大熊猫源犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
建立一种检测大熊猫血清中犬细小病毒 (canine parvovirus，CPV)抗体的间接酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法。
以大熊猫源CPV DNA为模板，利用PCR扩增VP2基因，再用原核表达系统对VP2基因进行表达，经纯化后的蛋白作为ELISA包被抗原；制备并纯化兔抗大熊猫IgG，采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记作为间接ELISA酶标二抗，通过棋盘法确定抗原包被质量浓度及血清稀释度等条件，并评估建立方法与商业试剂盒检测样品结果的符合率。
原核表达成功获得约70 ku的VP2蛋白，将其作为间接ELISA包被抗原，抗原最佳包被质量浓度为2.0 μg/mL，血清最佳稀释度为1∶400，用该方法进行检测血清样品时OD450≥0.258为阳性，反之为阴性。采用建立的ELISA方法检测大熊猫血清样本阳性率为60.0%，高于商业化检测试剂盒检测的阳性率(52.5%)，两者总符合率达到87.5%。
本研究首次建立了基于大熊猫源CPV VP2蛋白为抗原、自制HRP标记兔抗大熊猫IgG为酶标二抗的间接ELISA方法，该方法特异性强、灵敏性较高、重复性好，为大熊猫血清中CPV抗体的检测提供了技术支持。
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关键词:
- 大熊猫 /
- 犬细小病毒 /
- VP2蛋白 /
- 原核表达 /
- 间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)
Prokaryotic Expression of Giant Panda-derived Canine Parvovirus VP2 Gene and Establishment of an Indirect ELISA Detection Method
To establish an indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method for detecting canine parvovirus (CPV) antibodies in giant panda serum.
The VP2 gene was amplified by PCR using CPV DNA derived from giant pandas as a template, then the VP2 gene was expressed using a prokaryotic expression system, and the purified protein was used as an ELISA coated antigen. Rabbit anti-giant panda IgG was prepared and purified, and labeled with horseradish peroxidase (HRP) as an indirect ELISA enzyme-labeled secondary antibody. The conditions such as the mass concentration of coated antigen and dilution of serum were determined by the checkerboard method; and the consistency rate between the established method and the test sample results of commercial kits was evaluated.
Prokaryotic expression successfully obtained about 70 ku of VP2 protein, which was used as an indirect ELISA coated antigen. The optimal mass concentration of coated antigen was 2.0 μg/mL, and the optimal dilution of serum was 1∶400. When using this method to detect serum samples OD450≥0.258 was positive, and vice versa was negative. The positive rate of giant panda serum samples detected by the ELISA method established in this study was 60.0%, which was higher than the positive rate of commercial detection kits (52.5%), and the total coincidence rate reached 87.5%.
This study establishs an indirect ELISA method based on the giant panda-derived CPV VP2 protein as the antigen, and homemade HRP-labeled rabbit anti-giant panda IgG as the enzyme-labeled secondary antibody for the first time. This method has strong specificity, high sensitivity and good repeatability, and provides technical support for the detection of CPV antibodies in giant panda serum.
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犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的一种犬出血性肠炎和非化脓性心肌炎的烈性传染病[1]。CPV有2个开放阅读框，分别编码结构蛋白与非结构蛋白，其中结构蛋白VP2约占病毒粒子的90%，是抗原表位存在较多的蛋白[2]。1988年，邬捷等[3]首次报道大熊猫能感染细小病毒，发生出血性肠炎，并且通过血凝抑制试验在大熊猫血清中检测出CPV血清抗体；郭玲[4]从1只死亡大熊猫肠管中成功分离1株CPV，并将该毒株感染幼犬未出现死亡；梁萌[5]从四川某大熊猫基地1只腹泻且死亡大熊猫个体肠内容物中分离得到1株CPV，该毒株感染幼猫可致其死亡。可见，CPV能感染大熊猫，且致病性较强。
目前主要是通过以犬源CPV为基础建立的血清CPV抗体检测试剂盒替代检测CPV抗体，尚无针对大熊猫血清中CPV抗体的检测方法，特异性较弱。酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法具有灵敏性高、特异性好等优点，已广泛应用于免疫学检测[6]。潘广林等[7]建立了大熊猫血清中犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)抗体的ELISA检测方法，具有针对性，且灵敏性较高。因此，开发一种针对大熊猫血清中CPV抗体的ELISA检测方法具有可行性。本研究以原核表达的大熊猫源CPV VP2蛋白作为间接ELISA包被抗原，制备辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的兔抗大熊猫IgG，通过条件优化，建立大熊猫血清中CPV抗体检测方法，以期为检测大熊猫血清中CPV抗体提供快速、有效的检测手段。
1. 材料与方法
1.1 供试菌株、病毒和试验动物
大熊猫源CPV株和pET-28a原核表达载体由四川农业大学动物医学院微生物与免疫学实验室保存；大熊猫源CPV阴/阳性血清和大熊猫源CDV阳性血清采自成都大熊猫繁育研究基地；成年家兔购自成都达硕实验动物有限公司[ 许可证号：SCXK (川) 2022-0039]。
1.2 主要试剂和材料
病毒DNA小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Magen公司；连接酶、绿酶、高保真酶以及BL21 (DE3)和DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；SDS PAGE凝胶快速配制试剂盒和考马斯亮蓝超快染色液购自碧云天公司；蛋白浓度测定试剂盒购自索莱宝科技有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；重组蛋白A琼脂糖凝胶FF纯化柱购自杭州纽龙生物科技有限公司；可溶型单组分TMB底物溶液购自天根生化科技(北京)有限公司；CPV抗体ELISA检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HRP快速试剂盒购自福因德科技(武汉)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 大熊猫源CPV DNA提取及VP2基因扩增
参照NCBI上CPV VP2基因(序列号：JX624771)和pET-28a载体序列，利用CE Design V1.04软件设计扩增CPV VP2的同源臂引物(表1)。利用DNA提取试剂盒提取大熊猫源CPV病毒液DNA，再利用高保真酶和设计的特异性引物扩增VP2基因；将获得的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并利用胶回收试剂盒回收目的片段。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence引物名称
primer name引物序列 (5′→3′)
primer sequence产物大小/bp
product sizeVP2-F cagcaaatgggtcgcggatccATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC 1794 VP2-R ctcgagtgcggccgcaagcttATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAGATTTT 1.4 VP2基因重组表达载体构建
利用连接酶连接1.3节胶回收的目的片段与线性化pET-28a载体，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，后置于37 ℃细菌培养箱中过夜培养，挑取平板上的单个菌落进行PCR鉴定；将阳性菌落扩大培养，再利用质粒抽提试剂盒提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定；将菌落PCR及双酶切鉴定均正确的质粒送至生工生物科技有限公司测序。将测序正确的VP2基因序列与NCBI上经典毒株VP2基因进行对比分析，并将表达载体命名为pET-28a-VP2，再将该载体转化至BL21 (DE3)感受态细胞中过夜培养，然后进行菌落PCR和阳性菌株扩大培养，最后将菌液与甘油生理盐水以2∶1 (V∶ V)保存于−80 ℃。
1.5 VP2蛋白的原核表达及纯化
将保种的重组表达菌液4 mL和卡那抗性的LB液体培养基200 mL转移至锥形瓶中，置于37 ℃、200 r/min摇床中扩大培养至OD600值达到0.4~0.6；加入1 mol/L (预试验最适浓度)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，以37 ℃、150 r/min诱导表达24 h，以8000 r/min 离心10 min后收集菌体；用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)进行重悬，以8000 r/min 离心10 min后收集菌体，用PBS清洗2遍；再用PBS 20 mL重悬并利用超声裂解菌体(功率160 W，破碎2 s→间歇3 s→破碎10 min)；以10000 r/min、4 ℃离心10 min后获得上清，利用包涵体重悬液收集沉淀。用SDS PAGE凝胶快速配制试剂盒检测VP2蛋白的表达情况；用蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，再用氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽配置的蛋白透析液对目的蛋白进行透析复性，于4 ℃透析16 h，期间换2次透析液，透析完成后再过超滤管进行浓缩，获得目的蛋白，用蛋白浓度测定试剂盒对其浓度进行测定；加入10%甘油，置于−80 ℃保存。
1.6 兔抗大熊猫IgG酶标二抗制备
将大熊猫CPV阳性血清经过重组蛋白A进行IgG纯化，并采用SDS PAGE试剂盒检测纯化结果，再用蛋白浓度测定试剂盒测定IgG浓度；添加10%甘油，置于−80 ℃保存。将保存的IgG蛋白(含大熊猫血清0.50 mg)与弗氏完全佐剂等体积混匀、乳化，对成年健康家兔颈部和背部皮下注射进行首次免疫；2周后在皮下接种IgG蛋白(含大熊猫血清0.25 mg)与弗氏不完全佐剂等体积混匀、乳化后的乳化剂，进行第2次免疫，每只注射1 mL；第4周再按第2次免疫剂量重复免疫；10 d后耳缘静脉采血，分离血清。利用重组蛋白A纯化兔血清中的IgG，并采用Western-blot验证兔抗大熊猫IgG能否与大熊猫IgG结合，即以纯化大熊猫IgG为试验组，以纯化猪IgG为对照组，兔抗大熊猫IgG为一抗、HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行孵育，通过化学发光试剂ECL显色液进行显色并记录，最后利用HRP快速试剂盒对纯化后的目的蛋白进行标记。
1.7 VP2蛋白的免疫印迹(Western-blot)分析
将复性后的VP2蛋白和pET-28a载体蛋白作为对照组进行免疫印迹分析，将大熊猫CPV阳性血清和阴性血清分别作为一抗在4 ℃过夜孵育，后用磷酸盐吐温缓冲液(PBS+Tween-20，PBST)洗3次，每次5 min；二抗使用HRP标记的兔抗大熊猫IgG，置于摇床上缓慢摇晃孵育1 h，后用PBST洗3次，每次5 min，再用化学发光试剂ECL底物显色液进行显色，并拍照保存。
1.8 基于CPV VP2蛋白的间接ELISA检测方法
1.8.1 ELISA检测方法的建立
(1) 最佳抗原包被质量浓度和血清稀释度的确定
用碳酸盐缓冲液按照2倍比稀释的方法将CPV VP2蛋白从16.0 μg/mL连续稀释6个梯度，直到0.5 μg/mL。将各质量浓度抗原包被酶标板，每孔100 μL，每个质量浓度做3个重复；同时将大熊猫CPV阳性血清和阴性血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1600稀释。HRP标记的兔抗大熊猫IgG按照1∶1000稀释，每孔100 μL，其他按常规步骤操作。读取CPV阳性血清与阴性血清的OD450值，并分别记为P和N，计算二者的比值(P/N)，选择P/N值最大时的处理为最佳抗原包被质量浓度和血清稀释倍数。
(2) 酶标二抗稀释度的优化
以最佳抗原质量浓度包被酶标板，加入最优稀释度的阴性和阳性血清，酶标二抗(HRP标记的兔抗大熊猫IgG)与封闭液按照1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000稀释后进行孵育。判定方法同1.8.1 (1)节，选取P/N值最大时的处理为最佳二抗稀释度。
(3) 阴性和阳性血清临界值的确定
采用已建立最优的ELISA检测条件检测32份大熊猫阴性血清(血凝实验鉴定及胶体金鉴定为阴性)，每份血清重复3次，计算该32份阴性血清OD450的平均值(
$\overline X $ )和标准偏差(SD)，根据公式Cut-off值=$\overline X $ +3×SD确定阴性和阳性血清临界值，阳性血清OD450值≥Cut-off值，阴性血清OD450值<Cut-off值[8]。1.8.2 ELISA检测方法的评价
(1) 特异性检测
采用已经优化的间接ELISA方法检测大熊猫源CPV和CDV阳性血清，每个血清重复3次，读取各阳性血清的OD450值，并与阴性血清判断值比较，评价该方法的特异性。
(2) 敏感性试验
将CPV抗体阳性血清分别按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400和1∶12800稀释，每个稀释度做3个重复孔，采用已优化的间接ELISA检测方法，以OD450值大于Cut-off值时对应的最大稀释度为准[6]评价方法的敏感性。
(3) 重复性试验
将同一批次获得的CPV VP2蛋白作为包被抗原，用已经建立的间接ELISA方法检测随机抽取的2份CPV抗体阳性血清和2份CPV抗体阴性血清，每份血清做4个重复孔。读取每孔的OD450值，计算每份血清的变异系数，评价其批次内重复性。同时，将3个批次的VP2蛋白分别包被酶标板，用已经建立的间接ELISA方法检测随机抽取的2份CPV抗体阳性血清和2份CPV血清，每份血清做3个重复孔，评价批次间的重复性。
(4) 临床样品检测
采用建立的CPV抗体间接ELISA方法检测40份临床血清样品，然后用江苏酶免实业有限公司犬细小病毒抗体检测试剂盒进行复检，计算2种方法的符合率。
2. 结果与分析
2.1 CPV VP2基因扩增
利用同源臂引物进行目的基因扩增，经凝胶电泳检测获得与预期大小(1794 bp)相吻合的目的片段(图1)。
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图 1 CPV VP2基因PCR扩增注：M. DL 2000 DNA Marker；1. 扩增产物；2. 阴性对照。Figure 1. PCR amplification of CPV VP2 geneNote: 1. amplification product; 2. negative control.2.2 重组表达载体
由图2可知：菌落PCR鉴定含有约1800 bp的目的片段，质粒双酶切鉴定获得与目的片段大小(1794 bp)几乎一致的片段和线性化载体片段，重组载体测序无异常，表明成功构建原核表达载体pET-28a-VP2。将该毒株VP2序列与NCBI上选取的序列进行对比，发现该毒株与CPV-2c亲缘关系较近，两者的核苷酸同源性在98.5%~99.1%，氨基酸同源性在98.1%~99.3%。
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图 2 重组表达载体的构建和鉴定注：a) 菌落PCR鉴定：M1. DL 2000 DNA Marker，1~4. 扩增产物，5. 阴性对照；b) 双酶切鉴定：M1. DL 2000 DNA Marker，M2. DL 10000 DNA Marker，3. 双酶切产物。Figure 2. Construction and identification of recombinant expression vectorNote: a) identification by colony PCR: 1-4. amplification product, 5. negative control; b) double enzyme digestion identification: 3. product from double enzyme digestion.2.3 重组蛋白VP2的表达
SDS PAGE鉴定结果(图3)显示：包涵体中含有约70 ku的蛋白，该蛋白与预期大小一致，表明重组蛋白以包涵体的形式成功表达。
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图 3 VP2蛋白的表达鉴定注：M. 蛋白Marker；1. 空载；2. 诱导表达菌液；3. 上清液蛋白；4. 包涵体洗涤液蛋白。Figure 3. Expression identification of VP2 proteinNote: M. protein Marker; 1. no load; 2. inducible expression bacteria; 3. supernatant protein; 4. inclusion body wash protein.2.4 兔抗大熊猫IgG 酶标二抗
SDS PAGE鉴定结果(图4)显示：大熊猫CPV阳性血清成功纯化出约55 ku的大熊猫IgG，质量浓度为1.055 mg/mL；兔血清成功纯化出兔抗大熊猫IgG，质量浓度为0.980 mg/mL。Western-blot验证结果(图5)显示：大熊猫IgG能与兔抗大熊猫IgG结合，且具有良好的特异性。
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图 4 大熊猫血清IgG (a) 和兔抗大熊猫血清IgG (b) 鉴定注：M. 蛋白Marker；1. CPV阳性血清 (a) 或兔抗大熊猫IgG血清 (b)；2. 流穿液；3. 洗杂液，4. 洗脱液。Figure 4. Identification of giant panda serum IgG (a) and rabbit anti-giant panda serum IgG (b)Note: M. protein Marker; 1. CPV positive serum (a) or rabbit anti-giant panda IgG serum (b); 2. flow-through liquid; 3. washing liquid; 4. eluent liquid.![]()
图 5 大熊猫IgG免疫印迹分析注：M. 蛋白Marker；1. 大熊猫IgG；2. 猪IgG。Figure 5. Western-blot analysis of giant panda IgGNote: M. protein Marker; 1. giant panda IgG; 2. pig IgG.2.5 重组蛋白免疫印迹分析
免疫印迹分析结果(图6)显示：VP2蛋白与大熊猫CPV阳性血清结合，与阴性血清不结合；pET-28a载体蛋白与血清均不结合。证实VP2蛋白具有良好的特异性与免疫反应性。
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图 6 VP2蛋白免疫印迹分析注：a) 和c) . CPV阳性血清，b) 和d) . CPV阴性血清；M. 蛋白Marker，1. VP2蛋白，2. pET-28a载体蛋白。Figure 6. Western-blot analysis of VP2 proteinNote: a) and c). CPV positive serum, b) and d). CPV negative serum; M. protein Marker, 1. VP2 protein, 2. pET-28a carrier protein.2.6 基于VP2蛋白的间接ELISA检测方法
2.6.1 间接ELISA检测方法的条件和参数
以450 nm处CPV阳性血清与阴性血清吸光度的比值(P/N)最大为标准可知：VP2蛋白最佳包被质量浓度为2.0 μg/mL，阴性和阳性血清最佳稀释度为1∶400 (表2)；酶标二抗最佳稀释度为1∶1000 (图7)。采用建立的间接ELISA测定32份阴性血清的OD450值，经计算，平均值(
$\overline X $ )为0.128，标准差(SD)为0.043，故Cut-off值为0.258，以此为判定阴性和阳性的临界值，即所测样品OD450≥0.258时为阳性样品，OD450<0.258时为阴性样品。表 2 抗原包被质量浓度量及血清稀释倍数的优化Table 2. Optimization of the mass concentration of coated antigen and dilutions of serumρ抗原包被/(μg·mL−1)
ρcoated antigenOD450 血清稀释比
dilutions of serum1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1600 16.0 P 1.035 1.020 0.980 0.958 0.903 0.845 N 0.202 0.149 0.132 0.119 0.107 0.091 P/N 5.124 6.846 7.424 8.050 8.439 9.286 8.0 P 0.976 0.971 0.951 0.922 0.871 0.738 N 0.189 0.141 0.119 0.105 0.095 0.086 P/N 5.164 6.887 7.992 8.781 9.168 8.581 4.0 P 0.922 0.917 0.848 0.734 0.633 0.596 N 0.153 0.100 0.087 0.071 0.059 0.058 P/N 6.026 9.170 9.747 10.338 10.729 10.276 2.0 P 0.815 0.764 0.718 0.714 0.619 0.552 N 0.135 0.087 0.071 0.062 0.063 0.06 P/N 6.037 8.782 10.113 11.516 9.825 9.200 1.0 P 0.625 0.611 0.556 0.516 0.482 0.341 N 0.130 0.082 0.075 0.064 0.056 0.052 P/N 4.808 7.451 7.413 8.063 8.607 6.558 0.5 P 0.628 0.522 0.369 0.316 0.319 0.272 N 0.083 0.078 0.056 0.059 0.055 0.051 P/N 7.566 6.692 6.589 5.356 5.800 5.333 注：P. 阳性血清OD450值；N. 阴性血清OD450值。
Notes: P. OD450 value of positive serum; N. OD450 value of negative serum.2.6.2 间接ELISA检测方法的评估
特异性检测结果显示：与CPV阳性血清反应OD450值为1.045，呈阳性；与CDV阳性血清反应OD450值为0.155，呈阴性；表明该间接ELISA检测方法具有较好的特异性。由图8可知：建立的间接ELISA检测方法的敏感性可达到1∶3200。由表3可知：同批次内4份血清的变异系数均小于10% (0.562%~6.014%)，不同批次间的变异系数也均小于10% (1.666%~7.499%)，表明建立的间接ELISA检测方法具有较好的重复性。
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图 8 间接ELISA敏感性试验注：虚线为阴性和阳性的临界OD450值 (0.258)。Figure 8. Sensitivity test of indirect ELISANote: Dotted line is negative and positive critical OD450 value (0.258).表 3 间接ELISA重复性试验Table 3. Reproducibility test of indirect ELISA样本编号
sample number批次内OD450值
OD450 values of intra-batch批次间OD450值
OD450 values between batches平均值
mean value标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation平均值
mean value标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation1 0.573 0.011 2.004 0.569 0.027 4.702 2 0.642 0.004 0.562 0.613 0.010 1.666 3 0.116 0.007 6.014 0.125 0.008 6.571 4 0.107 0.001 1.264 0.111 0.008 7.499 对40份临床血清样本的检测结果显示：间接ELISA检测方法检测出阳性血清24份、阴性血清16份，酶免试剂盒检测出阳性血清21份、阴性血清19份；2种方法检测结果相同的阳性血清20份、阴性血清15份。以商业化检测试剂盒为参照，2种检测方法的阳性样本符合率为95.2%，阴性样本符合率为79.0%，总符合率为87.5%。
3. 讨论
大熊猫是中国特有野生动物，在经济和文化等方面发挥着重要作用。随着大熊猫圈养数量的不断扩大，其疾病防控备受重视。查阅相关研究文献发现：大熊猫可感染犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒和轮状病毒[9-11]，其中关于CPV感染大熊猫的报道最多，表明CPV感染大熊猫较为常见且危害严重，其防控尤为重要[12-13]。传染性疾病的主要防控手段是前期疾病监测和疫苗防控，但 CPV疫苗达不到预期的防控效果[14]，因此，急需研发具有长期保护效果的疫苗以及有针对性的大熊猫血清中CPV抗体水平检测方法[15]。
由于大熊猫物种的特殊性，不同病毒感染大熊猫后产生的阳性血清收集难度较大，本研究特异性试验中的数据并不全面，但是，利用已有阳性血清进行特异性试验的结果显示所建立的间接ELISA检测方法特异性较好，具有一定的可信度。此外，本研究的目的在于建立检测大熊猫血清中CPV抗体水平的方法；而YI等[16]在大熊猫粪便中分离出1株猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，FPV)，由于CPV与FPV VP2基因高度相似[17]，部分抗原表位可能相同，故本研究建立方法检测结果的准确性有待进一步研究。由于部分物种及样品的特殊性，在建立ELISA检测方法时，酶标二抗造成一大阻碍，因此，HRP标记抗体逐渐受到关注。ZHANG等[18]在建立戊型肝炎病毒竞争ELISA时也对单克隆抗体进行HRP标记，证实HRP标记抗体可用于ELISA检测。本研究首次制备了HRP标记兔抗大熊猫IgG抗体，并参照张焕容等[19]的方法进行纯化，再利用HRP标记试剂盒进行标记。潘广林等[7]建立的大熊猫犬瘟热抗体间接ELISA方法中，利用自制HRP标记鼠抗大熊猫[20]抗体作为二抗，证实该二抗敏感性更高，进一步表明可以利用自制HRP标记二抗作为ELISA的试验材料。但是，本研究也发现自制酶标二抗结合效率有限，目前还不能达到与商业化二抗相同的效率。从本研究建立的间接ELISA检测方法与商品化试剂盒对比结果可以看出：利用大熊猫源CPV VP2蛋白作为包被抗原建立的检测方法，其灵敏性优于利用犬源CPV建立的ELISA检测方法，说明本研究建立的检测方法更具有针对性。
4. 结论
本研究以大熊猫源CPV VP2蛋白为间接ELISA包被抗原、自制HRP标记兔抗大熊猫IgG为酶标二抗，成功建立检测大熊猫血清中CPV抗体含量的间接ELISA方法。通过重复性、敏感性和对比性试验评价，检测结果较好，说明建立的检测方法针对性较强，为检测大熊猫血清中CPV抗体提供了技术支持。
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图 1 CPV VP2基因PCR扩增
注：M. DL 2000 DNA Marker；1. 扩增产物；2. 阴性对照。
Figure 1. PCR amplification of CPV VP2 gene
Note: 1. amplification product; 2. negative control.
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图 2 重组表达载体的构建和鉴定
注：a) 菌落PCR鉴定：M1. DL 2000 DNA Marker，1~4. 扩增产物，5. 阴性对照；b) 双酶切鉴定：M1. DL 2000 DNA Marker，M2. DL 10000 DNA Marker，3. 双酶切产物。
Figure 2. Construction and identification of recombinant expression vector
Note: a) identification by colony PCR: 1-4. amplification product, 5. negative control; b) double enzyme digestion identification: 3. product from double enzyme digestion.
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图 3 VP2蛋白的表达鉴定
注：M. 蛋白Marker；1. 空载；2. 诱导表达菌液；3. 上清液蛋白；4. 包涵体洗涤液蛋白。
Figure 3. Expression identification of VP2 protein
Note: M. protein Marker; 1. no load; 2. inducible expression bacteria; 3. supernatant protein; 4. inclusion body wash protein.
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图 4 大熊猫血清IgG (a) 和兔抗大熊猫血清IgG (b) 鉴定
注：M. 蛋白Marker；1. CPV阳性血清 (a) 或兔抗大熊猫IgG血清 (b)；2. 流穿液；3. 洗杂液，4. 洗脱液。
Figure 4. Identification of giant panda serum IgG (a) and rabbit anti-giant panda serum IgG (b)
Note: M. protein Marker; 1. CPV positive serum (a) or rabbit anti-giant panda IgG serum (b); 2. flow-through liquid; 3. washing liquid; 4. eluent liquid.
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图 5 大熊猫IgG免疫印迹分析
注：M. 蛋白Marker；1. 大熊猫IgG；2. 猪IgG。
Figure 5. Western-blot analysis of giant panda IgG
Note: M. protein Marker; 1. giant panda IgG; 2. pig IgG.
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图 6 VP2蛋白免疫印迹分析
注：a) 和c) . CPV阳性血清，b) 和d) . CPV阴性血清；M. 蛋白Marker，1. VP2蛋白，2. pET-28a载体蛋白。
Figure 6. Western-blot analysis of VP2 protein
Note: a) and c). CPV positive serum, b) and d). CPV negative serum; M. protein Marker, 1. VP2 protein, 2. pET-28a carrier protein.
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图 8 间接ELISA敏感性试验
注：虚线为阴性和阳性的临界OD450值 (0.258)。
Figure 8. Sensitivity test of indirect ELISA
Note: Dotted line is negative and positive critical OD450 value (0.258).
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称
primer name引物序列 (5′→3′)
primer sequence产物大小/bp
product sizeVP2-F cagcaaatgggtcgcggatccATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC 1794 VP2-R ctcgagtgcggccgcaagcttATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAGATTTT 
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表 2 抗原包被质量浓度量及血清稀释倍数的优化
Table 2 Optimization of the mass concentration of coated antigen and dilutions of serum
ρ抗原包被/(μg·mL−1)
ρcoated antigenOD450 血清稀释比
dilutions of serum1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1600 16.0 P 1.035 1.020 0.980 0.958 0.903 0.845 N 0.202 0.149 0.132 0.119 0.107 0.091 P/N 5.124 6.846 7.424 8.050 8.439 9.286 8.0 P 0.976 0.971 0.951 0.922 0.871 0.738 N 0.189 0.141 0.119 0.105 0.095 0.086 P/N 5.164 6.887 7.992 8.781 9.168 8.581 4.0 P 0.922 0.917 0.848 0.734 0.633 0.596 N 0.153 0.100 0.087 0.071 0.059 0.058 P/N 6.026 9.170 9.747 10.338 10.729 10.276 2.0 P 0.815 0.764 0.718 0.714 0.619 0.552 N 0.135 0.087 0.071 0.062 0.063 0.06 P/N 6.037 8.782 10.113 11.516 9.825 9.200 1.0 P 0.625 0.611 0.556 0.516 0.482 0.341 N 0.130 0.082 0.075 0.064 0.056 0.052 P/N 4.808 7.451 7.413 8.063 8.607 6.558 0.5 P 0.628 0.522 0.369 0.316 0.319 0.272 N 0.083 0.078 0.056 0.059 0.055 0.051 P/N 7.566 6.692 6.589 5.356 5.800 5.333 注：P. 阳性血清OD450值；N. 阴性血清OD450值。
Notes: P. OD450 value of positive serum; N. OD450 value of negative serum.
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表 3 间接ELISA重复性试验
Table 3 Reproducibility test of indirect ELISA
样本编号
sample number批次内OD450值
OD450 values of intra-batch批次间OD450值
OD450 values between batches平均值
mean value标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation平均值
mean value标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation1 0.573 0.011 2.004 0.569 0.027 4.702 2 0.642 0.004 0.562 0.613 0.010 1.666 3 0.116 0.007 6.014 0.125 0.008 6.571 4 0.107 0.001 1.264 0.111 0.008 7.499
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