茶树休眠相关基因CsAGL8的克隆与表达分析
克隆茶树CsAGL8基因序列，并探究该基因与茶树休眠的关系。
以峨眉问春等茶树品种的休眠芽为材料，采用RT-PCR扩增MADS-box转录因子家族基因CsAGL8，并进行BLAST比对等生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR检测CsAGL8在茶树8个组织和越冬期间的相对表达量；遗传转化拟南芥，对转基因植株进行表型观测及开花相关基因分析。
CsAGL8的CDS全长为720 bp，编码239个氨基酸，含有高度保守的MADS-box结构域和半保守的K-box结构域，与拟南芥的AtAGL8相似性最高。CsAGL8编码区表现出一定的多态性，启动子区域存在较多的光、激素和胁迫响应等顺式作用元件。表达分析表明：CsAGL8在茶树不同组织中均有表达，在休眠顶芽中的表达量最高；越冬期间，CsAGL8的表达量呈先升高后降低的趋势，在特早生品种峨眉问春芽中的相对表达量显著低于对照品种，且下调时间早于对照品种。过表达CsAGL8，拟南芥转基因植株会早花10~15 d。
CsAGL8可能参与了茶树越冬休眠调控。
Cloning and Expression Analysis of a MADS-box Gene CsAGL8 in the Tea Plant (Camellia sinensis)
To clone the CsAGL8 gene sequence of tea plant and to explore the relationship between this gene and tea plant dormancy.
The MADS-box transcription factor family gene CsAGL8 was cloned from the dormant buds of the tea cultivar ‘Emei Wenchun’ by RT-PCR, and bioinformatics analysis such as BLAST comparison was performed. The relative expression levels in eight tissue samples and during overwintering were determined by qPCR. Genetic transformation of Arabidopsis thaliana, to observe the phenotype of transgenic plants and analyze the flowering-related genes.
The CDS of CsAGL8 was 720 bp, which encoded 239 amino acids, and contained a highly conserved MADS-box domain and a semi-conserved K-box domain. CsAGL8 showed the highest similarity to AtAGL8 from A. thaliana. The coding region of CsAGL8 showed polymorphisms, and many cis-acting elements such as light, hormone, and stress response were found in the promoter region. Expression analysis showed that CsAGL8 was expressed in different tissues of tea plants, and the highest expression was detected in the dormant terminal buds. During the overwintering process, the expression of CsAGL8 increased first and then decreased. Compared with the regular tea cultivar, the expression levels of CsAGL8 were not only significantly lower, but also down-regulated earlier in the buds of the extra-early cultivar ‘Emei Wenchun’. Overexpression of CsAGL8 in A. thaliana promoted early flowering for 10-15 days.
CsAGL8 may be involved in the regulation of winter dormancy in tea plants.
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Keywords:
- Camellia sinensis /
- MADS-box /
- gene cloning /
- expression analysis /
- dormancy
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)也称蓝耳病，是由PRRSV引起的一种以母猪流产和各年龄段猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病[1-3]。PRRSV属尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arteriviridae)，单股正链RNA病毒，基因组全长为15.4 kb[4-5]。PRRSV基因组编码的结构蛋白有GP2a、2b (E)、GP3-5、GP5a、M和N蛋白，其中囊膜糖蛋白GP5，基质蛋白M和核衣壳蛋白N是主要结构蛋白[6]。1987年，该病首先在北美被发现，此后在世界范围内广泛传播，给养猪业带来了巨大损失[7]。PRRSV有多种临床表现，最主要的特征是对妊娠母猪生殖功能的影响，妊娠晚期流产、木乃伊胎数量增加等。自1996年中国首次报道PRRS以来，该病在中国长期流行，危害巨大，是影响中国养猪业的重大传染病之一[8]。
PRRSV的正确诊断对于其防控有重要意义。目前病毒的分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及荧光定量PCR (fluorescent quantitative PCR, QPCR)是实验室常用的检测方法[9]。GOU等[10]利用反转录环介导等温扩增与垂直流核酸检测条结合，为PRRSV检测提供了一种通用方法。近年来，以PRRSV N蛋白为抗原的IDEXX ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒已被广泛用来检测PRRSV抗体。以重组Nsp7蛋白作为抗原的ELISA抗体检测试剂盒也已研发，其检测结果与以PRRSV N蛋白为抗原的IDEXX ELISA符合率达到97.6%，并能用来区分1型和2型PRRSV[11]。此外，以原核表达PRRSV M和N蛋白制备的抗体检测试纸已被广泛应用[12]。LI等[13]用PRRSV N蛋白单克隆抗体标金制备PRRSV抗原检测试纸，成为有效的PRRSV临床检测工具。通过大肠杆菌表达系统制备Nsp7重组蛋白，经过亲和层析和分子筛层析纯化后标金制备PRRSV抗体检测试纸，为临床检测PRRSV感染、疫苗免疫效果及抗体消长规律提供有力保障[14]。
免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)是基于抗原抗体特异性结合的原理，在感染PRRSV的细胞中加入抗PRRSV多抗血清，充分孵育后再加入标有辣根过氧化物酶的二抗以及催化显色反应的底物，产生的砖红色沉淀附着在细胞表面，使用普通光学显微镜即可观察和判读结果。另外，IPMA细胞板可提前制备并在4 ℃条件下长期保存，反应结果也可长期保存并随时观察分析，目前还未见商品化的PRRSV IPMA抗体检测试剂盒。因此，本试验建立了PRRSV IPMA检测体系，通过优化反应条件和检测的特异性、敏感性，为PRRSV的防控和检测提供新方法。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂
DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和AEC显色液购自索莱宝生物公司。胎牛血清购自Gibco。TRIzol试剂、反转录试剂盒和EX Taq酶购自TAKARA公司。PRRS X3 ELISA抗体试剂盒购自IDEXX公司。PRRSV抗体检测试纸由河南农科院免疫学重点实验室研发并惠赠。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗猪的二抗购自Jackson Immune Research公司。脱脂奶粉、甲醇等试剂均为国产分析纯。
1.2 病毒、血清与细胞
Marc-145细胞由本实验室冻存，PRRSV病毒HN07-1株(GeneBank登录号为：KX766378.1)由河南农科院动物免疫学重点实验室分离并惠赠。PRRSV多抗血清由本实验室制备保存。
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type-2, PCV-2)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus infection, PPV)和口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 多抗血清由本实验室保存，使用IDEXX PRRS X3 ELISA抗体检测试剂盒检测，结果显示繁殖与呼吸综合征抗体均为阴性。用于符合率试验的300份血清取自河南洛阳、驻马店、平顶山、登封和三门峡地区5家猪场(采样猪均大于两周龄)。
1.3 IPMA方法的建立
将Marc-145细胞接种于96孔板中，长满80%以上孔时接种PRRSV，加入2%胎牛血清的DMEM培养基(维持液)放置于CO2培养箱中继续培养，同时设置未接毒的对照组；弃去病毒液，用PBST洗涤细胞3次；用预冷的无水甲醇固定细胞，加入5%脱脂奶封闭过夜；加入抗PRRSV多抗血清稀释液，37 ℃放置40 min；用PBST洗涤细胞3次；加入HRP-山羊抗猪二抗稀释液，37 ℃放置40 min；用PBST洗涤细胞3次；加入AEC显色液室温下作用5 min，洗去显色液倒置显微镜下观察，并记录试验结果。
1.4 IPMA反应条件优化
首先，采用组织半数感染(TCID50)方法测定PRRSV的滴度。Marc-145细胞用PBS洗涤3次，胰蛋白酶消化4 min，加入含有10%胎牛血清的生长液终止消化，反复吹打，使其细胞单个分散；后用排枪分别加入96孔板中，次日观察细胞变化，若细胞达到80%时，即可接种PRRSV。将病毒液按10倍系列稀释为10−1~10−10共10个稀释梯度，并分别接种于长满单层Marc-145细胞的培养液中，每个稀释梯度接种8孔，100 μL/孔，并留8个不接毒的孔作为空白对照，培养5 d，记录各孔细胞病变情况，出现病变即为感染，及时记录感染结果，重复操作3次取平均值。根据Reed-Muench法计算TCID50。
为了确定最佳IPMA反应条件，对病毒的接种量、培养时间和抗体稀释比例进行了优化。分别用MOI=0.01、0.1、0.5和1的病毒接种细胞，分别使用稀释比例为1∶500、1∶1 000和1∶3 000的一抗孵育细胞，分别于PRRSV感染后12、24 、36 和48 h收获细胞来验证IPMA的检测效果。
1.5 IPMA敏感性检测
稀释PRRSV病毒，使病毒滴度分别为MOI=0.01、0.1、0.5和1，分别感染96孔长满底面积80%以上的Marc-145细胞板，使用1∶1 000稀释比例的一抗，PRRSV感染时间为24 h进行敏感性试验，同时设置未感染组作为对照。
1.6 IPMA重复性检测
按照1.3节方法让不同的操作者重复操作IPMA试验3次，病毒的接种量采用MOI=0.1，使用3份不同的PRRSV阳性血清和阴性血清作为一抗，一抗稀释比例均为1∶1 000，其他反应条件相同，检测IPMA试验的重复性。
1.7 IPMA特异性检测
分别使用PCV-2、PEDV、PRV、CSFV、FMDV和PPV多抗血清进行交叉反应试验，以检测该方法的特异性。即用病毒感染96孔长满底面积80%以上的Marc-145细胞板，1∶1 000稀释比例的多抗血清，PRRSV感染24 h后进行特异性试验，以PBS组作为阴性对照。
1.8 IPMA与反转录PCR符合率试验
为了验证IPMA对PRRSV检测的可靠性，使用IPMA和RT-PCR技术同时对中国河南洛阳、驻马店、平顶山、登封和三门峡地区5家猪场的300份血清进行检测比较。
参照NCBI上发布的HN07-1序列，利用NCBI在线引物设计软件Primer-Blast进行引物设计，上游引物为：5′-GCCAAATAACAACGGCAAGCA3′，下游引物为：5′-ATGAGTTGCTCCCGGGAAAG3′，扩增片段大小为332 bp。从PRRSV感染的细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA。以转录产物为模版，使用EX Taq酶进行PCR扩增。反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，共30个循环，72 ℃终延伸10 min。反应结束后4 ℃保存，加入5×核酸上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时设置阴性对照。
1.9 IPMA、试纸条及ELISA符合率试验
为了进一步评价IPMA的准确性，将无特定病原体的仔猪接种HN07-1毒株，另外3只未感染的仔猪免疫接种细胞培养液作为对照。血液样本分别在免疫后0、7、14、21、28、35 d采集，同时进行PRRSV抗体检测试纸、IDEXX PRRS X3 ELISA检测及IPMA检测。IPMA反应采用最优化的反应条件，IDEXX PRRS X3 ELISA试剂盒、PRRSV抗体检测试纸按照其说明书进行操作。
2. 结果与分析
2.1 IPMA反应条件的确定
采用组织半数感染(TCID50)方法测得PRRSV的滴度为1×10−6.25/mL。病毒接种结果显示：PRRSV接种MOI=0.01、0.1、0.5、1感染细胞24 h后都能够看到砖红色，随着PRRSV滴度增加颜色也加深，经过摸索发现MOI=0.1的感染量最为合适(图1)。
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图 1 不同感染复数的PRRSV感染细胞后IPMA检测结果Figure 1. IPMA results of cells infected with PRRSV of different multiplicity infection使用MOI=0.1的PRRSV感染细胞，使用一抗的稀释浓度为1∶500背景颜色较深，提示有非特异性结合现象产生。使用一抗稀释浓度为1∶1 000颜色适中，一抗稀释浓度为1∶3 000时背景颜色较浅。结果显示：一抗稀释比例1∶1 000结果最佳(图2)。
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图 2 不同稀释比例的一抗处理细胞后的IPMA检测效果Figure 2. The detection effect of IPMA treated with different dilution ratios of primary antibody使用MOI=0.1的PRRSV感染细胞，使用稀释浓度为1∶1 000的一抗孵育细胞，摸索PRRSV感染细胞12、24、36和48 h后IPMA检测的着色效果。结果显示在24 h显色效果最佳，36 和48 h大部分细胞发生着色(图3)。
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图 3 PRRSV感染细胞不同时间的IPMA检测效果Figure 3. IPMA detection effect of PRRSV infected at different time2.2 IPMA的敏感性
敏感性试验结果显示：随着PRRSV稀释比例不断增大，IPMA显色程度也发生相应变化，砖红色逐渐由深变浅，当使用MOI=0.01的病毒感染细胞仍可以使细胞发生着色(图1)，而阴性对照不着色，表明IPMA检测方法敏感性良好。
2.3 IPMA的重复性
不同的操作者重复操作IPMA试验3次，采用MOI=0.1的PRRSV感染细胞板，使用3份不同的PRRSV阳性血清和阴性血清作为一抗，一抗稀释比例均为1∶1 000，其他反应条件相同，结果发现IPMA试验的重复性良好。
2.4 IPMA的特异性
特异性试验结果显示：除了PRRSV血清的IPMA检测结果为阳性外，PCV-2、PEDV、PRV、CSFV、FMDV和PPV检测结果均为阴性，表明本试验建立的PRRSV IPMA检测方法具有良好的特异性。
2.5 IPMA与反转录PCR的符合率
IPMA检测的阳性血清样品再使用RT-PCR进行检测。图4显示：病毒阳性对照组及IPMA阳性样品中都能扩增到1条特异性条带，大小约为332 bp，PBS对照组无任何扩增产物。
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图 4 RT-PCR检测结果注：M.分子量标准；1. PBS对照组；2~3. PRRSV阳性血清组。Figure 4. The results of reverse transcription PCRNote: M. the molecular weight standard；1. PBS control group；2-3 are PRRSV positive sera group.为了进一步检测IPMA的有效性和可靠性，用IPMA与RT-PCR对河南洛阳、驻马店、平顶山、登封和三门峡地区5家猪场送检300份样品进行检测，并统计阳性和阴性符合率。阳性符合率为86.9%；阴性符合率为95.2% (表1)。
表 1 IPMA与反转录PCR检测田间感染情况比较Table 1. Detection PRRSV antibodies at different days after PRRSV infection in pig farm usingIPMA and RT-PCRIPMA RT-PCR 阳性结果
positive results阴性结果
negative results总数
total阳性结果positive results 206 3 209 阴性结果negative results 31 60 91 总数total 237 63 300 2.6 IPMA、ELISA和试纸的符合率
将IPMA与IDEXX PRRS X3 ELISA抗体检测试剂盒及PRRSV抗体检测试纸3种检测方法进行比较，使用血清样本采集自HN07-1攻毒的实验猪。在攻毒前7 d采集血清，试纸条、 IDEXX PRRS X3 ELISA及IPMA检测结果均为阴性。攻毒后14 d，IPMA及IDEXX PRRS X3 ELISA试剂盒检测所有血清样本均为阳性，试纸条检测结果有2头猪为阳性，1头为阴性；感染后21 d，3种检测手段结果都为阳性(表2)。总之，IPMA与试纸条的符合率为17/18，即94%，IPMA与IDEXX PRRS X3 ELISA试剂盒符合率为18/18，即100%。
表 2 IPMA、IDEXX PRRS X3 ELISA试剂盒和试纸条3种检测方法比较Table 2. Detection PRRSV antibodies at different days after PRRSV infection using IPMA、IDEXX PRRS 3X ELISA kit and the test strip感染后时间/d
days post infection检测方法
methodsHN07-1 1 2 3 0 IPMA − − − ELISA 0 0 −(0.007) Strip − − − 7 IPMA − − − ELISA −(0.086) −(0.007) −(0.044) Strip − − − 14 IPMA + + + ELISA +(1.345) +(1.97) +(0.639) Strip + + − 21 IPMA + + + ELISA +(1.658) +(1.732) +(1.324) Strip + + + 28 IPMA + + + ELISA +(1.658) +(1.765) +(1.804) Strip + + + 35 IPMA + + + ELISA +(1.783) +(1.751) +(1.368) Strip + + + 3. 讨论
目前，IPMA在畜禽传染病领域已经被广泛应用。张振仓等[15]建立了CSFV的IPMA检测体系，并确定其具有良好的灵敏性和特异性，为CSFV检测方法的开发奠定基础。在PCV-1和PCV-2型检测中，建立的IPMA检测方法与ELISA检测结果符合率达86%以上[16]。PPV IPMA检测方法与ELISA及血凝试验的符合率分别为98%和96%[17]。在猪肠增生病检测方面，IPMA与间接荧光试验(indirect immuno fluorescence, IFA)的检测结果几乎一致[18]。
目前，IFA和ELISA常用来检测血清中抗体。IPMA和其他免疫学检测方法一样，是一种抗原抗体特异性结合的实验方法，具有特异强、敏感性高、操作简单、对设备要求不高、实验结果可以长期保存等特点。此检测仅需一台普通的光学显微镜，且实验所需试剂耗材成本低，这些特点使得此方法有利于在临床应用中长期推广，适用于流行病学调查。
在本研究中，通过对实验条件的优化最佳病毒接种量MOI值为0.1，最佳的病毒感染时间为24 h，一抗最佳稀释度为1∶1 000，所建立的PRRSV IPMA检测方法与其他几种临床流行猪病无交叉反应。对300份来自不同地区的临床血清进行检测，IPMA与PCR检测的阳性符合率达86.9%。将HN07-1攻毒的实验猪用IPMA与IDEXX PRRS X3 ELISA抗体检测试剂盒及PRRSV抗体检测试纸3种检测方法进行比较，IPMA与试纸条的符合率为94%，与IDEXX PRRS X3 ELISA试剂盒符合率为100%。研究结果表明：该方法具有良好的特异性和敏感性，有一定的应用和推广价值。但IPMA检测方法也有局限性，当PRRSV含量太低时不产生特异性的显色反应，其样本的阳性检出率比PCR和ELISA等检测方法略低，并且存在一定主观判断的偏差。综上所述，本研究建立了PRRSV的IPMA检测体系，优化并确定了该检测方法的最佳反应条件，为检测PRRSV的临床检测提供新工具。
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图 1 CsAGL8的克隆(a)、氨基酸序列(b)、三级结构和CDD保守域(d)
Figure 1. Gene cloning (a), amino acid sequence (b), tertiary structure (c) and conserved domain of CDD (d) of CsAGL8
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图 2 CsAGL8的多态性和基因结构分析
注：a) 不同品种的cDNA序列对比，“*”表示从对应茶树品种中克隆得到的CsAGL8序列，无“*”则表示从数据库下载的序列；b) 保守基序分析；c) 基因结构图。
Figure 2. Polymorphism and gene structure analysis of CsAGL8
Note: a) comparison of cDNA sequences of CsAGL8 gene in different cultivar, “*” indicates the CsAGL8 sequence cloned from the corresponding tea varieties; no “*” indicates the sequence downloaded from the database; b) conserved motif analysis; c) gene structure.
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图 3 CsAGL8在不同植物的系统进化分析 (a)与同源氨基酸序列对比 (b)
Figure 3. Phylogenetic analysis (a) and homologous amino acid sequence alignment (b) of CsAGL8 in different plants
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图 5 EW和CC2中CsAGL8基因的组织特异性表达
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 5. Tissue special expression of the CsAGL8 gene in EW and CC2
Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below.
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图 6 CsAGL8基因在茶树叶(a)和芽(b)越冬过程中的表达
Figure 6. Expression of CsAGL8 gene during overwintering of tea plant leaves (a) and buds (b)
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图 7 CsAGL8异源转化拟南芥表达分析
注：a) 野生型(Co1-0，WT)和转基因型(D128-4和D128-10)拟南芥种植35 d后的表型；b) 开花时间分析；c) CsAGL8的表达量；d) 转基因植株及对照开花相关基因的表达水平。
Figure 7. Overexpression analysis of CsAGL8 in Arabidopsis
Note: a) phenotype of wild-type (Co1-0, WT) and transgenic Arabidopsis (D128-4和D128-10) on the 35 days; b) analysis of flowering days; c) expression level of CsAGL8; d) expression level of flowering-related genes in transgenic plants and the wild-type control.
表 1 用于基因克隆和实时荧光定量的引物序列
Table 1 Primer sequences used for the gene cloning and qRT-PCR
引物/基因名称
primer/gene name引物序列 (5′→3′)
primer sequence用途
useCsAGL8 F：ATGGGGAGAGGGAAGGT；R：TCAAAGCAAATAAAACATACT 克隆 cloning qCsAGL8 F：CCTACTTCAAATGGTTCAAAGGCAC；R：TGGCGGAGTATAGCATCTAATTGGT 表达 expressing qAtFD F：GCGCTAGGAAACAGGAATGCTTATACAAA；R：AGCTGTGGAAGACCGTTGAAGTGTG 表达 expressing qAtFLC F：GACTAGAGCCAAGAAGACCG；R：GAAGATTGTCGGAGATTTGT 表达 expressing qAtCO F：CCGGGTCTGCGAGTCATG；R：GGCATCATCTGCCTCACACA 表达 expressing qAtFT F：GAGACCCTCTTATAGTAAGCAGAGTTG；R：GGGAGTTCAAGTGAAAGAACCAAAGT 表达 expressing qAtSOC1 F：GCTCTCAGTGCTTTGTGATGC；R；AAGAACGTACTTGGAGCTGGC 表达 expressing qAtActin2 F：CTTGCACCAAGCAGCATGAA；R：CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT 内参 internal reference qCsGAPDH F：GATAGTGTTCACGGTCAATGGA；R：GCAGCAGCCTTATCCTTATCAG 内参 internal reference 
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