黄芽白菜核基因雄性不育系的选育及其败育特征分析
Breeding and Abortion Characteristic Analysis of Genic Male Sterile Line of Huangya Chinese Cabbage
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烟草丛顶病(tobacco bushy top disease，TBTD)由多种病原物复合侵染引起，是一种对烟草生产带来毁灭性灾害的植物病害。GATES首次在1958年报道该病发生于津巴布韦，感染了此病害的植株腋芽丛生，出现顶端优势丧失现象[1]。随后，该病害在南非、马拉维、赞比亚等南部非洲国家以及亚洲的巴基斯坦、泰国和中国相继发生，给烟草生产带来巨大的损失[2]。1993年，烟草丛顶病在云南保山爆发流行，对当地的烟草生产带来了重大威胁，该病已成为云南省20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害[3]。近年来，烟草丛顶病仍然在云南各个主要烟区零星发生，但目前中国仅在云南有发生报道[3]。2014年在埃塞俄比亚也发现了与云南烟草丛顶病相似的由多种病原物复合侵染引起的烟草病害[4]。
黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus，TVDV)[5-6]为云南烟草丛顶病的主要病原物之一。自然情况下，黄症病毒科病毒由蚜虫以持久非增殖方式传播[7]，病毒被蚜虫取食时，由蚜虫口针进入肠腔，肠腔中的病毒由消化道进入血淋巴，再由血淋巴进入副唾液腺。不同的病毒介体组合中，病毒在介体昆虫消化道的侵入部位不同，完成整个循回过程的时间也不同[7]。TBTD在田间主要由蚜虫传播，而且TVDV单独能经蚜虫传播，但TBTD其他病原物在缺少TVDV的情况下都不能经蚜虫传播，而与TVDV复合侵染时，都能经蚜虫传播，TVDV在介导TBTD病原物的蚜虫传播中起着重要的作用[3, 8]。因此，研究TVDV经蚜虫传播的机制，分析TVDV与介体蚜虫的互作关系，将为有效控制TBTD的传播提供重要的参考。本研究通过在大肠杆菌表达菌株中诱导表达TVDV的外壳蛋白(coat protein, CP)，成功获得了TVDV的CP抗血清，并利用制备的抗血清对TVDV在介体蚜虫体内进行了定位，研究结果将为进一步分析TVDV在蚜虫体内的侵染循回，TVDV协助TBTD其他病原物进行蚜虫传播的机制等研究提供技术方法和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
烟草丛顶病感病烟株采自昆明市盘龙区，感病烟株于温室隔离网箱中用蚜虫传毒保存。无毒蚜虫为本实验室养殖的脱毒烟蚜(Myzus persicae)。大肠杆菌DH5α、Rocceta菌株为本实验室保存。Trizol试剂，原核表达载体pDONR221、pDEST17购自Invitrogen公司。Gateway BP Clonase Enzyme Mix、Gateway LR Clonase Enzyme Mix，Protein A IgG purification kits购自Thermo公司；通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)购自天根生物科技(北京)有限公司；荧光素粉、phalloidin-FITC购自Sigma公司；引物TVDVECPF、TVDVECPR由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 TVDV CP基因原核表达载体的构建与鉴定
用Trizol试剂抽提TBTD感染烟株叶片总RNA作为模板，用引物TVDVECPF： GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAATACGGGMGGAG和TVDVECPR： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTGGGGTTGTGC (正体部分为TVDV CP基因序列，划线部分为重组序列)，RT-PCR扩增出TVDV CP基因。用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收纯化扩增产物后，用Gateway BP Clonase Enzyme Mix试剂盒克隆到入门载体pDONOR221，所得目标载体再转化大肠杆菌DH5α菌株，PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定。阳性质粒用Gateway LR Clonase Enzyme Mix试剂盒重组连接，TVDV CP基因重组克隆入载体pDEST 17，PCR鉴定为阳性的质粒即为TVDV CP基因的原核表达载体pDEST17-TVDV-CP。
1.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将阳性重组质粒pDEST17-TVDV-CP利用热激法转化Rocceta感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上进行筛选。挑单菌落培养后进行PCR鉴定，阳性菌液用于后续的诱导表达。取阳性菌液按1:100 (体积比)转接入含 1‰的氨苄青霉素(ampicillin，Amp)和氯霉素(chloramphenicol，Chl)的LB培养基中，220 r/min、37 ℃振荡培养至OD600=0.4~0.6后，菌液加入终浓度分别为 1、0.5、0.1、0 mmol/L的IPTG在 28 ℃诱导表达4~6 h，收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析。
1.4 Western-blot检测诱导表达的融合蛋白
收集诱导表达后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳凝胶用湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上；转膜后，PVDF膜于3% BSA中室温封闭2 h后，用封闭液按1:3 000稀释的His鼠抗37 ℃孵育2 h；TBST清洗，用封闭液按1:20 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG在37 ℃下孵育2 h；孵育结束后，用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)进行显色[9]。
1.5 TVDV CP抗血清的制备及Western-blot检测制备抗体的特异性
诱导表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，KCl染色并割下目标条带，目标蛋白经透析收集，用于免疫试验小鼠，共免疫5次，每7 d 1次。最后1次免疫7 d后，收集小鼠血清。
提取TBTD感病烟株上取食的蚜虫总蛋白，用制备的TVDV CP抗血清为一抗，以健康蚜虫总蛋白作为对照，参照1.4 节进行Western-blot检测所制备抗体特异性。
1.6 TVDV在蚜虫消化道中的定位
所制备的TVDV CP抗血清用蛋白A亲和柱纯化IgG。参照贾东升[9]的方法，将所得TVDV CP IgG交联荧光素，制备TVDV CP荧光抗体CP-rhodamin用于标记TVDV，用phalloidin-FITC抗体标记蚜虫肌动蛋白(Actin)。
参照WEI等[10]的方法，对在TVDV感病烟株上取食2 d以上的蚜虫进行免疫荧光标记。在1×PBS中解剖蚜虫消化道，消化道经固定、渗透后用CP-rhodamin与phalloidin-FITC于37 ℃孵育2 h。标记后的蚜虫肠道用共聚焦显微镜进行观察。
2. 结果与分析
2.1 TVDV CP基因原核表达载体的构建与鉴定
以提取的TVDV侵染烟株总RNA作为模板，RT-PCR扩增TVDV完整的CP基因。琼脂糖凝胶电泳检测到大小约 680 bp的DNA片段(图1)，TVDV CP基因长618 bp，扩增引物两端带有Gateway系统重组序列各30 bp，因此所扩增片段大小与目的基因大小相符。克隆到入门载体后经测序确认为目的基因，表达载体命名为pDEST 17-TVDV-CP。
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图 1 RT-PCR扩增TVDV CP基因注/Note：M. Marker；1. TVDV CP gene.Figure 1. RT-PCR amplification of TVDV CP gene2.2 Western-blot检测诱导表达的融合蛋白
将原核表达载体转入Rocceta菌株进行诱导表达，收集诱导表达后的总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色检测(图2)，同时用Western-blot进行检测(图3)。TVDV的CP蛋白预测大小为23 ku，融合的6×His标签约3 ku，则融合表达的CP蛋白约26 ku。IPTG浓度为1、0.5、0.1 mmol/L时都能检测到与预期蛋白大小相符的条带，且Western-blot也能检测到相应条带，而对照无相应条带，表明TVDV的CP蛋白被特异性诱导表达。
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图 2 SDS-PAGE分析TVDV CP蛋白在大肠杆菌中的表达注：M. 蛋白Marker；1、3、5、7. IPTG浓度分别为1、0.5、0.2、0.1 mmol/L诱导；2、4、6、8. 未加IPTG诱导的对照；下同。Figure 2. SDS-PAGE analysis for the expression of TVDV CP in E. coli RoccetaNote: M. protein Marker; 1, 3, 5, 7. induced by 1, 0.5, 0.2, 0.1 mmol/L IPTG respectively; 2, 4, 6, 8. no inducal by IPTG; the same as below.![]()
图 3 Western-blot分析TVDV CP蛋白在大肠杆菌中的表达Figure 3. Western-blot analysis for the expression of TVDV CP in E. coli Rocceta2.3 Western-blot检测所制备的TVDV CP抗体的特异性
分别以在TBTD染病烟株上饲毒的蚜虫及健康蚜虫总蛋白为样品，以制备的TVDV CP抗血清为一抗进行Western-blot检测。从饲毒蚜虫总蛋白样中可以检测到1条约23 ku蛋白条带，大小与预期大小相符，而健康蚜虫蛋白样品中无条带(图4)，以上结果表明制备的抗体能特异性检测TVDV的CP蛋白，可用于后续的免疫荧光标记试验。
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图 4 Western-blot检测TVDV CP蛋白抗体的特异性注：M. 蛋白Marker；1. 无毒蚜虫；2. 带毒蚜虫。Figure 4. Western-blot detecting the antibody specificity against TVDV CPNote：M. protein Marker; 1. nonviruliferous aphids; 2. viruliferous aphids.2.4 TVDV在蚜虫消化道中的分布
解剖在TVDV感病烟株上取食2 d以上的蚜虫消化系统，经固定、渗透后，用标记肌动蛋白(Actin)荧光抗体phalloidin-FITC (绿色)标记蚜虫消化道骨架，用CP-rhodamin (红色)标记TVDV。共聚焦显微镜下，在蚜虫消化道中肠上皮细胞检测到大量特异性的红色荧光(图5)，而蚜虫消化道的前肠、后肠等上皮细胞中未检测到红色荧光，表明TVDV在获毒蚜虫中分布于消化道中肠上皮细胞。
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图 5 TVDV在蚜虫消化道的分布注：红色. TVDV；绿色. actinFigure 5. The distribution of TVDV in alimentary canal of aphidNote：red. TVDV；green. actin3. 讨论
本研究通过在大肠杆菌Rocceta菌株中诱导表达TVDV CP蛋白并收集蛋白免疫小鼠，成功获得TVDV CP抗血清；同时，利用制备的抗血清对TVDV在介体蚜虫体内进行了定位。
原核表达载体pDEST17在Rocceta宿主菌中，用不同的IPTG溶度于28 ℃都能诱导出TVDV CP蛋白的表达，而把pDEST 17载体转化到表达菌株BL 21，在不同的IPTG溶度及不同的温度如16、25、28、37 ℃都无法检测到CP蛋白的表达。同时，把CP基因构建到原核表达载体pET28a并转化到BL 21中，也检测不到CP蛋白的表达，以上结果表明TVDV CP蛋白在BL 21菌株中不表达(未发表数据)。分析TVDV CP蛋白氨基酸序列发现，CP蛋白含大量稀有密码子，而Rocceta菌株含有内源表达稀有氨基酸的质粒，这可能是CP蛋白能在Rocceta菌株中表达的原因。
TVDV为黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员，黄症病毒由蚜虫以循回非增殖方式传播。通过免疫荧光标记，TVDV定位于蚜虫消化道中肠上皮细胞，说明TVDV由介体蚜虫以循回方式传播，不同于非循回型，病毒只能停留在介体口针或前肠[11]。TVDV只定位于蚜虫的中肠，与另外两种马铃薯卷叶病毒属成员——甜菜西方黄化病毒(Beet western yellow virus，BWYV)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)一样，病毒都定位于介体蚜虫中肠[12-13]，而不同于大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)、禾谷类黄矮病毒(Cereal yellow dwarf virus，CYDV)、大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus，SbDV)，这些病毒定位于介体的后肠[7, 14]，以及南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellow viurs，CABYV)定位于介体的中肠与后肠[15]。在BWYV 的通读结构域(readthrough domian, RTD )与CABYV RTD编码区互换的实验中发现：用CABYV RTD替换了BWYV RTD后，该重组病毒侵入介体消化道的部位与CABYV相同，同样用BWYV RTD替换了CABYV RTD后，该重组病毒侵入介体消化道的部位与BWYV相同，病毒进入介体消化道的部位与其ORF5编码蛋白有关[16]。TVDV的RTD与PRLV、BWYV的RTD氨基酸同源性高达63.2%和57%；因此，这3种病毒的RTD可能具有类似的功能。
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图 1 黄芽白菜核基因雄性不育系转育方法
Figure 1. Transferring and breeding method of genic male sterile line in Huangya Chinese cabbage
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图 2 黄芽白菜核基因雄性不育系HA1和可育系H249的花
Figure 2. Flower of genic male sterile line HA1 and fertile line H249 of Huangya Chinese cabbage
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图 3 黄芽白菜不育系HA1及可育品系H249花药发育时期的小孢子
注：H249，可育品系，a)~d) 依次为其减数分裂期(花蕾1.07~1.35 mm×0.98~1.05 mm)、四分体时期(花蕾1.40~2.06 mm×1.14~1.58 mm)、单核期(花蕾2.32~3.87 mm×1.63~2.36 mm)和成熟期(花蕾4.05~4.86 mm×2.61~2.90 mm)；HA1，不育系，e)~g) 依次为其减数分裂期(花蕾0.88~1.33 mm×0.75~1.14 mm)、四分体时期(花蕾1.41~1.88 mm×1.26~1.57 mm)和单核期(花蕾2.10~3.34 mm×1.63~2.18 mm)。
Figure 3. Microspores of genic male sterile line HA1 and fertile line H249 of Huangya Chinese cabbage during the development of anther
Note: H249, fertile line, a)-d) were meiosis (flower bud size 1.07-1.35 mm×0.98-1.05 mm), tetrad (flower bud size 1.40-2.06 mm×1.14-1.58 mm), mononuclear (flower bud size 2.32-3.87 mm×1.63-2.36 mm) and mature stage (flower bud size 4.05-4.86 mm×2.61-2.90 mm), respectively; HA1, sterile line, e)-g) were meiosis (flower bud size 0.88-1.33 mm×0.75-1.14 mm), tetrad (flower bud size 1.41-1.88 mm×1.26-1.57 mm) and mononuclear stage (flower bud size 2.10-3.34 mm×1.63-2.18 mm), respectively.
表 1 H249与KAB5杂交后代育性分离结果
Table 1 Results of fertility segregation of hybrid progeny of crossing H249 and KAB5
组合combinations 可育株/不育株fertile/sterile 理论分离比例theoretical ratio 基因型genotypes KAB5-1A×H249-1 0/72 全不育 sterile Msms KAB5-2A×H249-2 0/72 全不育 sterile Msms KAB5-3A×H249-3 0/72 全不育 sterile Msms H249-1×KAB5-1B 38/34 1 ∶ 1 (0.125) Msfms, Msms H249-2×KAB5-2B 37/35 1 ∶ 1 (0.014) Msfms, Msms H249-3×KAB5-3B 28/30 1 ∶ 1 (0.017) Msfms, Msms 注：括号中数据为X 2值；下同。Note: Data in brackets are X 2 values; the same as below. 
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表 2 H249各回交后代育性表现
Table 2 Fertility expression of progenies from H249 backcrossing
回交世代backcross generation 组合combinations 可育株/不育株fertile/sterile 理论分离比例 theoretical ratio 基因型genotypes BC1 (H249-1×KAB5-1B)-1A×H249 35/34 1 ∶ 1 (0.000) Msms, msms (H249-1×KAB5-1B)-1B×H249 27/22 1 ∶ 1 (0.327) Msfms, msms BC2 ((H249-1×KAB5-1B)-1A×H249)-2A×H249 32/34 1 ∶ 1 (0.015) Msms, msms ((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-4×H249 46/0 全可育 fertile Msfms, msms ((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249 57/0 全可育 fertile Msfms, msms ((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-6×H249 42/0 全可育 fertile msms ((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-7×H249 39/0 全可育 fertile Msfms, msms BC3 (((H249-1×KAB5-1B)-1A×H249)-2A×H249)-1A×H249 32/28 1 ∶ 1 (0.150) Msms, msms (((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-1×H249 53/0 全可育 fertile Msfms, msms (((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-3×H249 35/0 全可育 fertile Msfms, msms (((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-6×H249 37/0 全可育 fertile msms
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表 3 各世代Msfms基因型测交结果
Table 3 Test cross results of genotyping of Msfms in different generations
组合combinations 可育株/不育株fertile/sterile 理论分离比例theoretical ratio 基因型genotypes KAB5-1A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-1 0/44 全不育 sterile Msms KAB5-2A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-2 0/38 全不育 sterile Msms KAB5-3A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-3 0/29 全不育 sterile Msms KAB5-4A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-4 19/21 1 ∶ 1 (0.025) MsfMs, Msms KAB5-5A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5 18/22 1 ∶ 1 (0.225) MsfMs, Msms KAB5-6A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-6 0/55 全不育 sterile Msms KAB5-7A×((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-7 26/26 1 ∶ 1 (0.019) MsfMs, Msms KAB5-1A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-1 23/19 1 ∶ 1 (0.214) MsfMs, Msms KAB5-1A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-2 0/45 全不育 sterile Msms KAB5-2A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-3 27/23 1 ∶ 1 (0.180) MsfMs, Msms KAB5-3A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-4 0/43 全不育 sterile Msms KAB5-3A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-5 0/37 全不育 sterile Msms KAB5-5A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-6 0/28 全不育 sterile Msms KAB5-5A×(((H249-1×KAB5-1B)-1B×H249)-5×H249)-7 0/51 全不育 sterile Msms
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表 4 BC3 Msms×BC3 Msfms自交后代育性分离比率
Table 4 Fertility segregation ratio of selfing offspring from BC3 Msms×BC3 Msfms
组合combinations 可育株/不育株fertile/sterile 理论分离比例theoretical ratio 基因型genotypes (BC3 Msms×BC3 Msfms)-1B 
58/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-2B 57/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-3B 47/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-4B 36/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-5B 41/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B 48/15 3 ∶ 1 (0.005) MsfMsf, MsfMs, MsMs (BC3 Msms×BC3 Msfms)-7B 38/18 3 ∶ 1 (1.486) MsfMsf, MsfMs, MsMs (BC3 Msms×BC3 Msfms)-8B 36/13 3 ∶ 1 (0.007) MsfMsf, MsfMs, MsMs (BC3 Msms×BC3 Msfms)-9B 44/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-10B 50/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-11B 46/0 全可育 fertile 未知 uncertain (BC3 Msms×BC3 Msfms)-12B 42/16 3 ∶ 1 (0.092) MsfMsf, MsfMs, MsMs
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表 5 黄芽白菜新甲型两用系及新不育系测配结果
Table 5 Results of the test crosses for breeding new genic male sterile line and AB lines in Huangya Chinese cabbage
组合combinations 代号code 可育株/不育株fertile/sterile 理论分离比例theoretical ratio (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-1A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-1B HAB1 21/18 1 ∶ 1 (0.103) (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-2A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-2B HAB2 22/24 1 ∶ 1 (0.022) (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-3A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-3B HAB3 45/0 全可育 fertile (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-4A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-4B HAB4 42/0 全可育 fertile (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-5A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-5B HAB5 30/ 0 全可育 fertile (BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-6A×(BC3 Msms×BC3 Msfms)-6B-6B HAB6 20/15 1 ∶ 1 (0.457) HAB2-1A×H249-1 HA1 0/46 全不育 sterile HAB2-2A×H249-2 HA2 0/48 全不育 sterile HAB2-3A×H249-3 HA3 0/51 全不育 sterile
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表 6 HAB2可育和不育的花器官形态
Table 6 Flower organ form between fertile and sterile plants of HAB2
mm 材料materials 花瓣长petals length 花瓣宽petals wideth 长雄蕊高 long stamens height 短雄蕊高short stamens height 萼片长sepals length 柱头高stigma height HA1 9.78 Bb 4.62 Bb 5.68 Bb 4.91 Aa 5.13 Aa 5.68 Bb H249 10.78 Aa 5.27 Aa 6.79 Aa 5.67 Aa 5.09 Aa 6.99 Aa 注：HA1为不育材料，H249为可育材料；同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。Note: HA1 is sterile material, H249 is fertile material; different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant differences (P<0.01).
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1. 杨亚辉，杨洁，陈平，陈海如，陈小姣，李凡. 烟草扭脉病毒云南分离物rtp基因克隆及序列分析. 植物医学. 2024(02): 38-48 . 
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