高良姜中具有神经保护作用的化学成分研究
Study on Chemical Constituents with NeuroprotectiveEffects from Alpinia officinarum Hance
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中药高良姜为姜科(Zingiberacea)山姜属(Alpinia Roxb.)植物高良姜 (Alpinia officinarum Hance) 的干燥根茎，始记载于《名医别录》[1]，又名高凉姜 [2]。现主要分布于海南、广东和广西等省区[3]。高良姜性辛、热，归脾、胃经，具有散寒止痛、温胃止呕等功效[4]。现代药理学研究表明：高良姜具有神经保护[5]、抗炎[6]、抗菌[7]、抗胃肠道疾病[8]、抗肿瘤[9]和抗氧化[10]等作用，主要含有二苯基庚烷类[11]、黄酮类[12]和挥发油[13]等化学成分。高良姜用途广泛且资源丰富，其发挥作用的物质基础具有巨大的研究开发潜力。本课题组长期致力于研究开发天然来源的神经保护剂[14-15]，前期研究发现高良姜的乙醇提取物对H2O2损伤SH-SY5Y细胞具有较好的神经保护作用。为了揭示高良姜的神经保护活性成分，本研究对高良姜的化学成分进行研究，以期在明晰化合物的基础上评价其神经保护作用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
高良姜根茎于2021年3月购自云南省昆明市药材市场，由云南中医药大学张荣平教授鉴定，标本(No. 2021-0317)储藏于云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室。
1.2 主要仪器、设备和试剂
Bruker AV-600 MHz、AV-400 MHz超导核磁共振波谱仪(德国Bruke公司)；Agilent1290 UPLC/6545 Q-TOF质谱仪(安捷伦科技有限公司)；NS4205制备型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限科技)；Basic C18柱(填料粒径5 μm，直径10 mm，长250 mm，北京赛谱锐思科技有限公司)；GF254薄层色谱板(青岛海洋化工有限公司)；MCI CHP-20P GEL (日本三菱化学公司)；Sephadex LH20 (Pharmacia公司)。DMEM/F12培养基(北京伊诺凯有限公司)；FBS胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司)；CCK8试剂盒(上海泰坦科技股份有限公司)。色谱级甲醇和乙腈购自安徽泽升科技有限公司，其余试剂由工业级试剂重蒸制得。
1.3 试验方法
1.3.1 提取与分离
取高良姜干燥根茎20.0 kg粉碎，在室温下用70%乙醇冷浸提取3次，每次提取7 d、100 L。合并提取液，减压浓缩至小体积，分散于等体积水中，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到乙酸乙酯部分和水部分。将乙酸乙酯部分 (960.0 g)进行硅胶柱层析，以石油醚—丙酮 (98∶2、95∶5、90∶10、80∶20和70∶30，V/V) 进行梯度洗脱，得到Fr.1~Fr.4。
Fr.1 (61.0 g) 进行硅胶柱层析，以石油醚—乙酸乙酯 (98∶2→90∶1，V/V) 进行梯度洗脱得到Fr.1-1~Fr.1-2。Fr.1-2 (10.0 g) 通过凝胶柱色谱和制备薄层色谱分离得到化合物12 (5.0 mg)、14 (7.0 mg) 和22 (10.0 mg)。
Fr.2 (142.0 g) 经硅胶柱色谱，以石油醚—乙酸乙酯 (95∶5→80∶20，V/V) 梯度洗脱得到Fr.2-1~Fr.2-3。Fr.2-2 (7.0 g) 通过凝胶柱层析，用甲醇洗脱得到化合物3 (5.1 g)、6 (15.0 mg) 和9 (6.0 mg)。Fr.2-3 (20.0 g) 经MCI柱层析，用甲醇—水 (60∶40→100∶0，V/V) 梯度洗脱得到Fr.2-3-1~Fr.2-3-2。Fr.2-3-1 (300.0 mg) 经制备型液相柱色谱分离得到化合物13 (8.0 mg)、19 (40.0 mg)、20 (7.5 mg) 和21 (5.0 mg)。
Fr.3 (319.0 g) 经硅胶柱色谱，以石油醚—乙酸乙酯 (90:10→70:30，V/V) 梯度洗脱得到Fr.3-1~Fr.3-3 (155.0 g)。Fr.3-1 (201.0 g) 反复重结晶得到化合物1 (55.6 g)、2 (132.6 g) 和10 (3.2 g)；其母液经凝胶柱色谱，用甲醇洗脱得到化合物11 (10.0 mg) 和15 (20.0 mg)。
Fr.4 (202.0 g) 经MCI柱层析，用甲醇—水(30∶70→50∶50，V/V) 梯度洗脱得到Fr.4-1~Fr.4-3。Fr.4-3 (23.0 g) 经RP-18柱，用甲醇—水 (50∶50→70∶30，V/V) 梯度洗脱，得到Fr.4-3-1~Fr.4-3-2。Fr.4-3-1 (10.5 g) 依次经凝胶柱层析、制备薄层色谱板分离得到化合物4 (40.0 mg)、5 (10.0 mg)、7 (15.0 mg) 和8 (8.0 mg)。Fr.4-3-2 (10.5 g) 依次经硅胶柱色谱和凝胶柱色谱得到化合物16 (10.0 mg)、17 (13.1 mg) 和18 (15.2 mg)。
1.3.2 高良姜化学成分的神经保护作用活性筛选
在研究高良姜化学成分的神经保护作用之前，先确定化学成分对神经细胞的毒性，因此，先将各化合物作用于无损伤的神经细胞上，评价其神经细胞毒性。使用CCK-8法评价各成分的神经保护活性。将细胞分为对照组、H2O2组和样品组，其中对照组分为空白对照组和溶剂对照组[ 没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)]，样品组分为样品A组(用于评价化合物的细胞毒性)和样品B组(用于评价化合物的神经保护作用)。样品A组：只加不同浓度样品，不加H2O2；样品B组：先加不同浓度样品，再加H2O2。选择增殖活跃并处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1×104 mL−1的密度接种于96孔细胞培养板上。对照组为正常培养的SH-SY5Y细胞；H2O2组细胞正常培养24 h后，弃去旧培养基，用300 μmol/L H2O2处理24 h；样品A组用低、中、高 (5、10和20 μmol/L)浓度的药物处理2 h；样品B组用低、中、高(5、10和20 μmol/L)浓度的药物预处理2 h后，再用300 μmol/L H2O2处理24 h。之后将各组细胞培养基更换为孔中含有10% CCK-8的DMEM。孵育2 h后，使用酶标仪在450 nm处读取每个孔的吸光度值(A)，计算各组细胞存活率：细胞存活率=(A样品组−A空白对照组)/(A溶剂对照组−A空白对照组)×100%。试验重复3次。
2. 结果与分析
2.1 化合物结构鉴定
从高良姜中共分离鉴定了22种化合物，其结构如图1 所示。
化合物1： 黄色粉末， C16H12O6， HR-ESI-MS，m/z 323.0523 [M+Na]+ (计算值 323.0526)。1H NMR (600 MHz, DMSO) δH: 12.43 (1H, s, 5-OH), 10.79 (1H, s, 7-OH), 9.50 (1H, s, 3-OH), 8.11 (2H, d, J = 4.5 Hz, H-2′/H-6′), 7.07 (2H, d, J = 4.9 Hz, H-3′/H-5′), 6.44 (1H, s, H-8), 6.18 (1H, s, H-6), 3.82 (3H, s, 4′-OCH3) . 13C NMR (150 MHz, DMSO) δC: 146.3 (s, C-2), 136.1 (s, C-3), 176.0 (s, C-4), 156.3 (s, C-5), 98.3 (d, C-6), 164.0 (s, C-7), 93.6 (d, C-8), 160.7 (s, C-9), 103.1 (s, C-10), 123.3 (s, C-1′), 129.4 (d, C-2′), 114.1 (d, C-3′), 160.5 (s, C-4′), 114.1 (d, C-5′), 129.4 (d, C-6′) , 55.4 (q, 4′-OCH3)。以上波谱数据与文献[16]基本一致，故鉴定该化合物为山柰素-4′-甲醚。
化合物2： 黄色粉末， C15H10O5， HR-ESI-MS，m/z 271.0639 [M+H]+ (计算值 271.0601)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 8.18 (2H, m, H-2′/H-6′), 7.49 (2H, dd, J = 8.4, 6.8 Hz, H-3′/H-5′), 7.44 (1H, m, H-4′), 6.40 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 146.9 (s, C-2), 138.5 (s, C-3), 177.7 (s, C-4), 162.6 (s, C-5), 99.4 (d, C-6), 165.9 (s, C-7), 94.5 (d, C-8), 158.4 (s, C-9), 104.7 (s, C-10), 132.6 (s, C-1′), 129.4 (d, C-2′), 128.7 (d, C-3′), 130.9 (d, C-4′), 128.7 (d, C-5′), 129.4 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为高良姜素。
化合物3： 黄色粉末， C15H10O6，HR-ESI-MS，m/z 287.0554 [M+H]+ (计算值287.0550)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 8.09 (2H, m, H-2′/H-6′), 6.91 (2H, m, H-3′/H-5′), 6.39 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 148.0 (s, C-2), 137.1 (s, C-3), 177.4 (s, C-4), 162.5 (s, C-5), 99.3 (d, C-6), 165.6 (s, C-7), 94.5 (d, C-8), 158.2 (s, C-9), 104.5 (s, C-10), 123.7 (s, C-1′), 130.7 (d, C-2′), 116.3 (s, C-3′), 160.5 (s, C-4′), 116.3 (d, C-5′), 130.7 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[18]基本一致，故鉴定该化合物为山柰酚。
化合物4： 黄色粉末， C17H16O7，HR-ESI-MS，m/z 353.0614 [M+Na]+ (计算值353.0632)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.64 (1H, dd, J = 8.6, 2.2 Hz, H-6′), 7.60 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2′), 7.07 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 3.94 (3H, s, 4′-OCH3), 3.79 (3H, s, 3-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 157.6 (s, C-2), 139.9 (s, C-3), 180.1 (s, C-4), 163.1 (s, C-5), 99.8 (d, C-6), 166.0 (s, C-7), 94.7 (d, C-8), 158.5 (s, C-9), 105.9 (s, C-10), 124.2 (s, C-1′), 116.2 (d, C-2′), 147.7 (s, C-3′), 151.7 (s, C-4′), 112.4 (d, C-5′), 122.1 (d, C-6′), 60.6 (q, 3-OCH3), 56.4 (q, 4′-OCH3) 。以上波谱数据与文献[19]基本一致，故鉴定该化合物为3,4′-甲氧基-3′,5,7-三羟基黄酮。
化合物5：黄色粉末，C16H12O6, HR-ESI-MS，m/z 299.0598 [M−H]−(计算值299.0561)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 8.00 (2H, d, J = 2.8 Hz, H-2′/H-6′), 6.94 (2H, m, H-3′/H-5′), 6.42 (1H, s, H-8), 6.22 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-6), 3.79 (3H, s, 3′-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 158.5 (s, C-2), 139.5 (s, C-3), 180.0 (s, C-4), 163.1 (s, C-5), 99.8 (d, C-6), 166.0 (s, C-7), 94.8 (d, C-8), 158.5 (s, C-9), 105.9 (s, C-10), 122.6 (s, C-1′), 131.4 (d, C-2′), 116.6 (d, C-3′), 161.7 (s, C-4′), 116.6 (d, C-5′), 131.4 (d, C-6′), 66.7 (q, 3′-OCH3)。以上波谱数据与文献[20]基本一致，故鉴定该化合物为山柰酚-3-甲醚。
化合物6：黄色粉末，C19H22O6，HR-ESI-MS，m/z 369.1297 [M+Na]+ (计算值369.1309)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.06 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2′), 7.01 (1H, dd, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′), 6.17 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 6.09 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 4.90 (1H, m, H-2), 4.21 (1H, m, H-3), 3.89 (6H, s, 3′-OCH3/4′-OCH3), 3.76 (6H, s, 5-OCH3/7-OCH3), 2.87 (2H, m, H-4). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 78.4 (d, C-2), 66.3 (d, C-3), 28.1 (t, C-4), 159.2 (s, C-5), 93.3 (d, C-6), 159.6 (s, C-7), 92.0 (d, C-8), 155.2 (s, C-9), 100.3 (s, C-10), 130.9 (s, C-1′), 112.2 (d, C-2′), 149.0 (s, C-3′), 149.0 (s, C-4′), 109.7 (d, C-5′), 118.6 (d, C-6′), 55.9 (q, 3′-OCH3), 55.3 (q, 5-OCH3/7-OCH3/4′-OCH3)。以上波谱数据与文献[21]基本一致，故鉴定该化合物为5,7,3′,4′-四甲氧基儿茶素。
化合物7：白色粉末，C15H12O6，HR-ESI-MS，m/z 289.0709 [M+H]+ (计算值 289.0707)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.31 (2H, d, J = 2.1 Hz, H-2′/H-6′), 6.80 (2H, m, H-3′/H-5′), 5.88 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-8), 5.83 (1H, s, H-6), 4.93 (1H, m, H-2), 4.48 (1H, d, J = 11.6, 1.4 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 85.3 (d, C-2), 73.9 (d, C-3), 198.8 (s, C-4), 165.6 (s, C-5), 97.6 (d, C-6), 169.1 (s, C-7), 96.6 (d, C-8), 164.9 (s, C-9), 102.1 (s, C-10), 129.6 (s, C-1′), 130.6 (d, C-2′), 116.4 (d, C-3′), 159.5 (s, C-4′), 116.4 (d, C-5′), 130.6 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[22]基本一致，故鉴定该化合物为二氢山柰酚。
化合物8：黄色粉末，C15H12O5, HR-ESI-MS，m/z 271.0716 [M−H]− (计算值271.0612)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.32 (2H, m, H-2′/H-6′), 6.82 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3′/H-5′), 5.88 (2H, s, H-6/H-8), 5.34 (1H, m, H-2), 3.11 (1H, m, H-3a), 2.69 (1H, m, H-3b). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 80.4 (d, C-2), 44.0 (t, C-3), 197.5 (s, C-4), 165.4 (s, C-5), 96.4 (d, C-6), 169.3 (s, C-7), 96.5 (d, C-8), 164.9 (s, C-9), 103.1 (s, C-10), 131.2 (s, C-1′), 129.0 (d, C-2′), 116.3 (d, C-3′), 159.0 (s, C-4′), 116.3 (d, C-5′), 129.0 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[23]基本一致，故鉴定该化合物为柚皮素。
化合物9：白色粉末，C15H12O4, HR-ESI-MS，m/z 255.0721 [M−H]− (计算值255.0663)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.43 (2H, d, J = 6.5 Hz, H-2′/H-6′), 7.38 (3H, m, H-3′/H-4′/H-5′), 6.01 (2H, s, H-6/H-8), 5.38 (1H, d, J = 13.0, 3.0 Hz, H-2), 3.04 (1H, dd, J = 17.2, 13.0 Hz, H-3a), 2.78 (1H, m, H-3b). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 79.2 (d, C-2), 43.4 (t, C-3), 195.8 (s, C-4), 164.3 (s, C-5), 96.9 (d, C-6), 166.2 (s, C-7), 95.8 (d, C-8), 163.2 (s, C-9), 102.9 (s, C-10), 138.5 (s, C-1′), 126.3 (d, C-2′), 128.9 (d, C-3′), 128.9 (d, C-4′), 128.9 (d, C-5′), 126.3 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[24]基本一致，故鉴定该化合物为乔松素。
化合物10：黄色粉末，C15H13O5，HR-ESI-MS，m/z 271.0590 [M−H]− (计算值271.0612)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.53 (2H, m, H-2′/H-6′), 7.41 (3H, m, H-3′/H-4′/H-5′), 5.94 (1H, s, H-8), 5.90 (1H, s, H-6), 5.07 (1H, dd, J = 11.6, 2.0 Hz, H-2), 4.54 (1H, dd, J = 11.5, 1.9 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 85.0 (d, C-2), 73.7 (d, C-3), 197.9 (s, C-4), 164.4 (s, C-5), 96.6 (d, C-6), 169.6 (s, C-7), 97.7 (d, C-8), 165.3 (s, C-9), 101.6 (s, C-10), 138.6 (s, C-1′), 128.9 (d, C-2′), 129.4 (d, C-3′), 129.9 (d, C-4′), 129.4 (d, C-5′), 128.9 (d, C-6′)。以上波谱数据与文献[25]基本一致，故鉴定该化合物为环氧松属素查尔酮。
化合物11：无色油状物，C15H22O2，HR-ESI-MS，m/z 235.1682 [M+H]+ (计算值235.1693)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 4.91 (1H, d, J = 1.3 Hz, H-12a), 4.81 (1H, s, H-12b), 3.11 (1H, m, H-6a), 2.56 (1H, m, H-2a), 2.40 (2H, m, H-2b/H-6b), 1.95 (1H, m, H-8a), 1.85 (1H, dd, J = 13.9, 3.5 Hz, H-8b), 1.83 (3H, d, J = 1.7 Hz, H-15), 1.78 (3H, d, J = 1.3 Hz, H-13), 1.74 (2H, m, H-1), 1.51 (1H, m, H-9a), 1.34 (1H, m, H-9b), 1.26 (3H, s, H-14). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 37.4 (t, C-1), 33.9 (t, C-2), 198.9 (s, C-3), 129.2 (s, C-4), 161.4 (s, C-5), 40.3 (t, C-6), 76.6 (s, C-7), 31.3 (t, C-8), 37.8 (t, C-9), 35.3 (s, C-10), 147.4 (s, C-11), 113.6 (t, C-12), 18.5 (q, C-13), 23.3 (q, C-14), 11.2 (q, C-15)。以上波谱数据与文献[26]基本一致，故鉴定该化合物为(4aS,7S)-7-hydroxy-1,4a-dimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-4,4a,5,6,7,8-hexahydronaphthalen-2(3H)-one。
化合物12：无色油状物，C15H18。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.92 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-1/H-4), 7.35 (1H, dd, J = 8.5, 1.8 Hz, H-2), 7.28 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-7), 7.22 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-8), 3.72 (1H, m, H-11), 2.65 (3H, s, H-14), 2.56 (3H, s, H-15), 1.26 (3H, s, H-12), 1.26 (3H, s, H-13). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 124.9 (d, C-1), 127.4 (d, C-2), 134.9 (s, C-3), 123.1 (d, C-4), 131.7 (s, C-5), 142.3 (s, C-6), 121.6(d, C-7), 125.7(d, C-8), 132.0 (s, C-9), 131.2 (s, C-10), 28.4 (d, C-11), 23.8 (q, C-12), 23.8 (q, C-13), 19.6 (q, C-14), 22.2 (q, C-15)。以上波谱数据与文献[27]基本一致，故鉴定该化合物为4-异丙基-1,6-二甲基萘。
化合物13： 白色粉末， C20H30O2， HR-ESI-MS，m/z 303.2317 [M+H]+ (计算值303.2319)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 9.33 (1H, s, H-17), 6.79 (1H, m, H-12), 5.65 (1H, dd, J = 5.2, 2.6 Hz, H-7), 3.68 (1H, m, H-15), 2.79 (1H, m, H-11a), 2.53 (1H, s, H-9), 2.39 (1H, m, H-16a), 2.30 (1H, m, H-11b), 2.26 (2H, m, H-14), 2.13 (2H, m, H-6a/H-16b), 1.93 (1H, m, H-6b), 1.86 (1H, m, H-1a), 1.56 (2H, m, H-2), 1.44 (1H, m, H-3a), 1.32 (1H, m, H-5), 1.18 (1H, m, H-3b), 0.99 (1H, m, H-1b), 0.98 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19), 0.78 (3H, s, H-20).13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 39.6 (t, C-1), 19.0 (t, C-2), 42.1 (t, C-3), 33.2 (s, C-4), 50.2 (d, C-5), 24.4 (t, C-6), 128.8 (d, C-7), 132.3 (s, C-8), 51.0 (d, C-9), 36.6 (s, C-10), 31.0 (t, C-11), 157.7 (d, C-12), 139.0 (s, C-13), 29.9 (t, C-14), 69.8 (d, C-15), 41.3 (t, C-16), 195.0 (s, C-17), 21.8 (q, C-18), 33.3 (q, C-19), 13.3 (q, C-20)。以上波谱数据与文献[28]基本一致，故鉴定该化合物为curcuminol D。
化合物14：无色油状物，C18H24O, HR-ESI-MS，m/z 257.1882 [M+H]+(计算值257.1900)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.18 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-10/H-14), 6.70 (2H, d, J = 6.6 Hz, H-11/H-13), 6.22 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-8), 6.01 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-7), 5.89 (1H, s, H-16), 5.00 (1H, m, H-3), 4.86 (2H, m, H-17), 1.95 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 1.65 (3H, d, J = 1.6 Hz, H-18), 1.56 (3H, d, J = 1.4 Hz, H-1), 1.46 (2H, m, H-4), 1.17 (3H, s, H-15). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 17.7 (q, C-1), 132.0 (s, C-2), 126.0 (d, C-3), 24.4 (t, C-4), 42.6 (t, C-5), 43.5 (s, C-6), 126.0 (d, C-7), 135.7 (d, C-8), 131.9 (s, C-9), 128.2 (d, C-10), 116.3 (d, C-11), 157.7 (s, C-12), 116.3 (d, C-13), 128.2 (d, C-14), 23.9 (q, C-15), 147.4 (d, C-16), 112.2 (t, C-17), 25.9 (q, C-18)。以上波谱数据与文献[29]基本一致，故鉴定该化合物为补骨脂酚。
化合物15：白色粉末，C10H10O4，HR-ESI-MS，m/z 195.0467 [M+H]+ (计算值195.0652)。1H NMR (600 MHz, CD3OD) δH: 7.58 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-7), 7.09 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-8), 4.55 (2H, m, H-3/H-4), 1.48 (3H, d, J = 5.6 Hz, 3-CH3). 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 170.2 (s, C-1), 81.6 (d, C-3), 69.5 (d, C-4), 144.1 (s, C-5), 117.7 (d, C-6), 137.8 (d, C-7), 117.8 (d, C-8), 162.9 (s, C-9), 108.0 (s, C-10) , 18.2 (q, 3-CH3)。以上波谱数据与文献[30]基本一致，故鉴定该化合物为(3R,4S)-4羟基蜂蜜曲霉素。
化合物16：无色油状物，C20H22O6，HR-ESI-MS，m/z 381.1331 [M+Na]+ (计算值381.1309)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 6.90 (2H, m, H-2/H-2′), 6.88 (2H, m, H-5/H-5′), 6.82 (2H, d, J = 8.1, 1.7 Hz, H-4/H-4′), 4.73 (2H, m, H-7/H-7′), 4.25 (2H, dd, J = 9.0, 6.1 Hz, H-9a/H-9′a), 3.91 (6H, s, 3-OCH3/3′-OCH3), 3.87 (3H, m, H-9b/H-9b′), 3.10 (2H, t, J = 5.2 Hz, H-8/H-8′). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 133.1 (s, C-1/C-1′), 108.7 (d, C-2/C-2′), 146.8 (s, C-3/C-3′), 119.1 (d, C-4/C-4′), 114.4 (d, C-5/C-5′), 145.4 (s, C-6/C-6′), 86.0 (d, C-7/C-7′), 54.3 (s, C-8/C-8′), 71.8 (t, C-9/C-9′) , 56.1 (s, 3-OCH3/3′-OCH3)。以上波谱数据与文献[31]基本一致，故鉴定该化合物为相对-(3R,3′S,4R,4′S)-3,3′,4,4′-四氢-6,6′-二甲氧基(3,3′-双-2H-苯并吡喃) -4,4′-二醇。
化合物17：白色粉末，C8H8O5，HR-ESI-MS，m/z 185.0433 [M+H]+ (计算值185.0444)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 5.86 (2H, s, H-3/H-5), 3.95 (3H, s, 7-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 94.2 (s, C-1), 96.4 (s, C-2), 164.0 (d, C-3), 166.2 (s, C-4), 164.0 (d, C-5), 96.4 (s, C-6), 171.6 (s, C-7), 52.7 (q, 7-OCH3)。以上波谱数据与文献[32]基本一致，故鉴定该化合物为2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯。
化合物18：淡黄色油状物，C11H14O3，HR-ESI-MS，m/z 195.1003 [M+H]+ (计算值195.1016)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 6.82 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5′), 6.67 (2H, m, H-2′/H-6′), 3.87 (3H, d, J = 3.1 Hz, 3′-OCH3), 2.82 (2H, m, H-4), 2.73 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 29.6 (q, C-1), 208.5 (s, C-2), 45.7 (t, C-3), 30.3 (t, C-4), 133.1 (s, C-1′), 111.2 (d, C-2′), 146.5 (s, C-3′), 144.0 (s, C-4′), 114.5 (d, C-5′), 120.9 (d, C-6′), 56.0 (q, 3′-OH3)。以上波谱数据与文献[33]基本一致，故鉴定该化合物为4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丁酮。
化合物19：无色油状物，C11H14O2，HR-ESI-MS，m/z 179.0906 [M+H]+ (计算值179.1067)。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.71 (2H, dd, J = 5.7, 3.2 Hz, H-3′/H-7′), 7.52 (2H, d, J = 5.8, 3.3 Hz, H-4′/H-6′), 7.26 (1H, m, H-5′), 4.30 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-1), 1.71 (2H, m, H-2), 1.44 (2H, m, H-3), 0.96 (3H, d, J = 7.6 Hz, H-4). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 65.7 (t, C-1), 30.7 (t, C-2), 19.3 (t, C-3), 13.9 (q, C-4), 167.9 (s, C-1′), 131.1 (s, C-2′), 129.0 (d, C-3′), 129.0 (d, C-4′), 132.4 (d, C-5′), 129.0 (d, C-6′), 129.0 (d, C-7′)。以上波谱数据与文献[34]基本一致，故鉴定该化合物为苯甲酸丁酯。
化合物20：白色粉末，C8H8O3。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 9.83 (1H, s, H-7), 7.42 (2H, d, J = 6.0 Hz, H-2/H-6), 7.04 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 3.97 (3H, s, 3-OCH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 130.1 (s, C-1), 108.9 (d, C-2), 147.3 (s, C-3), 151.8 (s, C-4), 114.5 (d, C-5), 127.7 (d, C-6), 191.0 (s, C-7), 56.3 (q, 3-OCH3)。以上波谱数据与文献[35]基本一致，故鉴定该化合物为香草醛。
化合物21：无色油状物，C9H10O。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 7.54 (2H, d, J = 3.3 Hz, H-2/H-6), 6.95 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5), 3.96 (3H, s, 3-OCH3), 2.56 (3H, s, H-8). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 130.3 (s, C-1), 109.7 (d, C-2), 150.5 (s, C-3), 146.8 (s, C-4), 56.2 (q, 3-OCH3), 113.9 (d, C-5), 124.2 (d, C-6), 196.9 (s, C-7), 26.4 (q, C-8)。以上波谱数据与文献[36]基本一致，故鉴定该化合物为香草乙酮。
化合物22：白色粉末，C17H34O2。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH: 2.34 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2), 1.61 (2H, d, J = 7.4 Hz, H-3), 1.26 (26H, m, H-4~H-16), 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-17). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 180.5 (s, C-1), 34.3 (t, C-2), 32.1 (t, C-3), 22.9~29.9 (t, C-4~C-16), 14.3 (q, C-17)。以上波谱数据与文献[37]基本一致，故鉴定该化合物为十七烷酸。
2.2 高良姜化学成分的神经保护作用
2.2.1 细胞毒性筛选
由于化合物19的含量太少，故未对其细胞毒性和神经保护作用进行研究。
由图2可知：浓度为5、10和20 μmol/L时，化合物2、3、4、16和20对SH-SY5Y细胞有一定的毒性，其他化合物在低、中、高剂量下的细胞存活率较对照组无显著差异，说明大部分化合物对SH-SY5Y细胞无毒性。可见，H2O2损伤SH-SY5Y细胞模型适合用于评价高良姜化合物的神经保护作用。
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图 2 化合物1~18和20~22对SH-SY5Y细胞的毒性注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。Figure 2. Cytotoxicities of compounds 1-18 and 20-22 on SH-SY5Y cellsNote: Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.2.2.2 神经作用保护评价
由图3可知：H2O2组与对照组相比细胞存活率相差较大，说明H2O2损伤的神经细胞造模成功。与H2O2组的细胞存活率相比，受损细胞在低、中、高浓度的化合物1、7和18作用后细胞存活率显著提高，且对神经细胞没有毒性。说明这3种化合物具有较强的神经保护活性且细胞毒性较低。
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图 3 化合物1~18和20~22对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的神经保护作用注：与H2O2组比较，*P<0.05，**P<0.01。Figure 3. Neuroprotective effects of compounds 1-18 and 20-22 on the H2O2-induced SH-SY5Y cellsNote: Compared with H2O2 group, *P<0.05, **P<0.01.3. 讨论
高良姜植物资源丰富，具有重要的医药和工业应用价值。 现有文献报道： 高良姜醇提物对H2O2诱导的PC12损伤细胞有保护作用[5]；高良姜素能通过抑制神经炎症发挥抗帕金森病的作用[38]；从高良姜中分离获得的7-(4-羟基苯基)-1-苯基-4E-庚烷-3-酮等有潜在的促进神经分化和增生作用[39]，但是其他成分在神经精神疾病方面的研究报道较少，尤其是黄酮类成分是否具有神经保护作用尚不明确。本研究报道了高良姜中具有神经保护作用的化学成分，表现出神经保护作用的化合物分别为山柰素-4′-甲醚 (1)、二氢山柰酚 (7) 和姜油酮 (18)，这是首次报道高良姜黄酮类化合物的神经保护作用，扩大了具有神经保护作用化合物的研究范围。神经退行性疾病危害大，缺乏有效的药物治疗[40-42]，一些具有神经保护作用的小分子对神经退行性疾病具有潜在的治疗作用，有望开发为具有治疗作用的药物[43]。
在本研究中，山柰素-4′-甲醚和二氢山柰酚为黄酮类化合物，前者在高良姜中的含量仅次于化合物2， 约为0.27% (20.0 kg样品中分离得到55.6 g)，且通过重结晶的方法即可分离获得，说明该化合物含量高、容易获得；二氢山柰酚是常见的天然产物，姜油酮结构较为简单，可通过化学合成大量获得，这些化合物的来源可得到保障，为进一步研究其对神经退行性疾病的治疗作用奠定了基础。本研究仅在细胞层面研究了化合物的神经保护作用，缺乏动物试验支撑，今后将设计动物试验，通过建立氧化损伤所致神经退行性动物模型系统评价这些化合物的治疗作用，阐述其神经保护作用机制；还将从化学结构出发，继续以天然产物为研究对象，发掘更多的结构类似物；化合物1~3和10的产率较高，将进一步对它们进行结构修饰，系统地研究其神经保护作用，总结构效关系，以期将其开发为对神经退行性疾病具有治疗作用的先导化合物。
4. 结论
本研究从高良姜中分离并鉴定得到22种化合物，其中9种化合物为首次从该植物中分离得到，研究结果丰富了高良姜的化学成分。生物活性研究表明：高良姜中的黄酮类和其他类型的化合物有较好的神经保护作用，其中山柰素-4′-甲醚 (1)、二氢山柰酚 (7) 和姜油酮 (18) 的神经保护作用较强且细胞毒性较低，有望开发为对神经退行性疾病具有治疗作用的神经保护剂，促进高良姜的开发利用。
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图 2 化合物1~18和20~22对SH-SY5Y细胞的毒性
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 2. Cytotoxicities of compounds 1-18 and 20-22 on SH-SY5Y cells
Note: Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.
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[1] 陶弘景. 名医别录[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1986. [2] 李时珍. 本草纲目[M]. 太原: 山西科学技术出版社, 2014. [3] 张鑫. 高良姜质量标准及等级标准研究[D]. 广州: 广东药科大学, 2019. [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. [5] 翟红莉, 王辉, 张秀丽, 等. 高良姜提取物对PC12细胞的神经保护作用[J]. 热带生物学报, 2014, 5(1): 78. DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2014.01.006. [6] 查王健. 高良姜素对支气管哮喘气道炎症的影响及机制研究[D]. 南京: 南京医科大学, 2014. [7] 喻明洁, 欧阳净, 冯伟, 等. 高良姜抗菌作用现代研究进展[J]. 现代中药研究与实践, 2019, 33(6): 82. DOI: 10.13728/j.1673-6427.2019.06.019. [8] 何瑞坤, 戴庆玲, 黄焕迪, 等. 3味山姜属中药挥发油对胃溃疡寒证大鼠胃黏膜损伤修复作用及机制研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2022, 24(4): 42. DOI: 10.13194/j.issn.1673-842x.2022.04.010. [9] TABATA K C, YAMAZAK Y, OKADA M, et al. Diarylheptanoids derived from Alpinia officinarum induce apoptosis, S-phase arrest and differentiation in human neuroblastoma cells[J]. Anticancer Research, 2009, 29(12): 4981.
[10] 陈浩南, 李蛟, 王婉愉, 等. 高良姜水提物的体外抗氧化和胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制功能研究[J]. 中国调味品, 2019, 44(4): 43. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9973.2019.04.010. [11] 赖伟勇, 李海龙, 谭银丰. 高良姜二苯基庚烷类成分药理作用研究综述[J]. 天然产物研究与开发, 2016, 28(12): 2030. DOI: 10.16333/j.1001-6880.2016.12.031. [12] 汪光华, 唐树平, 彭名军, 等. 高良姜中4种黄酮化合物的体外抗氧化能力及抑菌活性研究[J]. 食品与机械, 2017, 33(5): 168. DOI: 10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.034. [13] 林丽静, 黄晓兵, 刘梦洁, 等. 超临界和水蒸气提取高良姜精油及纯露的成分研究[J]. 热带作物学报, 2019, 40(12): 2498. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.025. [14] CHEN X L, LUO Q Y, HU W Y, et al. Abietane diterpenoids with antioxidative damage activity from Rosmarinus officinalis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(20): 5631. DOI: 10.1021/acs.jafc.0c01347.
[15] CHEN X L, LUO Q Y, HU W Y, et al. Labdane and isopimarane diterpenoids from Rosmarinus officinalis solid wastes: MS/MS spectrometric fragmentations and neuroprotective effect[J]. Industrial Crop and Products, 2022, 177(3): 114441. DOI: 10.1016/j.indcrop.2021.114441.
[16] 安宁, 杨世林, 邹忠梅, 等. 高良姜黄酮类化学成分的研究[J]. 中草药, 2006, 37(5): 663. DOI: 10.3321/j.issn:0253-2670.2006.05.007. [17] 张晗, 徐良雄, 吴萍. 高良姜地上部分黄酮类成分的研究[J]. 热带亚热带植物学报, 2014, 22(1): 89. DOI: 10.3969/j.issn.1005-3395.2014.01.014. [18] 张鑫. 水杨梅化学成分及生物活性研究[D]. 西安: 陕西科技大学, 2013. [19] WENG J R, BAI L Y, LIN W Y, et al. A flavone constituent from Myoporum bontioides induces M-phase cell cycle arrest of MCF-7 breast cancer cells[J]. Molecules, 2017, 22(3): 472. DOI: 10.3390/molecules22030472.
[20] DANIEL M, AMEENAH G F, ALEXANDRE G, et al. Constituents of Psiadia terebinthina A. J. Scott, an endemic asteraceae from Mauritius[J]. Natural Product Research, 2006, 20(13): 1169. DOI: 10.1080/14786410600898847.
[21] CÉCILE C O, STÉPHANE L, CHRISTIAN R. An efficient synthesis of the four mono methylated isomers of (+)-catechin including the major metabolites and of some dimethylated and trimethylated analogues through selective protection of the catechol ring[J]. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 2002(6): 821. DOI: 10.1039/b107340k.
[22] 罗镭, 张琳, 田景奎, 等. 乌药叶化学成分的研究[J]. 中草药, 2009, 40(6): 856. DOI: 10.3969/j.issn.1001-1528.2022.02.024. [23] 刘淑萍. 大理卫矛的化学成分研究[D]. 昆明: 云南中医药大学, 2020. [24] 王响元, 刘珍伶, 马志刚, 等. 多枝柽柳中的查尔酮和黄烷酮类化学成分研究[J]. 兰州大学学报(自然科学版), 2015, 51(4): 587. DOI: 10.13885/j.issn.0455-2059.2015.04.021. [25] SILVIA G G, ANTONIO N C, JORGE C A, et al. Mexican propolis: a source of antioxidants and anti-inflammatory compounds, and isolation of a novel chalcone and ε-caprolactone derivative[J]. Molecules, 2018, 23(2): 334. DOI: 10.3390/molecules23020334.
[26] 徐俊驹. 三种药用植物的化学与活性成分研究[D]. 昆明: 中国科学院昆明植物研究所, 2009. [27] JI N Y, WEN W, LI X M, et al. Brominated selinane sesquiterpenes from the marine brown alga Dictyopteris divaricate[J]. Marine Drugs, 2009, 7(3): 355. DOI: 10.3390/md7030355.
[28] ZHANG P, HUANG W, SONG Z H, et al. Cytotoxic diterpenes from the radix of Curcuma wenyujin[J]. Phytochemistry Letters, 2008, 1(2): 103. DOI: 10.1016/j.phytol.2008.05.001.
[29] KIM T H, JIN K K, KANG Y H, et al. Aldose reductase inhibitory activity of compounds from Zea Mays L.[J]. BioMed Research International, 2013, 2013: 727143. DOI: 10.1155/2013/727143.
[30] TIAN Y Q, LIN X P, LIU J, et al. Ascomycotin A, a new citromycetin analogue produced by Ascomycota sp. Ind19F07 isolated from deep sea sediment[J]. Natural Product Research, 2014, 29(9): 820. DOI: 10.1080/14786419.2014.988620.
[31] DONG M, LIU D, LI H M, et al. Chemical compounds from Swertia bimaculate[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2018, 54(5): 964. DOI: 10.1007/s10600-018-2523-8.
[32] 冯卫生, 张志广, 李孟, 等. 北葶苈子化学成分研究[J]. 中国药学杂志, 2018, 53(1): 16. DOI: 10.11669/cpj.2018.01.005. [33] KIUCHI F, SHIBUYA M, SANKAWA U. Inhibitors of prostaglandin biosynthesis from Alpinia officinarum[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1982, 30(6): 2279. DOI: 10.1248/cpb.30.2279.
[34] COUPERUS P A, CLAGUE A D H, DONGEN J P C M. 13C chemical shifts of some model olefins[J]. Organic Magnetic Resonance, 1976, 8(8): 591. DOI: 10.1002/mrc.1270080807.
[35] 王绍辉, 李泽之, 刘同祥. 苏铁二氯甲烷部位化学成分研究[J]. 时珍国医国药, 2020, 31(9): 2068. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.09.006. [36] 金悦仙, 潘苇芩, 魏鸿雁, 等. 伊犁贝母的化学成分研究[J]. 中草药, 2019, 50(11): 2534. DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.11.005. [37] 周媛媛, 高蕙蕊, 张然然, 等. 关苍术化学成分的研究[J]. 中成药, 2020, 42(10): 2640. DOI: 10.3969/j.issn.1001.2020.10.019. [38] CHEN G X, LIU J X, JIANG L Q, et al. Galangin reduces the loss of dopaminergic neurons in an LPS-evoked model of parkinson’s disease in rats[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 19(1): 12. DOI: 10.3390/ijms19010012.
[39] TANG G, DONG X, HUANG X, et al. A natural diarylheptanoid promotes neuronal differentiation via activating ERK and PI3K-Akt dependent pathways[J]. Neuroscience, 2015, 303: 389. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2015.07.019.
[40] BUTTERFIELD D, HALLIWELL B. Oxidative stress, dysfunctional glucose metabolism and Alzheimer disease[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2019, 20(3): 148. DOI: 10.1038/s41583-019-0132-6.
[41] ANDREAZZA A, SHAO L, WANG J F, et al. Mitochondrial complex I activity and oxidative damage to mitochondrial proteins in the prefrontal cortex of patients with bipolar disorder[J]. Archives of General Psychiatry, 2010, 67(4): 360. DOI: 10.1001/archgenpsychiatry.2010.22.
[42] KHALSA D S, NEWBERG A B. Spiritual fitness: a new dimension in Alzheimer’s disease prevention[J]. Journal of Alzheimer’s Disease, 2021, 80(2): 505. DOI: 10.3233/JAD-201433.
[43] QIU C X, MU L P, WANG J, et al. Sesquiterpenoids from the fruits of Alpinia oxyphylla Miq. and their neuroprotective effect[J]. Phytochemistry, 2023, 211: 113680. DOI: 10.1016/j.phytochem.2023.113680.
-
期刊类型引用(2)
1. 黎敏，龚坚，吴伟伟，刘巧. Nrf2/HO-1通路在银屑病中作用的研究进展. 天津医药. 2024(05): 552-556 . 
百度学术
2. 周堂，王吉，乔温皓，林芷淇，朱红波，常月，胡炜彦，张荣平，陈兴龙. 樟叶越橘的酚类成分：二级质谱裂解行为和神经保护作用. 食品科学. 2024(23): 140-149 . 百度学术
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