分析和Duncan’s多重比较。

2.   结果与分析

2.1   不同铝胁迫对楚雄南苜蓿种子萌发及根系生长的影响

由表1可知：随着Al³⁺质量浓度的增加，楚雄南苜蓿的发芽率和发芽势逐渐下降，且Al³⁺质量浓度为0~500 mg/L时，各处理间的发芽率和发芽势差异不显著(P>0.05)；当Al³⁺质量浓度达到700 mg/L时，发芽率和发芽势显著下降(P<0.05)，种子发芽受到明显抑制。根鲜质量、根长和根系含水量随Al³⁺质量浓度的增加呈先增大后减小的趋势，且Al³⁺质量浓度为100 mg/L时，根鲜质量和根长显著高于其他处理 (P<0.05)；Al³⁺质量浓度为500 mg/L时，根系含水量显著高于其他处理(P<0.05)。根系体积随着Al³⁺质量浓度的升高而降低，且均显著低于对照处理(P<0.05)。可见，在铝胁迫下，楚雄南苜蓿根系保持较高的含水量以维持细胞的正常生理活性，低质量浓度Al³⁺对楚雄南苜蓿幼苗根系生长具有促进作用，但是当Al³⁺质量浓度达到300 mg/L时，对根系生长出现明显的抑制作用。

表  1  不同铝胁迫对种子萌发及根系生长的影响

Table  1.  Effects of aluminum stress on the seed germination and root growth

ρAl3+$ {/} $ (mg·L−1)	发芽率/% germination rate	发芽势/% germination vigor	根鲜质量/g root fresh weight	根长/cm root length	根系含水量/g root water content	根系体积/cm3 root volume
0 (CK)	57.33±0.08 a	57.33±0.08 a	0.12±0.02 b	6.13±1.15 b	0.22±0.07 c	0.30±0.03 a
100	54.67±0.04 a	53.33±0.04 a	0.15±0.02 a	7.22±0.56 a	0.30±0.14 b	0.24±0.02 b
300	53.33±0.01 a	53.33±0.01 a	0.10±0.02 c	5.05±1.00 b	0.34±0.03 b	0.16±0.02 c
500	55.00±0.01 a	50.00±0.01 a	0.05±0.01 c	2.55±0.48 c	0.41±0.06 a	0.14±0.02 c
700	33.33±0.02 b	33.33±0.02 b	0.03±0.01 c	1.49±0.43 c	0.28±0.10 c	0.12±0.02 c
1000	22.00±0.01 c	21.33±0.01 c	0.04±0.01 c	1.38±0.16 c	0.26±0.05 c	0.10±0.00 c
注：同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

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2.2   不同铝胁迫对楚雄南苜蓿幼苗渗透调节系统的影响

由图1可知：随着Al³⁺质量浓度的增加，楚雄南苜蓿幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量均呈先降低后升高的趋势。当Al³⁺质量浓度为300 mg/L时，脯氨酸和可溶性糖含量最低，分别为64.918 U/mL和5.96 mg/g，均显著低于对照处理(P<0.05)；随着Al³⁺质量浓度的增加，这2种物质的含量明显上升，当Al³⁺质量浓度达到1000 mg/L时，这2种物质的含量显著高于对照处理(P<0.05)。说明楚雄南苜蓿耐受一定程度的铝胁迫，在铝胁迫下会主动积累脯氨酸和可溶性糖以维持细胞的渗透平衡，从而减轻铝胁迫对其幼苗的伤害。

图  1  不同铝胁迫对楚雄南苜蓿幼苗渗透调节系统的影响

注：不同小写字母表示各处理间差异显著(P＜0.05)；下同。

Figure  1.  Effects of different aluminum stress on the osmotic regulation system of seedlings in Medicago polymorpha L. ‘Chuxiong’

Note: Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05); the same as below.

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2.3   不同铝胁迫对楚雄南苜蓿丙二醛含量的影响

由图2可知：随着Al³⁺质量浓度的增加，楚雄南苜蓿叶片中的丙二醛含量呈先降低后增加的趋势。当Al³⁺质量浓度为300 mg/L时，丙二醛含量最低(10.382 nmol/g)，且显著低于对照处理(P<0.05)，说明低质量浓度的铝胁迫对楚雄南苜蓿的生长有促进作用；当Al³⁺质量浓度达到700 mg/L时，丙二醛含量迅速上升，此时细胞膜受损严重，说明该质量浓度对楚雄南苜蓿产生了严重的毒害作用。

图  2  不同铝胁迫对楚雄南苜蓿幼苗丙二醛含量的影响

Figure  2.  Effects of different aluminum stress on the malondialdehyde content in M. polymorpha L. ‘Chuxiong’

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2.4   不同铝胁迫对楚雄南苜蓿幼苗活性氧系统的影响

由图3可知：随着Al³⁺质量浓度的升高，楚雄南苜蓿叶片中的SOD和POD活性均呈降低—升高—降低的变化趋势，且在Al³⁺质量浓度为500 mg/L时活性最强；当Al³⁺质量浓度为300~500 mg/L时，SOD和POD的活性均高于对照处理，说明一定程度的铝胁迫可诱导楚雄南苜蓿叶片中SOD和POD活性增强以缓解胁迫伤害。CAT活性随着Al³⁺质量浓度的增加呈下降的趋势，且均显著低于对照处理(P<0.05)，说明铝胁迫会导致楚雄南苜蓿叶片中的CAT活性下降，且胁迫的质量浓度越大，活性越低。

图  3  不同铝胁迫对楚雄南苜蓿幼苗活性氧系统的影响

Figure  3.  Effects of different aluminum stress on the reactive oxygen species system of seedlings in M. polymorpha L. ‘Chuxiong’

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3.   讨论

随着中国南方畜牧业的快速发展，对豆科牧草的需求越来越大，苜蓿作为优质的豆科牧草在畜牧业中有着重要的地位，但由于中国南方土壤多偏酸性，土壤中的铝毒害影响了苜蓿等豆科牧草的正常生长发育。为解决这一问题，大量学者对苜蓿的耐铝毒性进行了研究，发现多数苜蓿属于铝毒敏感植物^[28]，高于100 mg/L的Al³⁺处理就能明显降低苜蓿种子的发芽数量、速度和质量, 抑制幼苗生长^[29]。在本研究中，Al³⁺质量浓度为100 mg/L时，楚雄南苜蓿根鲜质量和根长均显著高于对照处理(P<0.05)，而根系体积则随着Al³⁺质量浓度的增加而减小；当Al³⁺质量浓度达到300 mg/L时，楚雄南苜蓿的根鲜质量和根长受到抑制，说明低质量浓度铝对楚雄南苜蓿幼苗的生长有一定的促进作用，高质量浓度则有抑制作用，这与杨丹娜等^[30]的研究结果一致。本研究表明：Al³⁺质量浓度为100~1000 mg/L时，楚雄南苜蓿的根系含水量均高于对照，说明铝胁迫下楚雄南苜蓿幼苗会促进根系对水分的吸收，维持体内的正常代谢，这与孙艳等^[31]的研究结果一致。随着Al³⁺质量浓度的增加，楚雄南苜蓿的发芽率及发芽势逐渐下降，当Al³⁺质量浓度达到700 mg/L时，发芽率和发芽势显著下降(P<0.05)，这与汤霞等^[32]的研究结果一致。在本研究中，未经过铝胁迫处理的楚雄南苜蓿发芽率仅为57%，与紫花苜蓿^[33-34]相比，其发芽率和发芽势较低，这可能是由于楚雄南苜蓿种子的硬实程度较高，因此，研究如何破除其休眠和提高其发芽率，将有助于楚雄南苜蓿的推广利用。

本研究中，随着Al³⁺质量浓度的增加，楚雄南苜蓿幼苗的丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量均呈先降低后升高的趋势，这与胡蕾等^[35]的研究结果一致。当Al³⁺质量浓度为100~500 mg/L时，楚雄南苜蓿幼苗中的丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量均低于对照，说明中低质量浓度(100~500 mg/L)的铝有助于楚雄南苜蓿细胞膜保持稳定，防止膜脂过氧化，减少对植物的伤害。前人对紫花苜蓿等豆科牧草的研究表明：Al³⁺质量浓度达到120 mg/L时，豆科牧草的丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量开始升高，这些有渗透调节作用的物质在植株体内大量积累，可减缓铝毒对植株的危害^{[29, 36]}；而楚雄南苜蓿幼苗中的丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量在Al³⁺质量浓度达到700 mg/L时才逐渐升高，这说明楚雄南苜蓿相较于紫花苜蓿等豆科牧草具有更好的耐铝能力。受到高质量浓度铝胁迫(700~1000 mg/L)时，楚雄南苜蓿可通过增加体内的渗透调节物质来抵御或降低铝胁迫伤害^[37]，在酸铝土壤上有很大的利用前景。本研究对楚雄南苜蓿及其他豆科植物缓解铝胁迫的生理及分子机制具有一定的参考价值。

植物抗氧化酶活性的维持和提高是植物在铝胁迫下抵御逆境伤害机制的体现^[38]。在本研究中，不同Al³⁺质量浓度胁迫对楚雄南苜蓿的抗氧化系统产生了不同的影响，其中SOD和POD的活性随着Al³⁺质量浓度(100~1 000 mg/L)的升高而呈先增加后降低的变化趋势，这与彭艳等^[39]的研究结果一致，说明楚雄南苜蓿在受到中低质量浓度铝胁迫时(100~500 mg/L)，体内的POD和SOD能及时响应铝毒害，使保护酶的活性维持在较高水平，从而提高其耐铝毒能力；当Al³⁺质量浓度达到700 mg/L时，SOD和POD的活性下降，表明高质量浓度的铝胁迫会使植物体内的抗氧化酶活性下降^[40]。楚雄南苜蓿幼苗叶片的CAT活性随着Al³⁺质量浓度的升高呈逐渐下降的变化趋势，这与 CAKMAK等^[41]和向前^[42]的研究结果一致，推测铝胁迫下楚雄南苜蓿叶片的 CAT 活性受到铝毒的伤害最大。

4.   结论

楚雄南苜蓿具有较强的耐铝毒能力，适当的Al³⁺质量浓度(100 mg/L)可促进其根系生长；而随着Al³⁺质量浓度的升高，其体内合成大量渗透调节物质，POD和SOD活性也随之增强，从而抵御铝毒的伤害；当Al³⁺质量浓度超过700 mg/L时，其生长受到严重抑制。因此，楚雄南苜蓿适宜在Al³⁺质量浓度低于700 mg/L的酸性土壤中推广种植。