响应面法优化罂粟科植物叶片原生质体的制备条件
系统优化罂粟科(Papaveraceae)植物叶片原生质体提取的影响因素，建立其高效的原生质体提取体系。
以花菱草(Eschscholtzia californica Cham.)幼苗为罂粟科模式植物，通过单因素试验对影响原生质体产量和活力的预制液浓度、酶解液组成、酶解时间进行考察，借助响应面Box-Behnken设计预测最佳提取方案，并将最佳方案在罂粟亚科(Papaveroideae)、角茴香亚科(Hypecooideae)和荷包牡丹亚科(Fumarioideae)的代表性植物中进行验证。
当预制液浓度为0.8 mol/L、酶解时间6 h、酶解液组成为1.5%纤维素酶+0.4%离析酶+0.3%果胶酶时，花菱草原生质体的产量和活力最为理想，与响应面法的预测结果一致，能够成功获取罂粟科植物叶片的原生质体。
本研究方法可实现罂粟科植物叶片原生质体的高效提取，为后续瞬时表达体系、亚细胞定位、单细胞测序等研究提供技术支撑。
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关键词:
- 罂粟科 /
- 原生质体 /
- 酶解法 /
- 单因素试验 /
- Box-Behnken响应面法
Optimization of the Preparation Conditions of Leaf Protoplasts of Papaveraceae by Response Surface Methodology
To optimize the influencing factors of protoplast extraction from Papaveraceae leaves and establish an efficient protoplast extraction system.
Taking the seedlings of Eschscholtzia californica Cham. as the model plant of Papaveraceae, the concentration of preparation solution, the composition of enzymolysis solution, and the time of enzymolysis were examined by single factor experiments, which affected the yield and vitality of protoplasts; the optimal extraction protocol was predicted by response surface Box-Behnken design. The optimum protocol was validated in representative plants of Papaveroideae, Hypecooideae and Fumarioideae.
When the concentration of preparation solution was 0.8 mol/L, the time of enzymolysis was six hours, and the composition of enzymolysis solution was 1.5% cellulase+0.4% macerozyme+0.3% pectinase, the yield and vitality of protoplasts in E. californica were ideal, which was consistent with the predicted values from response surface methodology, and it was able to obtain the leaves protoplasts from the family of Papaveraceae.
This research method can realize the efficient at extraction of protoplasts from leaves of Papaveraceae plants, providing effective technical support for subsequent studies such as transient expression system, subcellular location and single-cell sequencing.
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Keywords:
- Papaveraceae /
- protoplasts /
- enzymatic digestion /
- single factor test /
- Box-Behnken response surface
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土壤有效种子库是指存在于土壤表层和土壤内部全部活性种子的总和[1]，其特征可以反映地上植物群落演替状况，是植被天然更新和受干扰植物群落自然恢复的重要种质来源[2]。火烧作为一种自然现象，是生态系统最活跃的因子之一，也是喀斯特石漠化的主要诱因之一。在火烧对喀斯特森林的影响研究中，多侧重于土壤理化指标[3]、地上植被[4-5]和土壤动物[6-7] 等方面，鲜有对土壤种子库的研究。国内已有研究表明：火烧降低了土壤种子库的储量及植物种类，导致土壤种子库耐火植物比例上升[8-9]。国外研究了火烧与亚热带松林[10]、巴西卡丁加(Caatinga)群落[11]、地中海[12]及美国[13]灌木林等土壤种子库的关系，发现火烧主要是通过温度[14-16]、热量[17-19]和烟尘[19-21]等影响土壤种子萌发[22-23]，进而改变植物组成[24-25]、物种丰富度[26]等。火烧效应具有两面性。一方面，火烧可显著提高种子发芽率[15,22]，火烧后表层土壤草本和灌木幼苗密度增加[12,17,20]，可使发芽种子和物种数量增加[10]；另一方面，火烧显著降低了土壤种子库密度[11]及植物多样性[24-26]。火烧对喀斯特森林土壤种子库的影响模式如何？与其他研究地区的相似性和相异性何在？如何利用火烧工具实施喀斯特石漠区植被恢复？这些问题目前还没有相关报道。
喀斯特是自然环境中独特的地理景观[27]，喀斯特石漠化是指在脆弱的生态环境背景下，受人类活动强烈干扰和破坏，导致水土流失[28-29]、基岩裸露，土地生产力退化，地表出现类似荒漠景观的现象，是制约中国西南地区可持续发展的严重生态环境问题之一。本研究以黔中喀斯特石漠灌丛林为对象，采用萌发法研究火烧对土壤有效种子库种子萌发动态、物种和生活型组成、密度以及植物多样性的影响，以期了解火烧前后石漠灌丛林土壤有效种子库的主要指标变化规律，为喀斯特石漠区植被恢复提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于贵州省普定县马关镇中山村高寨坝(N26°13′55″，E105°45′54″)，地处云贵高原东侧的黔中山原区，海拔约1300 m，坡向南，裸露岩石大小及分布相对均匀，为中度灰质白云岩石漠区。研究区所在地普定县喀斯特地貌面积比例大，石漠化严重[30]，年均气温15.1 ℃，年均日照时间1202 h，年均降水1396.9 mm，属亚热带季风湿润气候。试验林中植物以灌木和草本为主。灌木植物62种，分属31科51属；草本植物38种，分属20科33属。主要灌木有贵州小檗(Berberis cavaleriei)、石生鼠李(Rhamnus calcicolus)、小果蔷薇(Rosa cymosa)、竹叶椒(Zanthoxylum armatum)和木蓝(Indigofera tinctoria)等，主要草本植物有千里光(Senecio scandens)、黄背草(Themeda jiponica)、龙胆(Gentiana scabra)和荩草(Arthraxon hispidus)等。
1.2 样地设置与土壤取样
在研究区内选择林相相对一致的区域，按等高线设置9个20 m×30 m的调查样地，样地植被和土壤主要特征指标见文献[30]。样地间隔火带宽5 m，隔火带地表部分的灌木和草本植物在冬季清除外运。调查样地边缘5 m为火烧交互效应带，在样地中选择10 m×20 m的样方进行植被调查及土壤取样。
火烧试验于冬末至春初的植物休眠期内完成。在办理相关科研用火审批手续后，持续跟踪当地气象台站的天气预报，选择连续3~5个晴日、无风或微风环境，对9个样地进行控制性火烧处理，以地表火形式过火1次，烧尽地表凋落物和草本植物，部分易燃灌木会引燃，地表未燃部分再行补烧。单个样地地表火持续时间因地表凋落物和草本植物的积累量以及可燃物连续性而变，一般约30 min。
(1)火前土壤取样。在年底完成植被调查后，每个样地内选取2个有代表性的采样点挖掘剖面，划分0~5 cm和5~10 cm 2个土层，分别对9个样地进行取样。单个采样点每层取3个环刀(200 cm3)、环刀面积40 cm2，即取样面积为9×2×3×0.004 m2 = 0.216 m2。将每个样地2个采样点的相同土层样品混合均匀，得到2份土样，共获得18份土样。
(2)火后土壤取样。火后24 h内，在9个样地火前采样点约1 m处进行土壤取样，取样方法同火烧前土壤取样。火烧前后共取得36份土样。装入自封袋并标记后带回试验室进行发芽试验。
1.3 种子萌发试验
采回的土样自然风干后，剔除石头、植物根和枯枝落叶等杂物，捣碎后将土样分别平铺于塑料花盆(上部直径15 cm，下部直径和高10 cm，底部有透水孔)中。花盆底部的塑料泡沫颗粒厚约3 cm，起透水作用，上覆土壤样品，每盆1个样品，共计36 盆。将花盆标记后，置于玻璃温室内的苗床上，表土泛白时适度浇水，保持湿度，自然萌发。每3 d观测1次，记录芽苗高度≥1 cm的种子萌发数量，并用带标记号牌的大头针插入侧方土壤，稍后辨识植物物种。种子萌发后，观察识别幼苗的种名并记录，已鉴别的幼苗及时拔除，不能鉴别的幼苗移栽至备用花盆待其可识别后再记录。连续2周无幼苗萌发时翻土，以改变土壤光、热、水条件，促进种子萌发。试验从2017年3月上旬开始，7月4日和10月27日各翻土1次，至12月结束。
1.4 分析指标及数据处理
物种组成分析包括植物科、属、种以及生活型的数量组成。将记录到的幼苗物种数量及苗木数量换算成每平方米的数值，即为土壤有效种子库的密度值。
(1)植物多样性变化。用Margalef丰富度指数(M)、Simpson优势度指数(D)、Pielou均匀度指数(P)和Shannon-Wiener多样性指数(H)度量土壤有效种子库植物多样性变化，计算公式为[31]：
$ M= \frac{{S - 1}}{{\ln N}} \text{；} $
$ D=1- \sum\limits_{i = 1}^S {{p_i^2}} \text{；} $
$ H=- \sum\limits_{i = 1}^S {({p_{_i}} \times \ln {p_{_i}})} \text{；} $
$ P= \frac{H}{{\ln S}} 。 $
式中：S为物种数；N为物种个体总数；pi表示物种i的个体数占所有物种个体总数(N)的比率。
(2)土壤有效种子库变化。用土壤有效种子库在0~5 cm土层的表层变化率(DFS)和在0~5 cm和5~10 cm土层间剖面变化率(FP)度量，计算公式为[4]：
$ {\rm{DFS}}_{i}= \dfrac{{x}_{iA火前}-{x}_{iA火后}}{{x}_{iA火前}} \text{；} $
$ {\rm{FP}}_{i}= \dfrac{{{x_{^{{{_i}_A}}}}}}{{{x_{iB}}}} 。 $
式中：xiA火前和xiA火后为第i样地0~5 cm土层火烧前和火烧后的指标值，xiA和xiB为第i样地0~5 cm土层和5~10 cm土层的指标值。DFSi=0表示指标值无变化，DFSi<0表示指标值增加，DFSi>0表示指标值降低；FP=0表示0~5 cm或5~10 cm土层或0~5 cm和5~10 cm土层指标无测定值；FP>0表示0~5 cm和5~10 cm土层指标有测定值。
(3)土壤有效种子库物种相似性。火烧前后不同土层物种相似性用SØrensen指数(SI)表达，计算公式为[32]：
$ {\rm{SI}}= \frac{{2c}}{{a + b}} 。 $
式中：a和b分别为两样方的物种数；c为两样方共有的物种数。
使用Excel和SPSS处理软件分析相关数据。种子密度的月变化用X 2检验，种子密度和物种密度平均值用单因素方差分析。
2. 结果与分析
2.1 火烧对土壤有效种子库种子密度动态的影响
由图1可知：受翻土(7月和11月)次数的影响，土壤有效种子库密度变化呈三峰型。火烧前后0~5 cm土层种子密度的月变化差异显著(P<0.05)，5~10 cm土层的相应值差异不显著(P>0.05)；火烧前或火烧后，0~5 cm和5~10 cm土层间种子密度的月变化差异显著(P<0.05)。3—6月间，火烧后0~5 cm及5~10 cm土层的种子密度分别为463和241 粒/m2，火烧前的对应值分别为199和259 粒/m2，火烧提高了0~5 cm土层的种子密度、降低了5~10 cm土层的种子密度。种子萌发量的第1个峰值出现在4月，火烧前后0~5 cm土层种子密度分别为162和380 粒/m2，5~10 cm土层的对应值分别为241和148 粒/m2。6月各土层均无种子萌发。第1次翻土(7—10月)后，火烧后0~5 cm及5~10 cm土层种子密度分别为255和148 粒/m2，火烧前的对应值为343和282 粒/m2，火烧降低了0~5 cm及5~10 cm土层种子密度。种子萌发量的第2个峰值出现在7月，火烧前后0~5 cm土层种子密度分别为236 和139 粒/m2，5~10 cm土层的对应值为213和65 粒/m2。10月各土层均无种子萌发。第2次翻土(11—12月)后，种子萌发量较低，火烧后0~5 cm及5~10 cm土层种子密度分别为37 和0 粒/m2，火烧前的对应值为14 和28 粒/m2，火烧增加了0~5 cm土层种子密度、降低了5~10 cm土层的种子密度。12月后连续2周无幼苗萌发，结束试验。
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图 1 火烧前后土壤有效种子库种子密度动态Figure 1. Germinating dynamics in the soil effective seed bank before and after fire-treated由图2可知：在0~5 cm土层，土壤种子密度的表层变化率在4—5月间呈负值，7月和9月呈正值，12月呈负值，这与火烧效应的阶段性有关。火烧前后土壤种子密度在0~5 cm和5~10 cm土层间剖面变化率的月变化有相似和相异性且差异不显著(P>0.05)，除4月外，其他时间段的剖面变化率均是火烧前>火烧后，表明火烧先升高后降低了土壤种子密度剖面变化率。
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图 2 火烧前后土壤有效种子库种子密度表层变化率(DFS)和剖面变化率(FP)动态Figure 2. Surface change rates (DFS) and profile change rates (FP) of seeds density in the soil effective seed bank before and after fire-treated2.2 火烧对土壤有效种子库物种密度及种子密度的影响
由图3可知：火烧后0~5 cm土层的种子密度显著上升(P<0.05)，5~10 cm土层的种子密度下降(P>0.05)。火烧后0~5 cm土层种子密度显著高于5~10 cm土层(P<0.05)，火烧前不同土层的种子密度差异不显著(P>0.05)。表明火烧可提高0~5 cm土层种子密度，显著增加土层间相应值的差异性。在0.216 m2的取样面积中，火烧后0~5 cm土层物种数为20种，比火烧前增加4种；5~10 cm土层物种数均为16种，无变化。火烧后0~5 cm土层物种密度显著高于5~10 cm土层(P<0.05)，表明火烧可提高0~5 cm土层物种密度，显著增加土层间物种密度的差异性。
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图 3 火烧前后不同土层有效种子库种子密度及物种密度变化注：不同大写字母表示同土层不同处理间、不同小写字母表示同一处理不同土层间的差异显著(P<0.05)。Figure 3. Seeds density and species density changes in the soil effective seed bank in different soil layers before and after fire-treatedNote: Different uppercase letters indicate significant differences between treatments in same soil layer, and different lowercase letters indicate significant differences between soil layers in same treatment (P<0.05).2.3 火烧对土壤有效种子库物种组成的影响
由表1可知：除待定种外，9个样地0~5 cm土层内火烧前植物隶属于10科13属，物种数最多的为禾本科计3种，其次为菊科计2种，其余每科均仅有1个物种，单种科占80.00%；火烧后植物隶属于13科16属，蔷薇科3种，禾本科、豆科、菊科及莎草科分别有2种，其余每科均仅有1种，单种科占61.53%。9个样地5~10 cm土层内火烧前植物隶属于11科12属，禾本科有2种，其余每科仅有1种，单种科占90.91%；火烧后植物隶属于13科15属，蔷薇科和菊科分别有2种，其余每科仅有1种，单种科占84.62%。0~5 cm和5~10 cm土层间物种SØrensen相似性系数在火烧前为0.69，火烧后为0.56。火烧增加了不同土层内植物科及属数量、降低了单种科比例，土层间物种SØrensen相似性系数在火烧后降低。
表 1 土壤有效种子库物种组成及数量特征Table 1. Quantitative characteristics of species composition in the soil effective seed bank粒/m2 序号
No.科
family属
genera种
specie火烧前 before fire-treated 火烧后 after fire-treated 0~5 cm土层
0-5 cm
soil layer5~10 cm土层
5-10 cm
soil layer0~5 cm土层
0-5 cm
soil layer5~10 cm土层
5-10 cm
soil layer1 豆科 Fabaceae 车轴草属 Trifolium 车轴草 Trifolium sp. 120 102 134 60 2 云实属 Caesalpinia 云实 C. decapetala — — 5 — 3 罂粟科 Papaveraceae 紫堇属 Corydalis 地丁 C. bungeana 14 14 28 19 4 石竹科 Caryophyllaceae 繁缕属 Stellaria 繁缕 S. media 14 14 19 — 5 报春花科 Primulaceae 珍珠菜属 Lysimachia 过路黄 L. christinae — 19 9 14 6 禾本科 Poaceae 菅属 Themeda 黄背草 T. japonica 56 28 194 — 7 荩草属 Arthraxon 茅叶荩草 A. prionodes 9 — — 5 8 香茅属 Cymbopogon 芸香草 C. distans 65 5 19 — 9 蔷薇科 Rosaceae 悬钩子属 Rubus 红泡刺藤 R. niveus — — 9 — 10 悬钩子 R. corchorifolius — — 5 5 11 绣线菊属 Spiraea 绣线菊 S. salicifolia 5 9 5 9 12 藤黄科 Guttiferae 金丝桃属 Hypericum 金丝桃 H. monogynum 5 — — 5 13 爵床科 Acanthaceae 观音草属 Peristrophe 九头狮子草 P. japonica 5 5 — — 14 菊科 Asteraceae 白酒草属 Conyza 小蓬草 C. canadensis 9 — 9 — 15 鼠麹草属 Gnaphalium 鼠曲草 G. affine — — — 5 16 莴苣属 Lactuca 莴苣 L. sativa 5 5 — 5 17 蕨科 Pteridiaceae 蕨属 Pteridophyta 蕨 Pteridophyta sp. — — 32 111 18 鼠李科 Rhamnaceae 鼠李属 Rhamnus 石生鼠李 R. calcicola — 5 — — 19 莎草科 Cyperaceae 薹草属 Carex 丝叶薹草 C. capilliformis — 5 — 5 20 薹草 Carex spp. — — 5 — 21 细叶薹草 C. rigescens — — 5 — 22 番杏科 Aizoaceae 粟米草属 Mollugo 粟米草 M. stricta — — 14 5 23 铁线蕨科 Adiantaceae 铁线蕨属 Adiantum 铁线蕨 A. capillus-veneris 227 324 245 130 24 远志科 Polygalaceae 远志属 Polygala 远志 P. tenuifolia — — 5 — 25 酢浆草科 Oxalidaceae 酢浆草属 Oxalis 酢浆草 O. corniculata 5 — — — 26 芸香科 Rutaceae 花椒属 Zanthoxylum 竹叶椒 Z. armatum — — 5 5 27 伞形科 Apiaceae 天胡荽属 Hydrocotyle 天胡荽 H. sibthorpioides — — — 5 28 待定种 pending species 19 37 9 5 注：“—”表示无发芽数据。
Note: “—” indicates no germination data.由表1还可知：0~5 cm土层内，火烧前种子萌发数量前3位的是铁线蕨(40.83%)、车轴草(21.58%)和芸香草(11.51%)，火烧后种子萌发数量前3位的是铁线蕨(32.45%)、黄背草(25.70%)和车轴草(17.75%)；5~10 cm土层内，火烧前种子萌发数量前3位的是铁线蕨(56.94%)、车轴草(17.93%)和黄背草(4.75%)，火烧后种子萌发数量前3位的是铁线蕨(33.42%)、蕨(28.53%)和车轴草(15.42%)。火烧改变了种子萌发数量排序前3位的物种组成及比例，火烧后排序前3位的种子萌发数量比例在0~5 cm土层增高、5~10 cm土层降低。
2.4 火烧对土壤有效种子库生活型的影响
由表2可知：土壤有效种子库植物生活型组成中，乔木仅出现在火烧前的5~10 cm土层中，火烧后没有发现。灌木物种密度及种子密度在相同土层呈火烧后>火烧前的变化趋势，且差异不显著(P>0.05)；物种密度在不同土层呈0~5 cm土层≥5~10 cm土层，种子密度在火烧前呈0~5 cm土层<5~10 cm土层、火烧后呈0~5 cm土层>5~10 cm土层的变化趋势，且差异不显著(P>0.05)。草本植物物种密度在相同土层呈火烧后<火烧前的变化趋势，种子密度在0~5 cm土层呈火烧后>火烧前、5~10 cm土层呈火烧后<火烧前的变化趋势，且火烧前后差异不显著(P>0.05)；火烧后物种密度和种子密度在0~5 cm土层显著高于5~10 cm土层(P<0.05)。表明火烧可降低乔木物种密度及种子密度、增加灌木物种密度及种子密度、降低草本植物物种密度和增加草本植物种子密度，林分灌木化趋势增加。此外，在种子组成结构中，火烧后不同土层乔木和灌木的物种密度及种子密度占比降低，而草本植物的占比升高，即火烧对土壤种子库生活型组成的影响不同，可提高草本植物的优势地位。
表 2 土壤有效种子库生活型组成Table 2. Life forms composition of the soil effective seed bank生活型
life forms火烧前
before fire-treated火烧后
after fire-treated0~5 cm土层
0-5 cm soil layer5~10 cm土层
5-10 cm soil layer0~5 cm土层
0-5 cm soil layer5~10 cm土层
5-10 cm soil layer物种密度/(种·m−2) density of species 乔木 tree — 4±14 — — 灌木 shrub 9±18 Aa 9±18 Aa 28±36 Aa 23±30 Aa 草本 grass 204±61 Aa 153±63 Aa 185±69 Aa 102±66 Ab 种子密度/(粒·m−2) seeds density 乔木 tree — 5±14 — — 灌木 shrub 10±18 Aa 14±29 Aa 28±36 Aa 23±30 Aa 草本 grass 546±250 Aa 551±368 Aa 727±254 Aa 366±252 Ab 注：物种密度以单个样地中环刀总面积0.024 m2折合为1 m2所得；“—”表示无观测数据；不同大写字母表示同土层不同处理间、不同小写字母表示同处理不同土层间的差异显著 (P<0.05)。
Note: The number of species is converted from 0.024 m2 (six cutting rings area) into 1 m2; “—” indicates no germination data; different uppercase letters indicate significant difference between treatments in same soil layer, and different lowercase letters indicates significant differences between soil layers in same treatment (P<0.05).2.5 火烧对土壤有效种子库植物多样性指数的影响
由图4可知：火烧后0~5 cm土层有效种子库植物的Simpson指数和Shannon-Wiener指数升高、Margalef指数和Pielou指数降低，5~10 cm土层有效种子库植物的Margalef指数、Simpson指数、Pielou指数和Shannon-Wiener指数均降低。火烧前后同一土层有效种子库植物的多样性指数差异均不显著(P>0.05)，不同土层间Margalef指数差异显著(P<0.05)；火烧后Simpson指数和Shannon-Wiener指数在0~5 cm和5~10 cm土层间差异显著(P<0.05)。火烧前后Margalef指数、Simpson指数、Pielou指数和Shannon-Wiener指数值均呈0~5 cm土层>5～10 cm土层的趋势。可见，火烧没有改变土层间植物多样性指数值的变化趋势，但显著增大了部分植物多样性指数在土层间的差异性。
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图 4 火烧前后土壤有效种子库植物多样性指数值变化Figure 4. Changes of plant diversity indexes in the soil effective seed bank before and after fire-treated3. 讨论
火烧可快速提高地表土壤热量[17-19]和温度[14-16]，部分种子的生理性休眠解除、种皮被破坏[1]，有利于发芽；火烧后地表土壤理化特性[3, 33]改变、肥力有效性提高，也有利于种子萌发。本研究发现：在0~5 cm土层，火烧前植物10科13属、单种科占80.00%，排序前3位的为铁线蕨、车轴草和芸香草；火烧后植物13科16属、单种科占61.53%，排序前3位的为铁线蕨、黄背草和车轴草。火烧改变了种子库植物组成结构[24-25]，进而影响林分组成及生长[4-5]。本研究还发现：火烧后，0~5 cm土层植物的Margalef指数和Pielou指数降低、Simpson指数和Shannon-Wiener指数升高，火烧前后0~5 cm土层植物多样性指数差异不显著，这与已有研究[26]不一致，可能是受地域性植被类型及研究方法的影响。
本研究表明：火烧前后，5~10 cm土层的种子密度和物种密度变化趋势与0~5 cm土层不一致，这可能与火烧效应的间接性[14-16, 24]和土壤肥力[3]有关联。火烧前，5~10 cm土层植物11科12属、单种科占90.91%，排序前3位的为铁线蕨、车轴草和黄背草；火烧后植物13科16属、单种科占84.62%，排序前3位的为铁线蕨、蕨和车轴草。与0~5 cm土层相比，5~10 cm土层植物科及属的数量、单种科比例升高，排序前3位的物种组成变化，说明火烧改变了种子库植物组成结构[24-25]、林分组成及生长[4-5]。此外，火烧前后0~5 cm土层的表层变化率(DFS)呈种子密度>物种密度的趋势，而种子密度和物种密度的剖面变化率(FP)呈火烧前<火烧后的趋势，该结果支持了已有研究[12, 17, 20]。
火烧对土壤种子库的影响具有综合性，方式有不同类型[8-11, 13-14]、季节[14]及重复[25-26]之别，火烧引起的热量[17-19]、温度[14-16]、湿度[28-29]以及烟雾[19-21]等对土壤有效种子库有直接性及持续性[8-9]影响，燃烧剩余物通过土壤理化特性[4]、动物[6-7]及微生物活动的改变影响土壤有效种子库的组成[22-26]、林分结构[4-5, 23]及生长[25]。本研究分析冬末至春初地表火烧对喀斯特石漠灌丛林土壤种子库的影响，得到了基础数据和初步结论，进一步分析火烧对喀斯特石漠灌丛林的系统性影响，可解析火烧对土壤有效种子库影响的机理。
4. 结论
火烧对0~5 cm土层种子库有直接影响、对5~10 cm土层种子库有间接影响。火烧短期内可增加石漠灌丛林土壤种子库的萌发量以及灌木物种密度和种子密度，降低草本植物物种密度，林分灌木化趋势增加。种子组成结构中，火烧后不同土层草本植物的物种密度及种子密度占比升高，提高了草本植物的优势地位。因此，可利用火烧后土壤种子库的萌发潜力，以自然恢复方式进行植被修复。
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图 1 不同酶解液与酶解时间条件下原生质体的产量(上)及活力(下)
注：酶解液1~6的组成见表1。与4 h相比，原生质体产量或原生质体活力显著(a，P<0.05)或极显著(b，P<0.01)升高或降低。
Figure 1. Protoplast yield (above) and vitality (below) under different composition of enzymolysis solution and enzymolysis time
Note: The compositions of enzymolysis solution (CES) are list in Tab.1. Compared with four hours, the yield or vitality of protoplasts significantly (a, P<0.05) or extremely significantly (b, P<0.01) increased or decreased.
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图 2 不同预制液浓度下原生质体的产量和活力
注：与0.5 mol/L相比，原生质体产量或原生质体活力显著(a，P<0.05)或极显著(b，P<0.01)升高或降低。
Figure 2. Protoplast yield and vitality under different concentrations of preparation solution
Note: Compared with 0.5 mol/L, the yield or vitality of protoplasts significantly (a, P<0.05) or extremely significantly (b, P<0.01) increased or decreased.
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图 3 各因素对原生质体产量影响的等高线图(a~c)和交互作用曲面图(d~f)
注：X1. 预制液浓度，mol/L；X2. 酶解液质量分数，%；X3. 酶解时间，h；下同。
Figure 3. Contour plots (a-c) and profiles of surface response (d-f) in the optimization of two variables for protoplast yield
Note: X1. concentration of preparation solution; X2. mass fraction of enzymolysis solution; X3. time of enzymolysis; the same as below.
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图 4 各因素对原生质体活力影响的等高线图(a~c)和交互作用曲面图(d~f)
Figure 4. Contour plots (a-c) and profiles of surface response (d-f) in the optimization of two variables for protoplast vitality
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图 5 罂粟科不同亚科植物叶片的原生质体 (10×)
Figure 5. Protoplasts in different subfamilies of Papaveraceae on bright field and dark field
表 1 单因素试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of single-factor experiment
水平
level因素 factor 酶解液组成
composition of enzymolysis solution预制液浓度/(mol·L−1)
concentration of preparation solution酶解时间/h
time of enzymolysis1 1.0%A+0.2%B 0.5 4 2 1.0%A+0.2%B+0.1%C 0.6 5 3 1.5%A+0.4%B 0.7 6 4 1.5%A+0.4%B+0.3%C 0.8 7 5 2.0%A+0.6%B 0.9 8 6 2.0%A+0.6%B+0.5%C 1.0 — 注：A. 纤维素酶；B. 离析酶；C. 果胶酶；下同。
Note: A. cellulose; B. macerozyme; C. pectinase; the same as below.
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表 2 Box-Behnken响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface
序号
No.预制液浓度/(mol·L−1)
X1
concentration of
preparation solution酶解液组成
X2
composition of
enzymolysis solution酶解时间/h
X3
time of enzymolysis原生质体产量×106/(个·mL−1)
protoplast yield原生质体活力/%
protoplast vitality1 0.8 1.0%A+0.2%B+0.1%C 7 3.25 60.0 2 0.7 1.5%A+0.4%B+0.3%C 5 2.25 46.6 3 0.9 1.5%A+0.4%B+0.3%C 7 5.30 69.8 4 0.9 1.5%A+0.4%B+0.3%C 5 6.75 71.1 5 0.8 1.0%A+0.2%B+0.1%C 5 2.40 50.0 6 0.8 2.0%A+0.6%B+0.5%C 7 3.40 50.0 7 0.8 2.0%A+0.6%B+0.5%C 6 8.50 62.2 8 0.8 1.5%A+0.4%B+0.3%C 6 15.50 88.1 9 0.8 1.5%A+0.4%B+0.3%C 6 14.81 88.8 10 0.7 1.5%A+0.4%B+0.3%C 7 4.00 23.8 11 0.8 1.5%A+0.4%B+0.3%C 6 14.65 91.1 12 0.8 1.5%A+0.4%B+0.3%C 6 14.28 93.9 13 0.9 2.0%A+0.6%B+0.5%C 6 5.63 72.5 14 0.7 1.0%A+0.2%B+0.1%C 6 2.70 42.5 15 0.8 1.5%A+0.4%B+0.3%C 6 15.50 94.5 16 0.7 2.0%A+0.6%B+0.5%C 6 5.25 74.0 17 0.9 1.0%A+0.2%B+0.1%C 6 2.35 91.5
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表 3 原生质体产量回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of protoplast yield regression model
来源
source平方和
sum of sequence自由度
degree of freedom均方
mean squareF值
F-valueP值
P-value模型 model 416.88 9 46.32 165.50 <0.0001** X1 0.67 1 0.67 2.40 0.1650 X2 18.24 1 18.24 65.17 <0.0001** X3 6.96 1 6.96 24.85 0.0016* X1X2 0.13 1 0.13 0.48 0.5125 X1X3 0.02 1 0.02 0.09 0.7780 X2X3 8.85 1 8.85 31.62 0.0008** X12 103.18 1 103.18 368.65 <0.0001** X22 152.35 1 152.35 544.34 <0.0001** X32 86.99 1 86.99 310.80 — 残差 residual 1.96 7 0.28 — — 失拟项 lack of fit 0.80 3 0.27 0.91 0.5106 纯误差 pure error 1.16 4 0.29 — — 校正总和 calibration sum 418.83 16 — — — 注：“**”表示影响极显著 (P<0.01)，“*”表示影响显著 (P<0.05)；下同。
Note:“**” indicates an extremely significant impact (P<0.01), “*” indicates a significant impact (P<0.05); the same as below.
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表 4 原生质体活力回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of protoplast vitality regression model
来源
source平方和
sum of sequence自由度
degree of freedom均方
mean squareF值
F-valueP值
P-value模型 model 7032.10 9 781.34 36.31 <0.0001** X1 1740.50 1 1740.50 70.30 <0.0001** X2 27.01 1 27.01 1.09 0.3310 X3 86.46 1 86.46 3.49 0.1039 X1X2 637.56 1 637.56 25.75 0.0014* X1X3 115.56 1 115.56 4.67 0.0676 X2X3 123.21 1 123.21 4.98 0.0609 X12 610.36 1 610.36 24.65 0.0016* X22 365.34 1 365.34 14.76 0.0064* X32 2982.56 1 2982.56 120.47 <0.0001** 残差 residual 173.31 7 24.76 — — 失拟项 lack of fit 139.34 3 46.65 5.47 0.0671 纯误差 pure error 33.97 4 8.49 — — 校正总和 calibration sum 7205.41 16 — — —
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表 5 罂粟科不同亚科植物叶片原生质体的产量及活力
Table 5 Protoplast yield and vitality in different subfamilies of Papaveraceae
物种
species产量×106/(个·mL−1)
yield活力/%
vitality花菱草
Eschscholzia californica15.18±1.68 92.17±1.76 博落回
Macleaya cordata8.75±0.97 85.03±3.00 小果博落回
Macleaya microcarpa13.38±0.18 91.05±2.19 虞美人
Papaver rhoeas14.88±1.03 88.53±0.66 白屈菜
Chelidonium majus6.90±0.49 84.25±2.47 荷包牡丹
Lamprocapnos spectabilis6.73±0.11 90.00±2.83 紫堇
Corydalis edulis5.83±0.46 87.25±2.47 延胡索
Corydalis yanhusuo13.10±0.42 80.63±1.94 角茴香
Hypecoum erectum9.08±0.53 86.50±2.12
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