重组酶辅助扩增结合 CRISPR/Cas13a 检测禽腺病毒4型方法的建立
建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)检测方法。
将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关 Cas13a 蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a，CRISPR-Cas13a)技术相结合，针对FAdV-4 Hexon 基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA (crRNA)，利用 RAA 技术扩增样本核酸，并进行 CRISPR-Cas13a荧光检测，以qPCR为对照方法，评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。
本研究所建立的方法反应过程均在 37 ℃恒温条件下完成，反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL，灵敏度高，且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与 qPCR 检测的阳性检出率一致。
建立的RAA-Cas13a 方法检测 FAdV-4 具有简便、灵敏、特异等特点，可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。
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关键词:
- 禽腺病毒4型 /
- CRISPR/Cas13a /
- 重组酶辅助扩增 /
- 检测
Detection of Fowl Adenovirus Serotype 4 by Recombinase Aided Amplification Combined with CRISPR/Cas13a
To establish an efficient, sensitive and specific detection method for fowl adenovirus serotype 4 (FAdV-4).
Recombinase aided amplification (RAA) was used in combination with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a (CRISPR-Cas13a) to design RAA primers and CRISPR RNA (crRNA) targeting the conserved region of the FAdV-4 Hexon gene. The RAA technology was employed to amplify the sample nucleic acid, followed by CRISPR-Cas13a fluorescence detection. The established method was evaluated for sensitivity, specificity, and consistency compared to the qPCR control method.
The method established in this study was performed at 37 ℃ with a minimum amplification copy number of 101 copies/μL, it was sensitive and had no cross-reactivity with avian-derived pathogens such as FAdV-1, FAdV-7, FAdV-8b, FAdV-9, FAdV-10, avian infectious laryngotracheitis virus, infectious bursal disease virus, infectious bronchitis virus, avian influenza subtype H9, newcastle disease virus. The detection rate of 30 clinical samples by this method was consistent with that of qPCR.
The RAA-Cas13a method is simple, sensitive and specific for the detection of FAdV-4, and can be used for rapid detection and epidemiological surveillance of FAdV-4.
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在高温高湿地区的夏季，热应激是影响动物舒适程度的重要因素。过高的温度和相对湿度会扰乱自由基的稳态浓度，导致细胞和线粒体的氧化损伤，并且持续时间和严重程度决定了热应激的影响[1]。温湿度指数(temperature-humidity index, THI)主要用来反映家畜的热应激强度[2]。近年来，对热应激的研究大多集中在奶牛、兔和猪。研究表明：奶牛在THI为35~72条件下产奶量最佳，THI>72时出现热应激[3]；THI<27.80时，兔子的生长环境最舒适[4]；猪在热应激下的生长和繁殖性能都将受到危害[5]；THI>20.8会导致3周龄肉鸡出现热应激[6]。蛋鸡在热应激下生产效率下降，但是夏季蛋鸡适应的THI范围未见报道。
鸡汗腺不发达，主要通过呼吸蒸发散热，自身调节能力有限，因此夏季蛋鸡的适宜THI研究对其生产十分重要。中国南方地区夏季炎热潮湿，日平均气温高于30 ℃，相对湿度可达78%。高温应激影响蛋鸡采食量、饲料转换率、产蛋性能和免疫功能，高湿环境使鸡散热困难，降低生产性能。海兰褐蛋种鸡是美国海兰国际公司培养的四系配套蛋鸡品种，是目前国际公认的优良褐壳蛋鸡品种，具有饲料报酬高、成活率高、适应性和生产性能优越等特点，在全国很多地区均有饲养，如北京、陕西、山东、福建和海南[7]等，是中国饲养较多的褐壳蛋鸡品种之一。本研究以重庆市丰都县某场夏季的海兰褐父母代蛋种鸡为研究对象，通过研究其生长发育、孵化性能和蛋品质，分析在南方夏季海兰褐蛋种鸡适宜的THI范围，为海兰褐父母代蛋种鸡对温湿度的适应性提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验鸡舍及试验动物
重庆某蛋鸡养殖基地提供的6栋鸡舍，每栋33000羽健康海兰褐蛋种鸡，饲养管理方式相同。实行全舍饲饲养管理；本交笼笼养，每笼100羽，其中公母比例1∶10；使用意大利FACCO公司提供的环境控制设施。饲喂方法按照《海兰褐父母代饲养管理手册(2016)》[8]执行，即：0~3周龄饲料配方为粗蛋白20%、钠0.18%、钙质1.1%和磷0.5%；4~6周龄饲料配方为粗蛋白18%、钠0.18%、钙质1.1%和磷0.49%；7~12周龄饲料配方为粗蛋白16%、钠0.18%、钙质1.1%和磷0.47%；13~17周龄饲料配方为粗蛋白15.5%、钠0.18%、钙质1.1%和磷0.46%；17~30周龄饲料配方为粗蛋白18 g/d、钠0.18 g/d、钙质4.1 g/d和磷0.46 g/d，钙质颗粒大小50%。在每一栋最中间悬挂温湿度计，鸡舍外阴凉处悬挂1个温湿度计，分别测量舍内外温湿度。
1.2 环境参数和种鸡性能的测定与方法
1.2.1 环境参数
干球温度(℃)、相对湿度(%)使用“秒昕”第二代精密型自动温湿度记录仪(型号TH20R，干球温度精度±0.2 ℃，相对湿度精度±2%)记录。测定时间为6—8月，每5 min记录1次，每天的干球温度(T)和相对湿度(RH)取当天的平均值，并根据公式计算THI[2]。
THI=(1.8×T+32) −[(0.55−0.0055×RH)×(1.8×T−26)[2]，THI标准线为73[9]。
1.2.2 生长发育性能
采用第1鸡舍的母鸡和公鸡为试验材料。母鸡存栏量30000羽，公鸡存栏量3000羽。统计2018年12月28日—2019年6月27日，种鸡1、29、57、90、119、149和182 d的体质量，计算体质量均匀度和体质量变异系数，具体方法如下：
(1)体质量(g)：使用电子秤称量，每次测量母鸡150羽、公鸡50羽；
(2)体质量均匀度=(所抽样本中平均体质量上下10%范围内的鸡数/所抽样本的个体总数)×100%；
(3)体质量变异系数=(标准差/平均数)×100%。
1.2.3 产蛋性能
采用第1鸡舍的30000羽母鸡为试验材料，记录2019年5月20日—8月15日(100~210 d)的繁殖性能，包括开产日龄、产蛋率、破蛋率、总蛋数等，以分析产蛋性能。
开产日龄=鸡群日产蛋率达50%时的日龄；
产蛋率=(产蛋总数/鸡总数)×100%；
破蛋率= (破蛋数/产蛋数)×100%；
总蛋数=每栋舍每日所有鸡蛋总数。
1.2.4 孵化性能
记录6栋鸡舍共180000羽母鸡和18000羽公鸡的本交笼的受精蛋数、入孵蛋数、出雏数和健雏数，以分析种蛋孵化性能，上孵日期为2019年6—7月，上孵种蛋每批次30000枚，累计上孵次数104次。
受精率=受精蛋数/入孵蛋数×100%；
受精蛋孵化率=出雏数/受精蛋数×100%；
受精蛋健雏率=健雏数/出雏数×100%。
1.2.5 蛋品质
200日龄时，每栋收集10枚种蛋，共60枚，测量和计算以下指标：
(1)蛋形指数=长径/短径，用游标卡尺测量鸡蛋的长径与短径，mm；
(2)蛋壳强度：用蛋壳强度仪器测量，kg/cm2；
(3)蛋壳厚度：用游标卡尺测量蛋壳的钝端、中部和锐端，求取平均值，μm；
(4)蛋黄颜色：用罗氏比色扇测量；
(5)蛋黄比率=(蛋黄重/蛋重)×100%；
(6)哈氏单位：用蛋白高度测定仪测定蛋黄边缘与浓蛋白边缘的中点，测量3个点，计算平均值(单位：mm)。根据蛋重和蛋白高度，计算哈氏单位值。
哈氏单位=100×log (H−1.7W0.37+7.57)式中，H为浓蛋白高度，mm；W为蛋质量, g。
1.3 数据的统计与分析
采用Excel 2010整理数据，使用Graphpad Grim 5制作公、母鸡生长发育图，使用SPSS 19.0计算温度、湿度、THI、生产性能和孵化性能的平均值和标准差，同时分析这些因素的Pearson相关性，结果以“mean±SD”表示。
2. 结果与分析
2.1 温湿度变化
由图1可知：6—8月，舍外的整体温度、湿度和THI的平均值分别为：28.30 ℃、70.83%和78.86。其中，6月平均温度为26.94 ℃，平均湿度为74.66%，平均THI为77.30；7月平均温度为29.15 ℃，平均湿度为69.11%，平均THI为79.92；8月平均温度为29.46 ℃，平均湿度为66.71%，平均THI为80.07。由此可见，6—8月的舍外温度逐渐升高，湿度逐渐降低，THI逐渐升高，且THI均高于标准线。
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图 1 舍外和舍内环境温度和湿度波动Figure 1. Temperature and humidity fluctuations in outdoor or indoor environment6—8月，舍内的整体温度、湿度和THI的平均值分别为：25.26 ℃、85.93%和75.99。其中，6月平均温度为23.93 ℃，平均湿度为82.46%，平均THI为73.44；7月平均温度为25.54 ℃，平均湿度为87.60%，平均THI为76.61；8月平均温度为27.20 ℃，平均湿度为91.62%，平均THI为79.90。可见，6—8月的舍内温度逐渐升高，湿度逐渐升高，THI逐渐升高。6月2日—7月12日THI在73左右波动，7月13日以后大于73。舍内与舍外相比，温度整体降低了3.04 ℃，湿度整体升高了15.1%，THI整体降低了2.86。
2.2 种鸡生长发育性能
由图2可知：母鸡体质量高于《海兰褐父母代饲养管理手册(2016)》[8]中的标准体质量，0~26周体质量均匀度为(85.76±2.80)%，变异系数为(7.4±1.2)%；公鸡体质量与标准体质量相比，17周以前略重，17周以后略轻，0~26周体质量均匀度为(87.14±5.24)%，变异系数为(6.53±0.63)%。
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图 2 种鸡体质量、体质量均匀度和变异系数Figure 2. Body mass, body mass uniformity and coefficient of variation for breeders2.3 高温高湿下种鸡的产蛋性能和孵化性能
种鸡产蛋率达到50%时为140日龄。种鸡平均产蛋率(93.93±3.40)%，破蛋率(0.50±0.20)%，蛋总数(27192±941)枚；受精蛋的平均受精率(94.49±2.70)%，孵化率(91.20±2.90)%，健雏率(92.51±2.70)%。
2.4 鸡舍内部温、湿度与种鸡产蛋性能和孵化性能的相关性
由表1可知：温度与产蛋率、湿度与产蛋率和蛋总数、THI与产蛋率均呈极显著正相关(P<0.01)；温度、湿度和THI均与破蛋率呈极显著负相关(P<0.01)。
表 1 鸡舍内部温、湿度与种鸡产蛋性能和孵化性能的相关性Table 1. Correlation analysis of temperature and humidity in indoor environment with reproductive performances of breeders性状
traits温度/℃
temperature湿度/%
humidityTHI 产蛋率/%
laying rate0.296** 0.501** 0.339** 破蛋率/%
broken egg rate−0.469** −0.543** −0.526** 蛋总数
total egg number0.163 0.392** 0.198 受精率/%
fertilization rate−0.168 0.062 −0.150 受精蛋健雏率/%
hatchability of fertilized eggs−0.141 −0.031 −0.143 受精蛋出雏率/%
healthy chick rate of fertilized egg−0.187 −0.016 −0.185 注：“**”表示极显著相关(P<0.01)。
Note: “**” indicates significant correlation (P<0.01).2.5 海兰褐壳蛋种鸡蛋品质
由表2可知：蛋形指数的变异系数在5%以内；蛋壳强度的变异系数大于10%；蛋质量、蛋黄质量、蛋壳厚度、蛋黄色、蛋壳质量、蛋黄比率和哈氏单位的变异系数为5%~10%。
表 2 海兰褐壳蛋种鸡200日龄蛋品质Table 2. Egg quality of Hy-line layer at 200-day old性状
traits数值
value变异系数/%
CV蛋质量/g egg weight 59.21±3.93 6.64 蛋形指数 egg shape index 1.28±0.04 2.77 蛋壳强度/(kg·cm−2) eggshell strength 5.45±0.87 16.03 蛋黄质量/g yolk weight 16.42±1.17 7.15 蛋壳厚度/mm eggshell thickness 0.39±2.39 6.15 蛋黄色 yolk color 6.10±1.04 7.12 蛋壳质量/g shell weight 7.58±0.64 8.44 蛋黄比率/% yolk ratio 27.78±1.85 6.65 哈氏单位 Haugh unit 80.42±4.61 5.73 3. 讨论
蛋鸡产蛋期间最适宜的温度范围一直以来有不同的研究结果，包括13~23 ℃、15~25 ℃和14~25 ℃等[10]，蛋鸡舍内最适宜的相对湿度为60%~70%[11]。本试验经过湿帘的降温过程是等焓降温过程，一般情况下，通过湿帘后空气每降低1 ℃，湿度将增加约4%~5%[12]。THI综合了温度和湿度，一般认为THI<72时，动物适应良好；THI>72时，动物有热应激反应；73≤THI<79时，动物体质量增长率下降；79≤THI<84时，动物可能死亡[9]。本试验从6月2日持续到8月15日。与舍外相比，舍内环境使用了有效的环境控制设施，使温度降低，湿度升高，THI值降低。在这种环控设施下，鸡舍内部环境THI值基本在73以上，7月中旬以后达到80，并持续到试验结束。从鸡群的日常活动和生产数据表现来看，室内环境的THI值控制在73~80比较适宜。
在本试验温湿度环境下，海兰褐母鸡和17周龄前公鸡的体质量高于标准体质量，17周龄后的公鸡体质量比标准体质量略低。李贵霞等[13]研究发现：体质量在群体平均体质量90%~120%的鸡具有适宜的开产日龄和产蛋期蛋质量。本试验海兰褐蛋种鸡体质量的变异系数和均匀度符合其分别应小于10%和大于80%的标准[14]，故本试验蛋鸡育成期整体和个体体质量控制良好。
本试验群体的开产日龄比《海兰褐父母代饲养管理手册(2016)》[8]标准开产日龄147 d早7 d，在本试验温湿度环境下，可以增加鸡群产蛋量。变异系数说明所得数据之间的相对变异程度，200日龄海兰褐蛋种鸡所产鸡蛋蛋形指数的变化较小，而蛋壳强度的变化较大。本试验的产蛋率为93.93%，已知海兰褐蛋种鸡产蛋高峰的产蛋率能达到93.12%[15]，刁华杰等[16]选取28周龄的海兰褐蛋种鸡在温度21 ℃、湿度60%的环控舱中的产蛋率为87.65%；吕梅等[17]在夏季高温多雨的山东对海兰褐蛋种鸡进行半开放式鸡舍的中型笼养试验，产蛋率为83.75%；这表明本试验在重庆高温高湿地区的产蛋率高。生产中破蛋率一般在2%~5%，吕梅等[17]研究中的破蛋率为0.63%，而本次试验破蛋率仅为0.50%，说明本试验海兰褐蛋种鸡的孵化性能良好。此外，本研究的受精率和受精蛋孵化率比河北地区23~29周龄的海兰褐蛋鸡[18]高。蛋品质中，蛋壳强度和蛋壳厚度达到《海兰褐父母代饲养管理手册(2018)》[19]28周龄蛋壳强度标准4.56 kg/cm2和蛋壳厚度标准0.37 mm；根据标准哈氏单位评级[20]，本试验鸡蛋为AA级；早期蛋形指数为1.28，与唐修君等[21]的研究结果一致；蛋黄颜色正常[22]；蛋黄比率为27.78%，比一般鸡蛋的30%[23]要低。
4. 结论
本试验在温度22.07~30.51 ℃、湿度73.02%~93.20%和THI 70.70~82.46条件下，三者均与产蛋率呈极显著正相关，且生产性能、孵化性能和蛋品质表现良好，表明海兰褐蛋种鸡的适宜THI值上限可延伸至82.46。
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图 3 RAA-Cas13a 特异性试验结果
注：ILTV. 鸡传染性喉气管炎病毒；IBDV. 传染性法氏囊病毒；IBV. 传染性支气管炎病毒; NDV. 新城疫病毒；AIV-H9. 禽流感H9亚型；FAdV. 禽腺病毒。
Figure 3. Specificity detection results of RAA-Cas13a
Note: ILTV. avian infectious laryngotracheitis virus; IBDV. infectious bursal disease virus; IBV. infectious bronchitis virus; NDV. newcastle disease virus; AIV-H9. avian influenza subtype H9; FAdV. fowl adenovirus.
表 1 FAdV-4 crRNA 引物序列
Table 1 Primer sequences of FAdV-4 crRNA
引物名称
primer name引物序列 (5′→3′)
primer sequencescrRNA1-F GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACAAAACATCCATGATCCAGTAGGGGGTCTGCGTG crRNA1-R CACGCAGACCCCCTACTGGATCATGGATGTTTTGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC crRNA2-F GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCACGTTCATGCCCGAACGCTCCGAGTT crRNA2-R AACTCGGAGCGTTCGGGCATGAACGTGGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC crRNA3-F GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCTGACCGCAGAGCGGGTACGGCCAGTT crRNA3-R AACTGGCCGTACCCGCTCTGCGGTCAGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC 
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