NaCl与NaHCO3单盐胁迫下秋萍红树莓的光合及生理指标响应
Response of Photosynthetic and Physiological Characteristics of Rubus idaeus L. Variety ‘Qiuping’ to NaCl and NaHCO3 Single Salt Stress
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脾虚证是中医临床常见证候之一，多因饮食不节、劳倦、情志等原因造成脾损伤或虚弱。脾虚证发病机理复杂，涉及多系统、多器官的相互影响。腹痛腹泻为其主要症候特征之一。有学者认为肠道通透性过高是导致腹痛腹泻的原因之一[1]。肠道通透性过高是由于肠道屏障的完整性遭受破坏，而肠道屏障的完整性对于防止细菌和有毒大分子从肠腔内渗透到系统循环中至关重要[2-3]。四君子汤是健脾益气代表方，出自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓和炙甘草4味药组成，临床上常对该方加减治疗脾虚证相关疾病，已有不少针对该方作用的研究[4-5]。
有研究表明：在脑内皮细胞中，可以通过EGFR-ERK1/2途径控制ZO-1和Occludin的表达来调节血脑屏障通透性[6]；CHANG等[7]认为：在血管内皮细胞中ERK1/2的激活可以使ox-LDL诱导破坏的ZO-1和Occludin得到恢复。以上研究认为ERK/MAPK通路能够调节紧密连接蛋白的表达，但从ERK/MAPK通路的角度研究脾虚犬肠道紧密连接蛋白的变化未见报道。本试验通过观察脾虚犬小肠黏膜紧密连接蛋白及相关通路蛋白表达水平的变化，以及加味四君子汤对脾虚犬小肠黏膜紧密连接蛋白及相关通路蛋白表达水平的影响，探究脾虚证的发病机制以及加味四君子汤对脾虚证的作用机制。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
24只1岁龄纯种比格犬，由南京亚东试验动物研究中心提供。试验前进行常规免疫与驱虫，定量采食，自由饮水，隔离饲喂7 d。
1.2 中药制备
番泻叶药液制备[8]：准确称取5 kg番泻叶(购于安徽合肥梅山路立方大药房)，筛选去除杂质，清洗，装入纱布袋连同清洗上清液投入TD-100小型浓缩机组(购于浙江森力机械科技有限公司)提取罐中，加10倍量水，75 ℃提取2次，每次40 min，合并滤液，75 ℃浓缩成1 g/mL的药液，冷却后4 ℃保存。
加味四君子汤的制备[9]：加味四君子汤由党参、茯苓、麸炒白术、甘草、当归、黄芪、山楂和神曲等(购于安徽合肥梅山路立方大药房)按一定比例组方，清洗去除杂质后连同清洗上清投入TD-100小型浓缩机组提取罐中，加10倍量水，浸泡3 h，75 ℃提取2次，每次40 min，合并滤液，75 ℃浓缩成1 g/mL的药液，冷却后4 ℃保存。
1.3 试验犬分组处理
比格犬饲养1周后，取24只随机均分为对照组、脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组。脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组试验犬每天按体质量6 mL/kg剂量分早、晚2次灌服番泻叶药液，对照组试验犬等次等剂量灌服生理盐水。第7天，脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组多半试验犬出现大便溏稀、食少纳呆、神态萎靡、毛色枯燥、消瘦、不喜动等症状时，即判定中医脾虚模型复制成功[10]。脾虚组犬处死取样备用，对照组和自然恢复组犬饲喂基础日粮，加味四君子汤组犬在基础日粮中添加2%日粮重的加味四君子汤，连续7 d。试验期间，4组试验犬饲喂管理条件均一致，每日饲喂2次基础日粮，每次150 g。保证充足洁净饮水，犬舍每日打扫1次，常规消毒。
1.4 样本处理
试验犬麻醉放血处死，采集十二指肠、空肠和回肠，经生理盐水稍冲洗后迅速分装于4%多聚甲醛和液氮罐中保存。采样完成后液氮罐中的样本转移至−80 ℃超低温冰箱保存备用，4%多聚甲醛中的样本在48 h内换液1次备用。
1.5 免疫组化染色
取固定后样本将其修整成块，常规石蜡包埋切片5 μm，脱蜡、水化，3%过氧化氢室温下孵育15 min消除内源性过氧化物酶活性，微波加热修复抗原，5% BSA 37 ℃封闭25 min，滴加一抗ZO-1 (21773-1-AP, Proteintech)稀释倍数1∶100，Occludin (GB11149, Servicebio)稀释倍数1∶100，4 ℃孵育过夜。复温后37 ℃孵育二抗(稀释倍数1∶150)，DAB显色，苏木素染色，常规封片，设置阴性对照(一抗、二抗均为PBS溶液)。试验结果在CX31正置光学显微镜(日本OLYMPUS公司)下观察，同一组织选3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图片进行分析统计，结果以平均光密度(OD)值表示。
1.6 小肠各段组织中ZO-1和Occludin mRNA相对表达量的测定
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表 1 用于PCR扩增的引物序列Table 1. Primer sequences for PCR amplification引物
primer引物序列(5′→3′)
primer sequence扩增片段长度/bp
amplification sizeZO-1-F AAGCTATTCCTGTGAGCCCG 113 ZO-1-R GGAACTCAACACCCCACCAT Occludin-F TAAATCAACACCGGTCCCCG 112 Occludin-R CTTCGAAGGTGGCTCCAAGT β-actin-F TGTGTTATGTGGCCCTGGAC 164 β-actin-R TTCCATGCCCAGGAAGGAAG △△Ct=(试验组目的基因Ct值－试验组β-actin Ct值)－(对照组目的基因Ct值－对照组β-actin Ct值)。
1.7 紧密连接及相关通路蛋白表达量的检测
应用蛋白质印迹法(Western-blot)检测ZO-1、Occludin紧密连接蛋白和ERK1/2 (GB12087, Servicebio)、p-ERK1/2 (GB11104, Servicebio)、Ras(GB11411, Servicebio)、MEK1 (GB11304-1, Servicebio)通路蛋白的表达。取出超低温冰箱中的小肠组织样本，充分裂解、离心，提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备SDS-PAGE胶，经电泳、转膜、免疫杂交、化学发光、显影，通过BIO-RAD凝胶成像系统测出各条带的灰度值，对其进行分析，用目的蛋白的灰度值与β-actin (GB11101, Servicebio)灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。
1.8 统计学处理
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2. 结果与分析
2.1 试验犬小肠各段紧密连接蛋白ZO-1的表达水平
试验犬小肠各段ZO-1蛋白IHC检测结果如图1所示：棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色。可见对照组犬小肠各段ZO-1蛋白均匀一致地分布在肠上皮细胞边缘以及细胞膜顶端。
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图 1 试验犬小肠各段ZO-1阳性表达水平(400 ×)注：Y. 阴性对照；A. 对照组；B. 脾虚组；C. 自然恢复组；D. 加味四君子汤组；1. 十二指肠；2. 空肠；3. 回肠；下同。Figure 1. The positive expression level of ZO-1 in the small intestine of the experimental caninesNote: Y. negative control; A. control group; B. spleen deficiency group; C. natural recovery group; D. supplementary SJZD group; 1. duodenum; 2. jejunum; 3. ileum; the same as below.由图2可知：试验犬小肠各段均有ZO-1蛋白阳性表达产物，且十二指肠、空肠和回肠的ZO-1蛋白阳性表达量变化一致。脾虚组犬ZO-1蛋白阳性表达量极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬ZO-1蛋白阳性表达量虽有升高但仍低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬ZO-1蛋白阳性表达量明显恢复，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
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图 2 试验犬小肠各段ZO-1平均光密度值注：同一组织不同处理组相比，图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；下同。Figure 2. The density mean of ZO-1 in the small intestine of the experimental caninesNote: Among different groups in the same tissues different small letter superscripts indicate significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts indicate extremely significant difference (P<0.01); the same as below.2.2 试验犬小肠各段紧密连接蛋白Occludin的表达水平
试验犬小肠各段Occludin蛋白IHC检测结果如图3所示：棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色。可见对照组犬小肠各段Occludin蛋白分布主要与肠上皮边缘与小肠腺内。
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图 3 试验犬小肠各段Occludin阳性表达水平Figure 3. The positive expression level of Occludin in the small intestine of the experimental canines由图4可知：试验犬小肠各段均有Occludin蛋白阳性表达产物，且十二指肠、空肠和回肠的Occludin蛋白阳性表达量变化一致。脾虚组犬Occludin蛋白阳性表达量极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬Occludin蛋白阳性表达量虽有升高但仍低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬Occludin蛋白阳性表达量明显恢复，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
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图 4 试验犬小肠各段Occludin平均光密度值Figure 4. The density mean of Occludin in the small intestine of the experimental canines2.3 小肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin mRNA的相对表达量
由图5可知：十二指肠、空肠和回肠ZO-1、Occludin mRNA相对表达量的变化一致。脾虚组犬ZO-1、Occludin mRNA的相对表达量极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬ZO-1、Occludin mRNA的相对表达量略有回升，但是仍然显著低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬ZO-1、Occludin mRNA的相对表达量恢复至正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
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图 5 试验犬小肠各段ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量Figure 5. The relative expression level of ZO-1 and Occludin mRNA in small intestine of the experimental canines2.4 Western-blot分析结果
2.4.1 试验犬小肠各段紧密连接蛋白的表达水平
由图6~8可知：十二指肠、空肠和回肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达变化一致。脾虚组犬紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达水平极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬ZO-1、Occludin的表达水平较脾虚组犬升高(P<0.01)，但仍极显著低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬ZO-1、Occludin的表达水平显著升高，较对照组犬无差异显著性(P>0.05)。
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图 6 试验犬十二指肠ZO-1和Occludin蛋白印迹及表达水平注：蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-action 蛋白灰度值；下同。Figure 6. Western-blot and expression level of ZO-1 and Occludin in duodenum of caninesNote: protein relative expression = target protein grey value/β-action protein grey value; the same as below.![]()
图 8 试验犬回肠ZO-1和Occludin蛋白印迹及表达水平Figure 8. Western blot and expression level of ZO-1 and Occludin in ileum of canines![]()
图 7 试验犬空肠ZO-1和Occludin蛋白印迹及表达水平Figure 7. Western-blot and expression level of ZO-1 and Occludin in jejunum of canines2.4.2 试验犬小肠各段ERK/MAPK相关通路蛋白的表达水平
由图9~11可知：十二指肠、空肠和回肠相关通路蛋白Ras、MEK、ERK1/2以及p-ERK1/2的表达变化基本一致。脾虚组犬相关通路蛋白的表达水平极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬相关通路蛋白的表达水平较脾虚组犬升高(P<0.01)，但仍极显著低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬相关通路蛋白的表达水平较脾虚组和自然恢复组犬极显著升高(P<0.01)，与对照组犬相比差异显著(P<0.05，P<0.01)或不显著(P>0.05)，但整体趋向对照组水平。
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图 9 试验犬十二指肠ERK/MAPK通路相关蛋白印迹及表达水平Figure 9. Western blot and expression level of correlation proteins of ERK/MAPK pathway in duodenum of canines![]()
图 11 试验犬回肠ERK/MAPK通路相关蛋白印迹及表达水平Figure 11. Western blot and expression level of correlation proteins of ERK/MAPK pathway in ileum of canines![]()
图 10 试验犬空肠ERK/MAPK通路相关蛋白印迹及表达水平Figure 10. Western blot and expression level of correlation proteins of ERK/MAPK pathway in jejunum of canines3. 讨论
脾虚证是中医常见证候，脾虚型泄泻在临床中极为常见，《症因脉治·内伤泄泻》记载：“脾虚泻之因，脾气素虚，或大病后，过用寒凉，或饮食不节，劳伤脾胃，皆成脾虚泄泻之症，脾胃湿困，中气下陷”[11]。脾虚时，脾运化功能失职，水湿运化无力，湿注肠道以致脾虚湿盛之症(如泄泻严重、食少纳呆、神态萎靡、消瘦等)。大量研究表明[12-14]：脾虚泄泻时肠黏膜通透性增加，肠道屏障功能遭受破坏。四君子汤方剂可以有效治疗脾虚证候，修复肠黏膜，本试验选用番泻叶复制脾虚模型犬，从肠道机械屏障的角度深入研究脾虚证的发病机制以及加味四君子汤的作用机理。
3.1 加味四君子汤对脾虚犬小肠机械屏障功能的影响
肠道是摄取营养物质和水的主要器官，同时，它也构成了抵御外部环境中有害物质和病原体的重要屏障。正常肠道黏膜屏障主要由机械屏障、化学屏障、生物屏障及免疫屏障构成，其中由肠上皮细胞及其紧密连接等构成的机械屏障最为重要，不仅是肠黏膜抵御外环境中病原体或有害物质侵入机体的关键，也是维持肠上皮选择通透性及其屏障功能的结构基础[15-17]。有研究表明：调节肠黏膜上皮的紧密连接蛋白可以增强肠黏膜机械屏障功能，即肠黏膜上皮细胞间的紧密连接是维持肠道机械屏障的重要组成部分和结构基础，是决定肠道通透性大小的主要因素[18]。紧密连接作为细胞间最重要的连接方式，主要由4种跨膜蛋白(Occludin、Claudins、tricellulin和JAM)和ZOs、AF6、cingulin、rab3B、7H6和symplekin等胞质分子以及细胞骨架结构等共同构成紧密连接蛋白复合物[19-20]，其“拉链样”吻合结构能有效封闭细胞间隙，阻碍毒性大分子的侵袭。YU等[21]研究发现：PI-IBS小鼠结肠黏膜上皮屏障功能被破坏，紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达量降低。林汉杰等[22]研究发现：UC模型大鼠结肠黏膜损伤，IHC检测大鼠结肠Occludin蛋白表达较正常组低，四君子汤可以有效增加Occludin蛋白表达，促进试验性UC大鼠结肠黏膜屏障功能的修复。本试验中，应用IHC、RT-PCR和Western-blot 3种不同的方法对脾虚犬小肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin进行测定，结果均显示两种蛋白表达水平较对照组犬极显著降低(P<0.01)，经加味四君子汤治疗后的加味四君子汤组试验犬上述指标较脾虚组犬均极显著提高(P<0.01)，基本恢复至正常水平(P>0.05)。此结果提示，脾虚时小肠紧密连接相关蛋白表达水平降低，破坏小肠黏膜机械屏障功能，而加味四君子汤可以有效增加小肠紧密连接相关蛋白的表达水平，促进脾虚犬小肠黏膜机械屏障功能修复，这可能是加味四君子汤有效治疗脾虚证候的机制之一。
3.2 加味四君子汤对ERK/MAPK信号通路的影响
紧密连接调节的信号通路以及跨膜蛋白和肌动蛋白环之间的相互作用受几种信号蛋白的调控，包括蛋白激酶C (PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和Rho家族的小GTP酶[18]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的细胞信号传导系统是1条重要的信号转导通路，广泛存在于真核细胞内。细胞外信号调节激酶(ERK)是MAPK家族中最早发现也是最重要的亚类，Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径[23]，不同信号有不同的启动机制激活该途径。Ras分子量为21 ku，是1条多肽链组成的单体蛋白，与GTP结合，促使Ras的激活而成为有活性的Ras蛋白质。MEK有MEK1、MEK2两个亚型，分子量分别是43 ku和45 ku，活化的MEK磷酸化Tyr/Thr，并激活下游底物ERK1/2。ERK有ERK1、ERK2两个亚型，分子量分别是44 ku和42 ku，是Ras丝裂原信号转导下游的核心原件。ERK/MAPK通路的主要传导途径遵循MAPKs的三级酶促级联反应，即Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPK激酶的激酶(MAPKKK)，MEK作为MAPK激酶(MAPKK)，ERK即为MAPK。ERK1/2的磷酸化(p-ERK1/2)被认为是ERK信号通路活化的标志之一[23-24]。本试验应用Western-blot方法检测了小肠组织中ERK/MAPK通路相关蛋白Ras、MEK1、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平，结果显示：脾虚犬小肠组织中ERK/MAPK通路相关蛋白Ras、MEK1、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平极显著低于对照组犬(P<0.01)，经加味四君子汤治疗后加味四君子汤组试验犬小肠组织中ERK/MAPK通路相关蛋白的表达水平较脾虚组和自然恢复组犬极显著升高(P<0.01)，与对照组犬相比差异显著(P<0.05，P<0.01)或不显著(P>0.05)，但整体上呈现明显的恢复趋势。表明脾虚时小肠中ERK/MAPK通路相关蛋白Ras、MEK1、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平低，该通路处于被抑制状态，而加味四君子汤能够促进通路相关蛋白的表达，在一定程度上激活了ERK/MAPK通路。
综上所述，脾虚时肠道紧密连接蛋白表达水平显著降低，说明脾虚证候与肠黏膜机械屏障功能低下密切相关；经加味四君子汤治疗后肠道紧密连接蛋白表达水平升高，提示加味四君子汤可通过调节肠道紧密连接蛋白的表达，保护肠道机械屏障的结构与功能。同时，犬脾虚时ERK/MAPK通路被抑制，加味四君子汤能激活ERK/MAPK通路，增强小肠紧密连接蛋白的表达水平。
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图 1 不同浓度NaCl胁迫对秋萍植株光合特性的影响
注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)；下同。
Figure 1. Effects of different concentrations of NaCl stress on the photosynthetic characteristics of Qiuping
Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant difference among different treatments (P<0.01); the same as below.
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图 2 不同浓度NaHCO3胁迫对秋萍植株光合特性的影响
Figure 2. Effects of different concentrations of NaHCO3 stress on the photosynthetic characteristics of Qiuping
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图 3 不同浓度NaCl和NaHCO3胁迫对秋萍叶片光合色素含量的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of NaCl and NaHCO3 stress on the photosynthetic pigments of Qiuping
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图 4 不同浓度NaCl和NaHCO3胁迫对秋萍叶片保护酶活性的影响
Figure 4. Effects of different concentrations of NaCl and NaHCO3 stress on the leave protective enzyme activity of Qiuping
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图 5 不同浓度NaCl和NaHCO3胁迫对秋萍叶片渗透调节物质含量的影响
Figure 5. Effects of different concentrations of NaCl and NaHCO3 stress on the leave osmotic adjustment substances of Qiuping
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图 6 不同浓度NaCl和NaHCO3胁迫对秋萍叶片丙二醛含量的影响
Figure 6. Effects of different concentrations of NaCl and NaHCO3 stress on the leave malondialdehyde content of Qiuping
表 1 2种钠盐胁迫下秋萍的落叶数
Table 1 Numbers of fallen leaves of Qiuping under two kinds of sodium salt stress
c/(mmol·L−1) NaCl胁迫 NaCl stress NaHCO3胁迫 NaHCO3 stress 0 (CK) 2.00±0.00 d 2.00±0.00 ab 30 0.67±0.33 e 1.00±0.58 c 60 1.67±0.33 de 1.67±0.33 ab 90 2.67±0.33 cd 2.00±0.00 ab 120 3.33±0.33 bc 2.33±0.67 b 150 4.00±0.58 b 3.67±0.33 a 180 5.33±0.67 a 4.00±0.00 a 注：不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments (P<0.05).
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