砂姜黑土区周年麦玉轮作沼液替代对土壤养分及重金属积累的影响
Effects of Biogas Slurry Replacement on Soil Nutrients and Heavy Metal Accumulation in Annual Wheat-maize Rotation in Shajiang Black Soil Area
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Keywords:
- annual wheat-maize rotation /
- biogas slurry /
- heavy metal /
- nutrient content
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中药高良姜为姜科(Zingiberacea)山姜属(Alpinia Roxb.)植物高良姜 (Alpinia officinarum Hance) 的干燥根茎，始记载于《名医别录》[1]，又名高凉姜 [2]。现主要分布于海南、广东和广西等省区[3]。高良姜性辛、热，归脾、胃经，具有散寒止痛、温胃止呕等功效[4]。现代药理学研究表明：高良姜具有神经保护[5]、抗炎[6]、抗菌[7]、抗胃肠道疾病[8]、抗肿瘤[9]和抗氧化[10]等作用，主要含有二苯基庚烷类[11]、黄酮类[12]和挥发油[13]等化学成分。高良姜用途广泛且资源丰富，其发挥作用的物质基础具有巨大的研究开发潜力。本课题组长期致力于研究开发天然来源的神经保护剂[14-15]，前期研究发现高良姜的乙醇提取物对H2O2损伤SH-SY5Y细胞具有较好的神经保护作用。为了揭示高良姜的神经保护活性成分，本研究对高良姜的化学成分进行研究，以期在明晰化合物的基础上评价其神经保护作用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
高良姜根茎于2021年3月购自云南省昆明市药材市场，由云南中医药大学张荣平教授鉴定，标本(No. 2021-0317)储藏于云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室。
1.2 主要仪器、设备和试剂
Bruker AV-600 MHz、AV-400 MHz超导核磁共振波谱仪(德国Bruke公司)；Agilent1290 UPLC/6545 Q-TOF质谱仪(安捷伦科技有限公司)；NS4205制备型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限科技)；Basic C18柱(填料粒径5 μm，直径10 mm，长250 mm，北京赛谱锐思科技有限公司)；GF254薄层色谱板(青岛海洋化工有限公司)；MCI CHP-20P GEL (日本三菱化学公司)；Sephadex LH20 (Pharmacia公司)。DMEM/F12培养基(北京伊诺凯有限公司)；FBS胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司)；CCK8试剂盒(上海泰坦科技股份有限公司)。色谱级甲醇和乙腈购自安徽泽升科技有限公司，其余试剂由工业级试剂重蒸制得。
1.3 试验方法
1.3.1 提取与分离
取高良姜干燥根茎20.0 kg粉碎，在室温下用70%乙醇冷浸提取3次，每次提取7 d、100 L。合并提取液，减压浓缩至小体积，分散于等体积水中，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到乙酸乙酯部分和水部分。将乙酸乙酯部分 (960.0 g)进行硅胶柱层析，以石油醚—丙酮 (98∶2、95∶5、90∶10、80∶20和70∶30，V/V) 进行梯度洗脱，得到Fr.1~Fr.4。
Fr.1 (61.0 g) 进行硅胶柱层析，以石油醚—乙酸乙酯 (98∶2→90∶1，V/V) 进行梯度洗脱得到Fr.1-1~Fr.1-2。Fr.1-2 (10.0 g) 通过凝胶柱色谱和制备薄层色谱分离得到化合物12 (5.0 mg)、14 (7.0 mg) 和22 (10.0 mg)。
Fr.2 (142.0 g) 经硅胶柱色谱，以石油醚—乙酸乙酯 (95∶5→80∶20，V/V) 梯度洗脱得到Fr.2-1~Fr.2-3。Fr.2-2 (7.0 g) 通过凝胶柱层析，用甲醇洗脱得到化合物3 (5.1 g)、6 (15.0 mg) 和9 (6.0 mg)。Fr.2-3 (20.0 g) 经MCI柱层析，用甲醇—水 (60∶40→100∶0，V/V) 梯度洗脱得到Fr.2-3-1~Fr.2-3-2。Fr.2-3-1 (300.0 mg) 经制备型液相柱色谱分离得到化合物13 (8.0 mg)、19 (40.0 mg)、20 (7.5 mg) 和21 (5.0 mg)。
Fr.3 (319.0 g) 经硅胶柱色谱，以石油醚—乙酸乙酯 (90:10→70:30，V/V) 梯度洗脱得到Fr.3-1~Fr.3-3 (155.0 g)。Fr.3-1 (201.0 g) 反复重结晶得到化合物1 (55.6 g)、2 (132.6 g) 和10 (3.2 g)；其母液经凝胶柱色谱，用甲醇洗脱得到化合物11 (10.0 mg) 和15 (20.0 mg)。
Fr.4 (202.0 g) 经MCI柱层析，用甲醇—水(30∶70→50∶50，V/V) 梯度洗脱得到Fr.4-1~Fr.4-3。Fr.4-3 (23.0 g) 经RP-18柱，用甲醇—水 (50∶50→70∶30，V/V) 梯度洗脱，得到Fr.4-3-1~Fr.4-3-2。Fr.4-3-1 (10.5 g) 依次经凝胶柱层析、制备薄层色谱板分离得到化合物4 (40.0 mg)、5 (10.0 mg)、7 (15.0 mg) 和8 (8.0 mg)。Fr.4-3-2 (10.5 g) 依次经硅胶柱色谱和凝胶柱色谱得到化合物16 (10.0 mg)、17 (13.1 mg) 和18 (15.2 mg)。
1.3.2 高良姜化学成分的神经保护作用活性筛选
在研究高良姜化学成分的神经保护作用之前，先确定化学成分对神经细胞的毒性，因此，先将各化合物作用于无损伤的神经细胞上，评价其神经细胞毒性。使用CCK-8法评价各成分的神经保护活性。将细胞分为对照组、H2O2组和样品组，其中对照组分为空白对照组和溶剂对照组[ 没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)]，样品组分为样品A组(用于评价化合物的细胞毒性)和样品B组(用于评价化合物的神经保护作用)。样品A组：只加不同浓度样品，不加H2O2；样品B组：先加不同浓度样品，再加H2O2。选择增殖活跃并处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1×104 mL−1的密度接种于96孔细胞培养板上。对照组为正常培养的SH-SY5Y细胞；H2O2组细胞正常培养24 h后，弃去旧培养基，用300 μmol/L H2O2处理24 h；样品A组用低、中、高 (5、10和20 μmol/L)浓度的药物处理2 h；样品B组用低、中、高(5、10和20 μmol/L)浓度的药物预处理2 h后，再用300 μmol/L H2O2处理24 h。之后将各组细胞培养基更换为孔中含有10% CCK-8的DMEM。孵育2 h后，使用酶标仪在450 nm处读取每个孔的吸光度值(A)，计算各组细胞存活率：细胞存活率=(A样品组−A空白对照组)/(A溶剂对照组−A空白对照组)×100%。试验重复3次。
2. 结果与分析
2.1 化合物结构鉴定
从高良姜中共分离鉴定了22种化合物，其结构如图1 所示。
化合物1： 黄色粉末， C16H12O6， HR-ESI-MS，m/z 323.0523 [M+Na]+ (计算值 323.0526)。1H NMR (600 MHz, DMSO) δH: 12.43 (1H, s, 5-OH), 10.79 (1H, s, 7-OH), 9.50 (1H, s, 3-OH), 8.11 (2H, d, J = 4.5 Hz, H-2′/H-6′), 7.07 (2H, d, J = 4.9 Hz, H-3′/H-5′), 6.44 (1H, s, H-8), 6.18 (1H, s, H-6), 3.82 (3H, s, 4′-OCH3) . 13C NMR (150 MHz, DMSO) δC: 146.3 (s, C-2), 136.1 (s, C-3), 176.0 (s, C-4), 156.3 (s, C-5), 98.3 (d, C-6), 164.0 (s, C-7), 93.6 (d, C-8), 160.7 (s, C-9), 103.1 (s, C-10), 123.3 (s, C-1′), 129.4 (d, C-2′), 114.1 (d, C-3′), 160.5 (s, C-4′), 114.1 (d, C-5′), 129.4 (d, C-6′) , 55.4 (q, 4′-OCH3)。以上波谱数据与文献[16]基本一致，故鉴定该化合物为山柰素-4′-甲醚。
化合物2： 黄色粉末， C15H10O5， HR-ESI-MS，m/z 271.0639 [M+H]+ (计算值 271.0601)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 8.18 (2H, m, H-2′/H-6′), 7.49 (2H, dd, J = 8.4, 6.8 Hz, H-3′/H-5′), 7.44 (1H, m, H-4′), 6.40 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 146.9 (s, C-2), 138.5 (s, C-3), 177.7 (s, C-4), 162.6 (s, C-5), 99.4 (d, C-6), 165.9 (s, C-7), 94.5 (d, C-8), 158.4 (s, C-9), 104.7 (s, C-10), 132.6 (s, C-1′), 129.4 (d, C-2′), 128.7 (d, C-3′), 130.9 (d, C-4′), 128.7 (d, C-5′), 129.4 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为高良姜素。
化合物3： 黄色粉末， C15H10O6，HR-ESI-MS，m/z 287.0554 [M+H]+ (计算值287.0550)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 8.09 (2H, m, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, m, H-3′/H-5′), 6.39 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 148.0 (s, C-2), 137.1 (s, C-3), 177.4 (s, C-4), 162.5 (s, C-5), 99.3 (d, C-6), 165.6 (s, C-7), 94.5 (d, C-8), 158.2 (s, C-9), 104.5 (s, C-10), 123.7 (s, C-1′), 130.7 (d, C-2′), 116.3 (s, C-3′), 160.5 (s, C-4′), 116.3 (d, C-5′), 130.7 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[18]基本一致，故鉴定该化合物为山柰酚。
化合物4： 黄色粉末， C17H16O7，HR-ESI-MS，m/z 353.0614 [M+Na]+ (计算值353.0632)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.64 (1H, dd, J = 8.6, 2.2 Hz, H-6′), 7.60 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2′), 7.07 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 3.94 (3H, s, 4′-OCH3), 3.79 (3H, s, 3-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 157.6 (s, C-2), 139.9 (s, C-3), 180.1 (s, C-4), 163.1 (s, C-5), 99.8 (d, C-6), 166.0 (s, C-7), 94.7 (d, C-8), 158.5 (s, C-9), 105.9 (s, C-10), 124.2 (s, C-1′), 116.2 (d, C-2′), 147.7 (s, C-3′), 151.7 (s, C-4′), 112.4 (d, C-5′), 122.1 (d, C-6′), 60.6 (q, 3-OCH3), 56.4 (q, 4′-OCH3) 。以上波谱数据与文献[19]基本一致，故鉴定该化合物为3,4′-甲氧基-3′,5,7-三羟基黄酮。
化合物5：黄色粉末，C16H12O6, HR-ESI-MS，m/z 299.0598 [M−H]−(计算值299.0561)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 8.00 (2H, d, J = 2.8 Hz, H-2′/H-6′), 6.94 (2H, m, H-3′/H-5′), 6.42 (1H, s, H-8), 6.22 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-6), 3.79 (3H, s, 3′-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 158.5 (s, C-2), 139.5 (s, C-3), 180.0 (s, C-4), 163.1 (s, C-5), 99.8 (d, C-6), 166.0 (s, C-7), 94.8 (d, C-8), 158.5 (s, C-9), 105.9 (s, C-10), 122.6 (s, C-1′), 131.4 (d, C-2′), 116.6 (d, C-3′), 161.7 (s, C-4′), 116.6 (d, C-5′), 131.4 (d, C-6′), 66.7 (q, 3′-OCH3)。以上波谱数据与文献[20]基本一致，故鉴定该化合物为山柰酚-3-甲醚。
化合物6：黄色粉末，C19H22O6，HR-ESI-MS，m/z 369.1297 [M+Na]+ (计算值369.1309)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.06 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2′), 7.01 (1H, dd, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′), 6.17 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 6.09 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 4.90 (1H, m, H-2), 4.21 (1H, m, H-3), 3.89 (6H, s, 3′-OCH3/4′-OCH3), 3.76 (6H, s, 5-OCH3/7-OCH3), 2.87 (2H, m, H-4). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 78.4 (d, C-2), 66.3 (d, C-3), 28.1 (t, C-4), 159.2 (s, C-5), 93.3 (d, C-6), 159.6 (s, C-7), 92.0 (d, C-8), 155.2 (s, C-9), 100.3 (s, C-10), 130.9 (s, C-1′), 112.2 (d, C-2′), 149.0 (s, C-3′), 149.0 (s, C-4′), 109.7 (d, C-5′), 118.6 (d, C-6′), 55.9 (q, 3′-OCH3), 55.3 (q, 5-OCH3/7-OCH3/4′-OCH3)。以上波谱数据与文献[21]基本一致，故鉴定该化合物为5,7,3′,4′-四甲氧基儿茶素。
化合物7：白色粉末，C15H12O6，HR-ESI-MS，m/z 289.0709 [M+H]+ (计算值 289.0707)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.31 (2H, d, J = 2.1 Hz, H-2′/H-6′), 6.80 (2H, m, H-3′/H-5′), 5.88 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-8), 5.83 (1H, s, H-6), 4.93 (1H, m, H-2), 4.48 (1H, d, J = 11.6, 1.4 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 85.3 (d, C-2), 73.9 (d, C-3), 198.8 (s, C-4), 165.6 (s, C-5), 97.6 (d, C-6), 169.1 (s, C-7), 96.6 (d, C-8), 164.9 (s, C-9), 102.1 (s, C-10), 129.6 (s, C-1′), 130.6 (d, C-2′), 116.4 (d, C-3′), 159.5 (s, C-4′), 116.4 (d, C-5′), 130.6 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[22]基本一致，故鉴定该化合物为二氢山柰酚。
化合物8：黄色粉末，C15H12O5, HR-ESI-MS，m/z 271.0716 [M−H]− (计算值271.0612)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.32 (2H, m, H-2′/H-6′), 6.82 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3′/H-5′), 5.88 (2H, s, H-6/H-8), 5.34 (1H, m, H-2), 3.11 (1H, m, H-3a), 2.69 (1H, m, H-3b). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 80.4 (d, C-2), 44.0 (t, C-3), 197.5 (s, C-4), 165.4 (s, C-5), 96.4 (d, C-6), 169.3 (s, C-7), 96.5 (d, C-8), 164.9 (s, C-9), 103.1 (s, C-10), 131.2 (s, C-1′), 129.0 (d, C-2′), 116.3 (d, C-3′), 159.0 (s, C-4′), 116.3 (d, C-5′), 129.0 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[23]基本一致，故鉴定该化合物为柚皮素。
化合物9：白色粉末，C15H12O4, HR-ESI-MS，m/z 255.0721 [M−H]− (计算值255.0663)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.43 (2H, d, J = 6.5 Hz, H-2′/H-6′), 7.38 (3H, m, H-3′/H-4′/H-5′), 6.01 (2H, s, H-6/H-8), 5.38 (1H, d, J = 13.0, 3.0 Hz, H-2), 3.04 (1H, dd, J = 17.2, 13.0 Hz, H-3a), 2.78 (1H, m, H-3b). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 79.2 (d, C-2), 43.4 (t, C-3), 195.8 (s, C-4), 164.3 (s, C-5), 96.9 (d, C-6), 166.2 (s, C-7), 95.8 (d, C-8), 163.2 (s, C-9), 102.9 (s, C-10), 138.5 (s, C-1′), 126.3 (d, C-2′), 128.9 (d, C-3′), 128.9 (d, C-4′), 128.9 (d, C-5′), 126.3 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[24]基本一致，故鉴定该化合物为乔松素。
化合物10：黄色粉末，C15H13O5，HR-ESI-MS，m/z 271.0590 [M−H]− (计算值271.0612)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.53 (2H, m, H-2′/H-6′), 7.41 (3H, m, H-3′/H-4′/H-5′), 5.94 (1H, s, H-8), 5.90 (1H, s, H-6), 5.07 (1H, dd, J = 11.6, 2.0 Hz, H-2), 4.54 (1H, dd, J = 11.5, 1.9 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 85.0 (d, C-2), 73.7 (d, C-3), 197.9 (s, C-4), 164.4 (s, C-5), 96.6 (d, C-6), 169.6 (s, C-7), 97.7 (d, C-8), 165.3 (s, C-9), 101.6 (s, C-10), 138.6 (s, C-1′), 128.9 (d, C-2′), 129.4 (d, C-3′), 129.9 (d, C-4′), 129.4 (d, C-5′), 128.9 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[25]基本一致，故鉴定该化合物为环氧松属素查尔酮。
化合物11：无色油状物，C15H22O2，HR-ESI-MS，m/z 235.1682 [M+H]+ (计算值235.1693)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 4.91 (1H, d, J = 1.3 Hz, H-12a), 4.81 (1H, s, H-12b), 3.11 (1H, m, H-6a), 2.56 (1H, m, H-2a), 2.40 (2H, m, H-2b/H-6b), 1.95 (1H, m, H-8a), 1.85 (1H, dd, J = 13.9, 3.5 Hz, H-8b), 1.83 (3H, d, J = 1.7 Hz, H-15), 1.78 (3H, d, J = 1.3 Hz, H-13), 1.74 (2H, m, H-1), 1.51 (1H, m, H-9a), 1.34 (1H, m, H-9b), 1.26 (3H, s, H-14). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 37.4 (t, C-1), 33.9 (t, C-2), 198.9 (s, C-3), 129.2 (s, C-4), 161.4 (s, C-5), 40.3 (t, C-6), 76.6 (s, C-7), 31.3 (t, C-8), 37.8 (t, C-9), 35.3 (s, C-10), 147.4 (s, C-11), 113.6 (t, C-12), 18.5 (q, C-13), 23.3 (q, C-14), 11.2 (q, C-15)。以上波谱数据与文献[26]基本一致，故鉴定该化合物为(4aS,7S)-7-hydroxy-1,4a-dimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-4,4a,5,6,7,8-hexahydronaphthalen-2(3H)-one。
化合物12：无色油状物，C15H18。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.92 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-1/H-4), 7.35 (1H, dd, J = 8.5, 1.8 Hz, H-2), 7.28 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-7), 7.22 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-8), 3.72 (1H, m, H-11), 2.65 (3H, s, H-14), 2.56 (3H, s, H-15), 1.26 (3H, s, H-12), 1.26 (3H, s, H-13). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 124.9 (d, C-1), 127.4 (d, C-2), 134.9 (s, C-3), 123.1 (d, C-4), 131.7 (s, C-5), 142.3 (s, C-6), 121.6(d, C-7), 125.7(d, C-8), 132.0 (s, C-9), 131.2 (s, C-10), 28.4 (d, C-11), 23.8 (q, C-12), 23.8 (q, C-13), 19.6 (q, C-14), 22.2 (q, C-15)。以上波谱数据与文献[27]基本一致，故鉴定该化合物为4-异丙基-1,6-二甲基萘。
化合物13： 白色粉末， C20H30O2， HR-ESI-MS，m/z 303.2317 [M+H]+ (计算值303.2319)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 9.33 (1H, s, H-17), 6.79 (1H, m, H-12), 5.65 (1H, dd, J = 5.2, 2.6 Hz, H-7), 3.68 (1H, m, H-15), 2.79 (1H, m, H-11a), 2.53 (1H, s, H-9), 2.39 (1H, m, H-16a), 2.30 (1H, m, H-11b), 2.26 (2H, m, H-14), 2.13 (2H, m, H-6a/H-16b), 1.93 (1H, m, H-6b), 1.86 (1H, m, H-1a), 1.56 (2H, m, H-2), 1.44 (1H, m, H-3a), 1.32 (1H, m, H-5), 1.18 (1H, m, H-3b), 0.99 (1H, m, H-1b), 0.98 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19), 0.78 (3H, s, H-20).13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 39.6 (t, C-1), 19.0 (t, C-2), 42.1 (t, C-3), 33.2 (s, C-4), 50.2 (d, C-5), 24.4 (t, C-6), 128.8 (d, C-7), 132.3 (s, C-8), 51.0 (d, C-9), 36.6 (s, C-10), 31.0 (t, C-11), 157.7 (d, C-12), 139.0 (s, C-13), 29.9 (t, C-14), 69.8 (d, C-15), 41.3 (t, C-16), 195.0 (s, C-17), 21.8 (q, C-18), 33.3 (q, C-19), 13.3 (q, C-20)。以上波谱数据与文献[28]基本一致，故鉴定该化合物为curcuminol D。
化合物14：无色油状物，C18H24O, HR-ESI-MS，m/z 257.1882 [M+H]+(计算值257.1900)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.18 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-10/H-14), 6.70 (2H, d, J = 6.6 Hz, H-11/H-13), 6.22 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-8), 6.01 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-7), 5.89 (1H, s, H-16), 5.00 (1H, m, H-3), 4.86 (2H, m, H-17), 1.95 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 1.65 (3H, d, J = 1.6 Hz, H-18), 1.56 (3H, d, J = 1.4 Hz, H-1), 1.46 (2H, m, H-4), 1.17 (3H, s, H-15). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 17.7 (q, C-1), 132.0 (s, C-2), 126.0 (d, C-3), 24.4 (t, C-4), 42.6 (t, C-5), 43.5 (s, C-6), 126.0 (d, C-7), 135.7 (d, C-8), 131.9 (s, C-9), 128.2 (d, C-10), 116.3 (d, C-11), 157.7 (s, C-12), 116.3 (d, C-13), 128.2 (d, C-14), 23.9 (q, C-15), 147.4 (d, C-16), 112.2 (t, C-17), 25.9 (q, C-18)。以上波谱数据与文献[29]基本一致，故鉴定该化合物为补骨脂酚。
化合物15：白色粉末，C10H10O4，HR-ESI-MS，m/z 195.0467 [M+H]+ (计算值195.0652)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.58 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-7), 7.09 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-8), 4.55 (2H, m, H-3/H-4), 1.48 (3H, d, J = 5.6 Hz, 3-CH3). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 170.2 (s, C-1), 81.6 (d, C-3), 69.5 (d, C-4), 144.1 (s, C-5), 117.7 (d, C-6), 137.8 (d, C-7), 117.8 (d, C-8), 162.9 (s, C-9), 108.0 (s, C-10) , 18.2 (q, 3-CH3)。以上波谱数据与文献[30]基本一致，故鉴定该化合物为(3R,4S)-4羟基蜂蜜曲霉素。
化合物16：无色油状物，C20H22O6，HR-ESI-MS，m/z 381.1331 [M+Na]+ (计算值381.1309)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 6.90 (2H, m, H-2/H-2′), 6.88 (2H, m, H-5/H-5′), 6.82 (2H, d, J = 8.1, 1.7 Hz, H-4/H-4′), 4.73 (2H, m, H-7/H-7′), 4.25 (2H, dd, J = 9.0, 6.1 Hz, H-9a/H-9′a), 3.91 (6H, s, 3-OCH3/3′-OCH3), 3.87 (3H, m, H-9b/H-9b′), 3.10 (2H, t, J = 5.2 Hz, H-8/H-8′). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 133.1 (s, C-1/C-1′), 108.7 (d, C-2/C-2′), 146.8 (s, C-3/C-3′), 119.1 (d, C-4/C-4′), 114.4 (d, C-5/C-5′), 145.4 (s, C-6/C-6′), 86.0 (d, C-7/C-7′), 54.3 (s, C-8/C-8′), 71.8 (t, C-9/C-9′) , 56.1 (s, 3-OCH3/3′-OCH3)。以上波谱数据与文献[31]基本一致，故鉴定该化合物为相对-(3R,3′S,4R,4′S)-3,3′,4,4′-四氢-6,6′-二甲氧基(3,3′-双-2H-苯并吡喃) -4,4′-二醇。
化合物17：白色粉末，C8H8O5，HR-ESI-MS，m/z 185.0433 [M+H]+ (计算值185.0444)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 5.86 (2H, s, H-3/H-5), 3.95 (3H, s, 7-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 94.2 (s, C-1), 96.4 (s, C-2), 164.0 (d, C-3), 166.2 (s, C-4), 164.0 (d, C-5), 96.4 (s, C-6), 171.6 (s, C-7), 52.7 (q, 7-OCH3)。以上波谱数据与文献[32]基本一致，故鉴定该化合物为2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯。
化合物18：淡黄色油状物，C11H14O3，HR-ESI-MS，m/z 195.1003 [M+H]+ (计算值195.1016)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 6.82 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5′), 6.67 (2H, m, H-2′/H-6′), 3.87 (3H, d, J = 3.1 Hz, 3′-OCH3), 2.82 (2H, m, H-4), 2.73 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 29.6 (q, C-1), 208.5 (s, C-2), 45.7 (t, C-3), 30.3 (t, C-4), 133.1 (s, C-1′), 111.2 (d, C-2′), 146.5 (s, C-3′), 144.0 (s, C-4′), 114.5 (d, C-5′), 120.9 (d, C-6′), 56.0 (q, 3′-OH3)。以上波谱数据与文献[33]基本一致，故鉴定该化合物为4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丁酮。
化合物19：无色油状物，C11H14O2，HR-ESI-MS，m/z 179.0906 [M+H]+ (计算值179.1067)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.71 (2H, dd, J = 5.7, 3.2 Hz, H-3′/H-7′), 7.52 (2H, d, J = 5.8, 3.3 Hz, H-4′/H-6′), 7.26 (1H, m, H-5′), 4.30 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-1), 1.71 (2H, m, H-2), 1.44 (2H, m, H-3), 0.96 (3H, d, J = 7.6 Hz, H-4). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 65.7 (t, C-1), 30.7 (t, C-2), 19.3 (t, C-3), 13.9 (q, C-4), 167.9 (s, C-1′), 131.1 (s, C-2′), 129.0 (d, C-3′), 129.0 (d, C-4′), 132.4 (d, C-5′), 129.0 (d, C-6′), 129.0 (d, C-7′)。以上波谱数据与文献[34]基本一致，故鉴定该化合物为苯甲酸丁酯。
化合物20：白色粉末，C8H8O3。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 9.83 (1H, s, H-7), 7.42 (2H, d, J = 6.0 Hz, H-2/H-6), 7.04 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 3.97 (3H, s, 3-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 130.1 (s, C-1), 108.9 (d, C-2), 147.3 (s, C-3), 151.8 (s, C-4), 114.5 (d, C-5), 127.7 (d, C-6), 191.0 (s, C-7), 56.3 (q, 3-OCH3)。以上波谱数据与文献[35]基本一致，故鉴定该化合物为香草醛。
化合物21：无色油状物，C9H10O。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.54 (2H, d, J = 3.3 Hz, H-2/H-6), 6.95 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5), 3.96 (3H, s, 3-OCH3), 2.56 (3H, s, H-8). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 130.3 (s, C-1), 109.7 (d, C-2), 150.5 (s, C-3), 146.8 (s, C-4), 56.2 (q, 3-OCH3), 113.9 (d, C-5), 124.2 (d, C-6), 196.9 (s, C-7), 26.4 (q, C-8)。以上波谱数据与文献[36]基本一致，故鉴定该化合物为香草乙酮。
化合物22：白色粉末，C17H34O2。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 2.34 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 1.61 (2H, d, J = 7.4 Hz, H-3), 1.26 (26H, m, H-4~H-16), 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-17). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 180.5 (s, C-1), 34.3 (t, C-2), 32.1 (t, C-3), 22.9~29.9 (t, C-4~C-16), 14.3 (q, C-17)。以上波谱数据与文献[37]基本一致，故鉴定该化合物为十七烷酸。
2.2 高良姜化学成分的神经保护作用
2.2.1 细胞毒性筛选
由于化合物19的含量太少，故未对其细胞毒性和神经保护作用进行研究。
由图2可知：浓度为5、10和20 μmol/L时，化合物2、3、4、16和20对SH-SY5Y细胞有一定的毒性，其他化合物在低、中、高剂量下的细胞存活率较对照组无显著差异，说明大部分化合物对SH-SY5Y细胞无毒性。可见，H2O2损伤SH-SY5Y细胞模型适合用于评价高良姜化合物的神经保护作用。
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图 2 化合物1~18和20~22对SH-SY5Y细胞的毒性注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。Figure 2. Cytotoxicities of compounds 1-18 and 20-22 on SH-SY5Y cellsNote: Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.2.2.2 神经作用保护评价
由图3可知：H2O2组与对照组相比细胞存活率相差较大，说明H2O2损伤的神经细胞造模成功。与H2O2组的细胞存活率相比，受损细胞在低、中、高浓度的化合物1、7和18作用后细胞存活率显著提高，且对神经细胞没有毒性。说明这3种化合物具有较强的神经保护活性且细胞毒性较低。
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图 3 化合物1~18和20~22对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的神经保护作用注：与H2O2组比较，*P<0.05，**P<0.01。Figure 3. Neuroprotective effects of compounds 1-18 and 20-22 on the H2O2-induced SH-SY5Y cellsNote: Compared with H2O2 group, *P<0.05, **P<0.01.3. 讨论
高良姜植物资源丰富，具有重要的医药和工业应用价值。 现有文献报道： 高良姜醇提物对H2O2诱导的PC12损伤细胞有保护作用[5]；高良姜素能通过抑制神经炎症发挥抗帕金森病的作用[38]；从高良姜中分离获得的7-(4-羟基苯基)-1-苯基-4E-庚烷-3-酮等有潜在的促进神经分化和增生作用[39]，但是其他成分在神经精神疾病方面的研究报道较少，尤其是黄酮类成分是否具有神经保护作用尚不明确。本研究报道了高良姜中具有神经保护作用的化学成分，表现出神经保护作用的化合物分别为山柰素-4′-甲醚 (1)、二氢山柰酚 (7) 和姜油酮 (18)，这是首次报道高良姜黄酮类化合物的神经保护作用，扩大了具有神经保护作用化合物的研究范围。神经退行性疾病危害大，缺乏有效的药物治疗[40-42]，一些具有神经保护作用的小分子对神经退行性疾病具有潜在的治疗作用，有望开发为具有治疗作用的药物[43]。
在本研究中，山柰素-4′-甲醚和二氢山柰酚为黄酮类化合物，前者在高良姜中的含量仅次于化合物2， 约为0.27% (20.0 kg样品中分离得到55.6 g)，且通过重结晶的方法即可分离获得，说明该化合物含量高、容易获得；二氢山柰酚是常见的天然产物，姜油酮结构较为简单，可通过化学合成大量获得，这些化合物的来源可得到保障，为进一步研究其对神经退行性疾病的治疗作用奠定了基础。本研究仅在细胞层面研究了化合物的神经保护作用，缺乏动物试验支撑，今后将设计动物试验，通过建立氧化损伤所致神经退行性动物模型系统评价这些化合物的治疗作用，阐述其神经保护作用机制；还将从化学结构出发，继续以天然产物为研究对象，发掘更多的结构类似物；化合物1~3和10的产率较高，将进一步对它们进行结构修饰，系统地研究其神经保护作用，总结构效关系，以期将其开发为对神经退行性疾病具有治疗作用的先导化合物。
4. 结论
本研究从高良姜中分离并鉴定得到22种化合物，其中9种化合物为首次从该植物中分离得到，研究结果丰富了高良姜的化学成分。生物活性研究表明：高良姜中的黄酮类和其他类型的化合物有较好的神经保护作用，其中山柰素-4′-甲醚 (1)、二氢山柰酚 (7) 和姜油酮 (18) 的神经保护作用较强且细胞毒性较低，有望开发为对神经退行性疾病具有治疗作用的神经保护剂，促进高良姜的开发利用。
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图 1 不同施肥处理对夏玉米一冬小麦土壤全氮含量的影响
注：CK. 空白对照，CF. 常规施肥，BRF. 沼液+常规施肥减量40%，CRF. 缓控释肥；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 1. Effects of different fertilization treatments on soil total nitrogen content of summer maize-winter wheat
Note: CK. blank control, CF. conventional fertilization, BRF. biogas slurry+conventional fertilization reduction of 40%, CRF. slow controlled release fertilizer; different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below.
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图 2 不同施肥处理对夏玉米一冬小麦土壤碱解氮含量的影响
Figure 2. Effects of different fertilization treatments on soil alkali-hydrolytic nitrogen content of summer maize-winter wheat
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图 3 不同施肥处理对夏玉米一冬小麦土壤有效磷含量的影响
Figure 3. Effects of different fertilization treatments on soil available phosphorus content of summer maize-winter wheat
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图 4 不同施肥处理对夏玉米一冬小麦土壤速效钾含量的影响
Figure 4. Effects of different fertilization treatments on soil available potassium content of summer maize-winter wheat
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图 5 不同施肥处理对夏玉米一冬小麦土壤有机质含量的影响
Figure 5. Effects of different fertilization treatments on soil organic matter content of summer maize-winter wheat
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图 6 不同施肥处理对不同耕层土壤中Cu含量的影响
Figure 6. Effects of different fertilization treatments on the Cu content in different topsoils
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图 7 不同施肥处理对不同耕层土壤中Zn含量的影响
Figure 7. Effects of different fertilization treatments on the Zn content in different topsoils
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图 8 不同施肥处理对不同耕层土壤中As含量的影响
Figure 8. Effects of different fertilization treatments on the As content in different topsoils
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图 9 不同施肥处理对夏玉米植株重金属含量的影响
Figure 9. Effects of different fertilization treatments on the heavy metal content in summer maize plants
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图 10 不同施肥处理对冬小麦植株重金属含量的影响
Figure 10. Effects of different fertilization treatments on the heavy metals content in winter wheat plants
表 1 麦玉施肥方案
Table 1 Fertilization plan of wheat and maize
作物
crop处理
treatments基肥/(kg·hm−2) base fertilizer 沼液追施/(kg·hm−2) application of biogas slurry N P2O5 K2O N P2O5 K2O 冬小麦
winter wheatCK 0 0 0 0 0 0 CF 187.50 97.50 52.50 0 0 0 CRF 150.00 78.00 42.00 0 0 0 BRF 112.50 58.50 31.50 199.30 7.53 31.62 夏玉米
summer maizeCK 0 0 0 0 0 0 CF 210.00 45.00 45.00 0 0 0 CRF 168.00 36.00 36.00 0 0 0 BRF 126.00 27.00 27.00 166.00 6.28 26.35 注：CK. 空白对照，CF. 常规施肥，BRF. 沼液+常规施肥减量40%，CRF. 缓控释肥。
Note: CK. blank control, CF. conventional fertilization, BRF. biogas slurry+conventional fertilization reduction of 40%, CRF. slow controlled release fertilizer.
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