抑制蛋白是多功能适配蛋白，具有调节G蛋白偶联受体信号转导的功能。G蛋白偶联受体是一个大家族信号分子，能对各种细胞外刺激做出反应。抑制蛋白最开始是作为调节G蛋白偶联受体(GPCRs)活性两步机制的一部分被发现^[1-3]。为了阻止GPCR激活异源三聚体G蛋白的反应，通过一类丝氨酸/苏氨酸激酶使G蛋白偶联受体激酶(GRKs)磷酸化。然后磷酸化的GRK激活受体结合到抑制蛋白上，阻碍G蛋白介导的信号途径和目标受体的内化。除了G蛋白偶联受体，抑制蛋白还能与其他类细胞表面受体和多种其他信号转导蛋白结合^[4]。

抑制蛋白可分为α-抑制蛋白(aArrs)、β抑制蛋白(bArrs)和视觉抑制蛋白(vArrs)。哺乳动物有6个α-抑制蛋白，分别命名为抑制蛋白结构域蛋白1至5 (ARRDC1~5)和硫氧还蛋白互作蛋白或维生素D上调蛋白1 (TXNIP或VDUP1)。不同的抑制蛋白，如视觉抑制蛋白(或抑制蛋白1)、β-抑制蛋白1 (或抑制蛋白2)和β-抑制蛋白2 (或抑制蛋白3)可以通过多种方式降低他们的靶蛋白GPCR的活性。一个哺乳动物的α-抑制蛋白可以介导一个激活的质膜受体的泛素化和溶酶体运输^[5]。α-抑制蛋白也参与胞吞运输且能与β抑制蛋白结合，从而依据细胞的生理环境和外部信号维持细胞表面蛋白的互补和功能优势^[6]。

ARRDC1是微泡出芽的重要介质，其C端结构域的2个高度保守的PPxY基序是依赖PPxY的逆转录病毒出芽过程所必需的^[7]。ARRDC1泛素化修饰也是ARMM释放的必要条件^[8]。但是ARRDC5的功能尚不清楚。通过哺乳动物G蛋白偶联受体进行的内吞膜运输调控特异性和可塑性高。这些结果对G蛋白偶联受体的药理学研究奠定了重要基础，并为以G蛋白偶联受体为导向的药物治疗新机制的开发提供研究思路^[9]。作为G蛋白偶联受体的重要调节因子，对抑制蛋白功能机制的研究具有相当大的理论意义。

版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI)是利用云南地方品种滇南小耳猪培育成功的大型哺乳动物近交系，是云南省宝贵的遗传资源，可为功能基因研究、人类异种器官移植等众多领域提供实验材料和器官供体，具有重要的研究应用价值^[10-12]，前期研究发现BMI公猪部分不育^[13-14]。因此，其雄性不育方面的基础研究是亟待开展的重要研究方向。前期我们通过荧光定量PCR方法发现ARRDC5基因mRNA在版纳微型猪近交系睾丸、甲状腺和胸腺中特异表达，且在睾丸中的表达量显著高于甲状腺和胸腺，提示该基因可能在BMI公猪繁殖力方面发挥功能^[15]。本研究的目的是从版纳微型猪近交系中克隆出ARRDC5基因全长编码序列，并对其克隆、测序和连接；利用DNA重组技术得到真核表达载体，并将其转染ST细胞，得到表达荧光的细胞，证明了该真核表达载体的可应用性；最后再对表达荧光的细胞进行细胞核和线粒体荧光染色，确定其在真核细胞内的表达位置，为猪ARRDC5基因在BMI公猪繁殖力方面的功能研究奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验动物版纳微型猪近交系来自云南省昆明市版纳微型猪近交系原种场，于10月龄活体去势取睾丸，液氮速冻带回实验室，转移至−80 ℃冰箱备用。

1.2   总RNA提取和反转录

液氮速冻研钵后，取100 mg冻存的组织样品放在研钵中，期间不断加液氮，使样品一直处于冷冻状态并迅速研磨成粉，用RNAiso Plus (TaKaRa，中国大连)法提取组织的总RNA。检测睾丸总RNA完整性后，采用第1链cDNA合成试剂盒PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis (TaKaRa，中国大连)将睾丸组织的总RNA反转录为第1链cDNA，放置于−20 ℃冰箱备用。

1.3   PCR引物

根据NCBI已公布的黄牛(NM_001128508.2)和人(NM_001080523.1)等物种的ARRDC5 mRNA序列，结合猪EST序列(CX061584和BI343733)，利用Lasergene软件电子克隆猪ARRDC5基因序列，再结合真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点信息，利用Primer Premier 6.0和Oligo 7软件设计特异性引物，由昆明硕擎生物科技有限公司合成，预计扩增出1 045 bp的片段，引物序列如下：上游引物F为5′- CTCGAGCCATGTCTGTGGTGAAGTCGAT-3′，含XhoⅠ酶切位点和ARRDC5基因编码区5′端部分序列；下游引物R为5′- GAATTCAGAGTCTGATAAAGCTTTTAATA-3′，含EcoRⅠ酶切位点和ARRDC5基因编码区3’端部分序列。

1.4   猪ARRDC5基因cDNA的克隆

从−20 ℃冰箱中取出睾丸组织cDNA母液，稀释成50 ng/µL，作为模板，利用ExTaq酶(TaKaRa，中国大连)扩增猪ARRDC5编码区全序列，PCR反应程序参照Ex Taq聚合酶 50 µL标准体系进行。单一扩增条带的PCR扩增产物经胶回收后用TA法克隆到pEASY-T5-ZERO (全式金)中，构建pEASY-T5-ZERO-ARRDC5质粒，并进行质粒PCR、双酶切和测序鉴定。

1.5   序列确定和数据分析

使用DNAStar软件中的SeqMan程序组装测序结果。利用DNAStar软件中的EditSeq程序对拼接的cDNA序列进行CDS预测，并推导出氨基酸序列。分别使用ProtParam、PSortII、TMHMM 2.0和SignalP 4.1预测蛋白的一级结构信息、亚细胞定位、跨膜螺旋和信号肽。NCBI上搜索得到牛和人等ARRDC5氨基酸序列，利用DNAStar软件中的MegAlign程序将BMI、牛和人的ARRDC5的氨基酸序列进行多物种完全比对，参数取默认值，计算序列相似度并输出以BMI序列为参考标准的氨基酸序列比对结果，最后利用GeneDoc软件打开和输出氨基酸比对结果。

1.6   真核表达重组载体的构建

pEASY-T5-ZERO-ARRDC5和pEGFP-C1均使用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切。酶切体系为50 μL：pEASY-T5-ZERO-ARRDC5或pEGFP-C1 5 μg，内切酶各5 μL，10×Q. Cut buffer 5 μL，加去离子水补足50 μL，37 ℃消化1 h。将酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶回收纯化后，16 ℃连接18 h后转化大肠杆菌感受态DH5α (TaKaRa, 大连, 中国)。复苏、培养和鉴定按常规方法进行。经质粒PCR、双酶切和测序鉴定，均正确的命名为：pEGFP-C1-ARRDC5。

1.7   猪ARRDC5的亚细胞定位

按无内毒素质粒大提试剂盒(DP117，北京天根生化科技有限公司)说明书提取无内毒素质粒pEGFP-C1-ARRDC5和pEGFP-C1。ST细胞用含10%胎牛血清(Gibco, USA)的DMEM培养液培养，传代，细胞汇合率达50%时，用脂质体2000 (Invitrogen, USA)转染ST细胞，转染24 h后于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。观察到绿色荧光后，用PBS溶液清洗细胞3次，每孔加入1 mL Mito Tracker染色液(250 mmol/L)，37 ℃、5% CO₂培养箱中染色30 min，弃染色液；PBS溶液再清洗细胞3次，每孔加入1 mL Hoechst33342染色液(250 mmol/L)，37 ℃、5% CO₂培养箱中染色30 min，弃染色液；PBS溶液再清洗细胞3次，加入2 mL细胞培养基于倒置荧光显微镜下观察拍照，线粒体被染成红色，细胞核被染成蓝色，目的蛋白为绿色。

2.   结果与分析

2.1   猪ARRDC5基因RT-PCR结果

以提取的BMI睾丸总RNA反转录后得到的cDNA为模板，经PCR扩增得到大小为1 045 bp长的片段(已包括1 014 bp的CDS区)，结果与预期相符(图1)。

图  1  ARRDC5基因扩增结果

注：M. DL 2 000 分子量标准；1. ARRDC5 PCR产物。

Figure  1.  The result of ARRDC5 gene amplification

Note: M. DL 2 000 Marker; 1. ARRDC5 PCR product.

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2.2   猪ARRDC5基因序列及对应的氨基酸序列分析

BMI ARRDC5完整编码区长1 014 bp，包括起始密码子ATG和终止密码子TAA，编码337个氨基酸，序列已提交NCBI GenBank数据库，获得核酸登录号为KF589203，其对应的蛋白质登录号为AHB08949。生物信息学分析表明：ARRDC5蛋白质分子量(Mw)为37.5 ku，等电点(pI)为7.08，存在Arrestin-N和Arrestin-C两个保守结构域(图2)，无信号肽和跨膜螺旋，与牛(NP_001121980)和人(NP_001073992.1) ARRDC5蛋白的同源性高达85.7%和82% (图2)。

图  2  版纳微型猪近交系ARRDC5与牛、人ARRDC5氨基酸序列同源性分析

注：单下划线表示Arrestin-N保守结构域，双下划线表示Arrestin-C结构域。

Figure  2.  Alignment of the amino acids sequences of BMI ARRDC5 and those of cattle and human

Note: Single underline represents the Arrestin-N conserved domain, the double underline indicates the Arrestin-C conserved domain.

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2.3   BMI ARRDC5蛋白亚细胞定位预测

将BMI ARRDC5蛋白序列提交到PSORT II程序，亚细胞定位预测表明：ARRDC5蛋白在细胞质、线粒体、细胞核、内质网和细胞骨架中的可能性分别为52.2%、21.7%、8.7%、4.3%和4.3%，说明其主要在细胞核外表达。

2.4   重组质粒的鉴定

以质粒为模板利用特异性引物F/R扩增的片段经电泳检测，结果与预期相符，为1 045 bp；用XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶对提取的pEASY-T5-ZERO-ARRDC5和pEGFP-C1-ARRDC5质粒进行双酶切，也与预期结果相吻合，电泳条带分别为3 961/1 039 bp和4 700/1 039 bp；表明克隆质粒pEASY-T5-ZERO-ARRDC5和真核表达质粒pEGFP-C1-ARRDC5构建成功（图3）。

图  3  pEASY-T5-ZERO-ARRDC5 (a)和pEGFP-C1-ARRDC5 (b)重组质粒的鉴定

注：M. DL 2 000；1和4. 质粒PCR；2. pEASY-T5-ZERO-ARRDC5质粒；3. Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切pEASY-T5-ZERO-ARRDC5产物；5. pEGFP-C1-ARRDC5质粒；6. Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切pEGFP-C1-ARRDC5产物。

Figure  3.  Identification of the pEASY-T5-ZERO-ARRDC5 (a) and pEGFP-C1-ARRDC5 (b) recombinant plasmids

Note: M. Marker-DL 2 000; 1 and 4. products for ARRDC5 plasmid PCR; 2. pEASY-T5-ZERO-ARRDC5 plasmid; 3. The double-enzyme digestion product of pEASY-T5-ZERO-ARRDC5 by Xho Ⅰ and EcoR Ⅰ; 5. pEGFP-C1-ARRDC5 plasmid; 6. the double-enzyme digestion product of pEGFP-C1-ARRDC5 by Xho Ⅰ and EcoR Ⅰ.

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2.5   猪ARRDC5绿色荧光蛋白真核融合表达载体在ST细胞中的表达

分别用pEGFP-C1-ARRDC5和pEGFP-C1对照质粒转染猪睾丸ST细胞，瞬时表达。在表达24 h后，可见到绿色荧光。之后，将细胞进行Mito Tracker Red CMXRos (染线粒体)和Hoechst33342 (染细胞核)染色，在倒置荧光显微镜下观察。如图4所示：ST细胞中，转染有pEGFP-C1对照质粒的，绿色荧光在细胞中均匀分布，因为绿色荧光蛋白在ST细胞中的表达没有定向性，其广泛分布于整个细胞核和细胞质中。而转染了pEGFP-C1-ARRDC5质粒的ST细胞中，绿色荧光主要集中在细胞质中，部分细胞核中也有荧光(图5)。为进一步分析ARRDC5蛋白在细胞中的定位，我们利用软件将同一视野下的绿色荧光和红色荧光进行叠加、绿色荧光和蓝色荧光进行叠加(图5)，可以看出绿色荧光与红色荧光重合，说明ARRDC5基因在真核生物中的表达产物主要定位于细胞质的线粒体中；部分细胞中的绿色荧光和蓝色荧光重合，表明ARRDC5蛋白也在细胞核中表达(图5)。

图  4  EGFP蛋白在ST细胞中的亚细胞定位

Figure  4.  The subcellular location of EGFP protein in ST cells

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图  5  ARRDC5蛋白在ST细胞中的亚细胞定位

Figure  5.  The subcellular location of ARRDC5 protein in ST cells

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3.   讨论

ARRDC5属于抑制蛋白基因家族，人ARRDC5基因定位于19号染色体，但是对其功能的研究较少。本研究首次根据牛和人的ARRDC5 mRNA序列以及猪EST序列，利用同源比对技术成功拼接了猪的ARRDC5 cDNA序列；然后以版纳微型猪近交系为材料通过RT-PCR技术进一步扩增出该基因进行验证。获得的猪ARRDC5基因CDS区长1 014 bp，编码377个氨基酸，与GenBank中牛和人ARRDC5氨基酸序列的同源性为85.7%和82%，相似性较高，说明该基因在物种间有较高的保守性。此外，试验克隆的猪ARRDC5基因编码区序列和拼接的猪ARRDC5基因编码区序列长度一致。猪ARRDC5蛋白包含两个保守结构域(Arrestin N 和Arrestin C)。所有抑制蛋白家族成员都具有Arrestin C结构域，它是Arrestin N结构域的一个拷贝，是一种类免疫球蛋白的beta三明治折叠结构，在激活抑制蛋白家族成员过程中起重要作用^[16-17]。

目前针对猪ARRDC5基因的生物学功能尚未见报道，但猪ARRDC5基因是一个具有明显组织表达特异的基因，仅在睾丸、甲状腺和胸腺中表达，且在睾丸中的表达量显著高于其他两种组织^[15]。表达有限性说明对该基因开展深入细致的研究是有必要的。细胞是动物个体的结构和功能单位，具有复杂的亚细胞结构，目前已发现动物细胞中的细胞器主要包括：线粒体、内质网、中心体，高尔基体和核糖体等，它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常地工作、运转。每种细胞器含有一组特定的蛋白，具有特定的功能，如内质网是细胞内除核酸以外的一系列重要生物大分子，是蛋白质、脂类和糖类合成的基地；线粒体是有氧呼吸的主要场所；核糖体是蛋白质合成的分子机器；溶酶体含有多种水解酶，可以消化细胞内的异物及衰老无用的细胞器碎片。由于蛋白质的亚细胞定位与其功能密切相关，所以可以从蛋白质的定位角度探索猪ARRDC5的生物学功能。

本研究使用的真核表达载体为pEGFP-C1，该载体带有CMV启动子和增强型绿色荧光蛋白EGFP，是细胞荧光蛋白报告载体。多克隆位点位于EGFP之后，目的基因借助于酶切位点插入多克隆位点，故目的基因ARRDC5在EGFP下游；当基因进行转录和翻译时，表达产物为EGFP和目的基因表达蛋白的融合体^[18]。EGFP是GFP的突变体，最大激发峰在490 nm，具有分子量小、荧光强度大、检测灵敏、无细胞毒性和可活体跟踪观察等特征，利用其荧光表达情况可进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究^[19]。本研究构建含有EGFP标签的重组质粒pEGFP-C1-ARRDC5，通过脂质体2000介导转染宿主细胞猪睾丸细胞系ST，实现瞬时表达，初步研究ARRDC5在细胞中的定位情况。荧光倒置显微镜下发现转染空载体pEGFP-C1的整个细胞可见绿色荧光，核内外荧光强度差别不明显；转染ARRDC5融合表达质粒的细胞中绿色荧光主要分布于细胞质，少部分在细胞核，核内外荧光强度有差别。猪ARRDC5蛋白在ST细胞中定位结果与PSORT软件的预测结果基本一致，这揭示ARRDC5主要在细胞质中发挥功能。

4.   结论

本研究首先电子克隆猪ARRDC5基因，接着采用RT-PCR分离了其CDS区，采用基因重组法构建了猪ARRDC5与绿色荧光蛋白的融合表达载体，并进行了体外表达，初步确定猪ARRDC5基因表达产物主要定位于猪睾丸细胞ST的细胞质中，少部分定位于细胞核中，为进一步研究其在细胞内的作用机制和生物学功能提供了重要依据。