7个候选内参基因在樟叶越橘不同组织中的表达及稳定性分析
筛选樟叶越橘不同组织部位基因表达分析的最适内参基因。
基于樟叶越橘三代转录组测序数据，筛选出PP2A-1、PP2A-2、EIF-4A-1、EIF-4A-2、60S-1、60S-2和ARP-1共7个候选内参基因；利用qRT-PCR技术对目标基因在樟叶越橘不同组织(嫩叶、成熟叶、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿果果梗和红果果梗)的表达水平进行检测，应用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法分析评估基因表达的稳定性，通过RefFinder方法综合评价以筛选出樟叶越橘不同组织的最适内参基因；以樟叶越橘绿原酸合成途径中苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的组织表达情况验证内参基因稳定性评价结果的可靠性。
樟叶越橘的不同组织中，60S-2基因表达的稳定性居于首位，其次是PP2A-2基因，ARP-1、60S-1和EIF-4A-2基因表达的稳定性居中，EIF-4A-1基因表达的稳定性最差。应用60S-2内参基因分析获得的樟叶越橘不同组织中PAL基因表达量与绿原酸含量的变化趋势一致，表明PAL基因参与了樟叶越橘体内绿原酸的合成。
供试的7个候选基因中，能在樟叶越橘不同组织最稳定表达的内参基因是60S-2。研究结果为后续其他功能基因在该植物不同组织中的表达研究提供了最适内参基因选择参考。
Expression and Stability Analysis of Seven Candidate Reference Genes in Different Tissues of Vaccinium dunalianum Wight
To select appropriate reference genes for gene expression analysis in different tissues of Vaccinium dunalianum Wight.
Based on the transcriptome sequencing data of the third generation, seven candidate reference genes (PP2A-1, PP2A-2, EIF-4A-1, EIF-4A-2, 60S-1, 60S-2 and ARP-1) were selected. The expression level of candidate reference genes was detected by qRT-PCR in eight different tissues of V. dunalianum (tender leaves, mature leaves, flower buds, flowers, green fruits, red fruits, green fruit stems and red fruit stems). Firstly, geNorm, NormFinder and BestKeeper methods were used to analyze and evaluate the stability of gene expression, and then RefFinder method was used to comprehensively evaluate the optimal reference genes in different tissues of V. dunalianum. Finally, the tissue expression of phenylalanine ammonia-lyase gene (PAL) in chlorogenic acid synthesis pathway was analyzed to verify the reliability of the evaluation results of the appropriate reference gene.
In the different tissues of V. dunalianum, the expression stability of 60S-2 was the best, followed by PP2A-2 gene, and the expression stability of ARP-1, 60S-1 and EIF-4A-2 were in the middle, the expression stability of EIF-4A-1 was the worst. Using 60S-2 gene as the reference gene, the variation trend of PAL gene expression and chlorogenic acid content in different tissues was consistent, indicating that PAL gene was involved in the synthesis of chlorogenic acid in V. dunalianum.
60S-2 is the most stable reference gene for the seven candidate genes tested in different tissues of V. dunalianum, which provides the most appropriate reference gene for subsequent studies on the expression of other functional genes in different tissues of V. dunalianum.
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Keywords:
- 60S-2 /
- reference genes /
- qRT-PCR /
- Vaccinium dunalianum Wight
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三七[Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen]又名田七，为五加科人参属植物，是中国极有经济和药用价值的名贵中药材[1-3]。随着市场需求量的不断增加，三七种植面积不断扩大[4]。近年来，三七的种植和加工已成为云南省地方经济发展的重要支柱产业[5]。
目前，三七的生产方式主要是传统农田种植模式。传统模式生产中，三七的连作障碍发生严重[6]，造成三七再植困难，种植用地短缺[7]。近年来，朱有勇院士带领团队创新种植模式，在云南省澜沧县利用丰富的林下资源开展林下三七有机种植，让中药材回归山野林中[8-9]，这不仅解决了连作障碍带来的无地可种的困境，更为边疆贫困山区脱贫致富做出了贡献[9-10]。在林下种植三七病害发生很轻，通过避雨的栽培方法，不用农药就可以控制叶部病害和根腐病的发生，但调查中发现林下三七有根结线虫病发生。三七根结线虫病主要危害其药用部位，形成大量小米至绿豆大小、近似圆球形的根结，同时线虫侵入造成的伤口又为其他病原物的侵入打开了通道，可以与细菌、病毒和真菌等共同作用，引发复合病害[11]，对三七的产量和品质造成巨大影响。由于三七的种植年限较长，再加上根结线虫病属于积年流行性病害，其危害显得更加突出。
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种危害植物根系，以侧根和须根发病严重，并诱发植物根系畸变形成根结的一类专性固着内寄生线虫[11]，具有寄主广、致病性强、繁殖快和易传播扩散等特性[12]，是园艺和大田作物中最具经济破坏力的植物寄生线虫之一[13]。目前国际上报道的根结线虫有100多种，其寄主植物高达3000余种，遍及花卉、蔬菜、经济作物、药材、果树和粮食等[14-15]。1997—1998年，胡先奇等[16-17]在云南省晋宁县首次发现并报道了北方根结线虫危害三七。随后杨佩文等[12]、陈昱君等[18-19]和马光泉等[20]报道了云南文山、砚山、马关和蒙自等三七种植主产区根结线虫病发生情况和危害状况，经形态学、同工酶电泳和分子生物学(SCAR-PCR)等方法鉴定了这4个地区的三七病原根结线虫种群均为北方根结线虫(M. hapla)。以上报道均是传统农地种植方式下发生的三七根结线虫病，根结线虫是农田中常见的土壤习居病原物，在自然林尤其是松林下的土壤环境中很少出现。2016年在澜沧思茅松林下三七的病害调查中发现了根结线虫病，且有蔓延扩展的趋势，而迄今为止尚未发现思茅松感染根结线虫的迹象，松林土壤中的病原线虫从何而来成为未解之谜。三七根结线虫病目前缺乏有效的防治手段，传统的防治主要依赖施用杀线虫剂处理土壤，但带来的问题是农残超标而影响入药的安全性，这是林下种植三七过程需要杜绝的，而生物防治虽然安全但见效慢。因此，明确危害三七的病原线虫从哪里来，从源头上阻止病害的发生，可以为安全、有效、绿色的防控三七根结线虫病提供保障。
本研究采用形态学方法结合分子生物学SCAR-PCR技术对澜沧县林下有机三七种植基地和三七育苗基地的三七根结线虫病病原种类及中间寄主种类进行调查鉴定，以期明确澜沧县危害林下基地和育苗基地三七的病原根结线虫种类及其传播来源，为林下三七根结线虫病的研究和防治提供依据，保障云南林下三七种植产业的健康发展。
1. 材料与方法
1.1 三七植株病情调查
2019年7月，对云南省澜沧县竹塘乡大塘子林下有机三七种植基地、大塘子和哈果马三七育苗基地进行土壤采样和线虫病害调查。每个基地均采取五点取样法，每点取样不少于30株，根际土壤样品不少于100 g，借助小锄头将三七轻轻挖起，检查根部，按照国内同类研究马金慧等[21]和王婷等[22]的病情分级标准对调查的三七进行分级并记录。将采集的三七样品和土壤样品分别放于标记好的样品袋中，带回实验室保存于4 ℃冰箱备用。统计分析并计算每个基地的发病率和病情指数。
发病率＝感病株数/调查总株数×100%；
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1.2 感病杂草种类调查
分别对大塘子林下有机三七种植基地、大塘子和哈果马三七育苗基地周围的杂草进行调查，每个基地均采用倒置“W”九点取样法，每个样方面积为0.25 m2 (50 cm×50 cm)[23]，调查并统计每个样方内杂草的种类和株数，采用形色软件初步鉴别杂草种类，然后拍照，对照《中国农田杂草原色图谱》[24]进行进一步识别，并将有根结的杂草带回实验室进行镜检及鉴定病原。
采用杂草的相对丰度值(RA)来衡量杂草的重要程度。计算公式如下[25]：
杂草频度(PF)=某种杂草出现的样方数/调查样方的总数；
相对频率(RF)=某种杂草PF值/该区域所有杂草种PF值之和；
相对密度(RD)=某种杂草株数/区域内所有物种植株总数；
杂草相对丰度(RA)=RF+RD。
1.3 线虫分离及会阴花纹形态鉴定
采用浅盘法分离根际土壤样品中的线虫，收集线虫并在体视显微镜下计数。从感病三七和杂草根结内分离雌成虫，参照刘维志[26]和谢辉[27]的方法制作病原根结线虫雌成虫会阴花纹，在显微镜下观察会阴花纹的形态特征。
1.4 分子生物学鉴定
1.4.1 根结线虫DNA提取
将感病三七和杂草的根部洗净，在解剖镜下挑取成熟的单头雌成虫，放于装有5 μL灭菌ddH2O的灭菌PCR管中，参照ADAM等[28]的方法提取病原线虫DNA。将DNA提取液置于−20 ℃冰箱中备用。
1.4.2 病原根结线虫SCAR-PCR特异性鉴定
采用DONG等[29]和冯光泉等[20]设计的2对北方根结线虫特异性引物，分别编号为Mh-F1/Mh-R1和Mh-F2/Mh-R2，分别以侵染三七和杂草的病原线虫为模板进行SCAR-PCR扩增，预期扩增片段长度为1500和462 bp。PCR反应体系(50 μL)：5×Trans Start® Fastpfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Trans Start®DNA polymerase 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，病原线虫DNA模板 2 μL，灭菌ddH2O 31 μL。引物Mh-F1/Mh-R1的扩增条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，进行35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物Mh-F2/Mh-R2的扩增条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，进行35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
2. 结果与分析
2.1 根结线虫危害情况
调查结果发现：大塘子林下有机三七种植基地、大塘子和哈果马三七育苗基地的三七均受根结线虫危害，其症状表现主要在根部，即在三七的大、小枝根上，形成大量大小不等的近似米粒状或圆球形的根结(图1)，枝根上新长出的须根被侵染后也形成稚嫩的新的根结(图1a)。经长时间反复多次侵染，严重的三七根部已形成密密麻麻的根结或根瘤(图1b)。根结线虫侵染初期或三七受害较轻时，植株的地上部分无症状表现；三七受害较重时，植株地上部生长缓慢，叶片黄化或萎蔫，长势衰弱，呈缺水缺肥状。
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图 1 云南澜沧三七根结线虫病症状Figure 1. Symptoms of P. notoginseng root knot nematode disease in Lancang County of Yunnan Province大塘子思茅松林下有机三七种植基地(N22°80′39″，E99°78′16″，海拔1481 m)十余年前是农地，退耕还林十多年，基地内三七种植方式为生态有机种植，目前三年生三七地上部长势良好。经病害调查发现：大塘子思茅松林下有机三七种植基地根结线虫病发病率为19.66%，病情指数为10.43，平均每100 g土壤含虫量为11.3条。由于思茅松的荫蔽和根系强烈的化感作用，林下基地的杂草种类和数量都显然不足以引起这么严重的病害，推测可能移栽进基地的种苗上有根结线虫病。
大塘子三七育苗基地(N22°48′18″，E99°46′56″，海拔1460 m)和哈果马三七育苗基(N22°47′73″，E99°47′58″，海拔1560 m)至今一直是农地，前茬作物为玉米或旱稻，大塘子育苗基地于2018年1月采取种子播种的方式进行种植，目前二年生种苗地上部长势良好；哈果马育苗基地于2019年1月采取种子播种的方式进行种植，目前一年生种苗地上部长势良好。调查结果表明：两育苗基地的种苗均发生根结线虫病，其中大塘子三七育苗基地的发病最严重，发病率高达66.82%，病情指数达到33.18，平均每100 g土壤含虫量高达33.2条；而哈果马育苗基地的发病相对较轻，发病率为15.25%，病情指数为7.62，平均每 100 g 土壤含虫量为10.6条。经分析发现：根结线虫病发生的严重程度同三七根结线虫病发生年限密切相关，即三七根结线虫病属于积年流行性病害，随着种植年限的增加，病原线虫在土壤中的虫口密度越大，危害越严重。
2.2 中间寄主杂草种类调查结果
调查结果表明：大塘子思茅松林下有机三七种植基地分布杂草97种，其中发生根结线虫病的杂草有隶属菊科、伞形科的紫茎泽兰和积雪草2种(表1、图2)。根据杂草的分布丰度和根结线虫寄生的程度可以判断紫茎泽兰和积雪草是林下三七根结线虫病的中间寄主，其中紫茎泽兰为林下基地的草本优势种，相对丰度较高，线虫危害较严重，平均根结百分率高达92.45% (表1)，因此可初步推测紫茎泽兰可能为主要中间寄主。
表 1 澜沧县三七根结线虫病发病地块杂草种类调查Table 1. Investigation of weed species in P. notoginseng root knot nematode affected areas调查地点
survey location优势杂草/%
dominant species相对丰度/%
relative abundance有根结杂草种类
rooted weeds平均根结百分率/%
average root knot percentage大塘子林下有机三七
种植基地
organic P. notoginseng planting base in forest Datangzi紫茎泽兰
Ageratina adenophora (Spreng.)
R.M. King et H.Rob90.51 紫茎泽兰
A. adenophora (Spreng.)
R.M. King et H.Rob92.45 荩草
Arthraxon hispidus (Thunb.) Makino38.12 积雪草
C. asiatica (L.) Urban15.78 艾 Artemisia argyi 25.85 牡蒿 Artemisia japonica Thunb. 11.63 糯米团
Gonostegia hirta (Bl.) Miq.5.86 大塘子育苗基地
Datangzi nursery base阔叶丰花草
Borreria latifolia (Aubl.) K. Schum.91.05 溪黄草
Rabdosia serra (Maxim.) Hara94.45 鬼针草
Bidens pilosa L.51.09 紫茎泽兰
A. adenophora (Spreng.)
R.M. King et H.Rob87.13 野茼蒿
Crassocephalum crepidioides
(Benth.) S. Moore45.24 鬼针草
B. pilosa L.61.45 紫茎泽兰
Ageratina adenophora (Spreng.)
R.M. King et H.Rob12.45 六棱菊
L. alata (D. Don) Sch.-Bip. ex Oliv56.18 地毯草
Axonopus compressus (Sw.) Beauv.6.21 豆茶决明
Cassia nomame (Sieb.) Kitagawa45.66 野茼蒿
C. crepidioides
(Benth.) S. Moore41.25 香薷
Elsholtzia ciliate (Thunb.) Hyland32.61 哈果马育苗基地
Hagoma nursery base阔叶丰花草
Borreria latifolia (Aubl.) K. Schum.90.14 一点红
Emilia sonchifolia (L.) DC24.75 野茼蒿
Crassocephalum crepidioides
(Benth.) S. Moore52.07 积雪草
C. asiatica (L.) Urban16.28 鬼针草
Bidens pilosa L.47.92 草玉梅
Anemone rivularis Buch.-Ham10.52 紫茎泽兰
Ageratina adenophora (Spreng.)
R.M. King et H.Rob13.8 豨莶
Siegesbeckia orientalis L.5.13 糯米团
Gonostegia hirta (Bl.) Miq.4.73 艾 A. argyi 3.63 ![]()
图 2 澜沧县三七根结线虫中间寄主杂草感病症状图注：a) 豆茶决明；b) 溪黄草；c) 紫茎泽兰；d) 鬼针草；e) 六棱菊；f) 野茼蒿；g) 香薷；h) 一点红；i) 积雪草；j) 草玉梅；k) 豨莶；l) 艾。Figure 2. Symptoms of the weeds in the intermediate host of the root knot nematode of P. notoginseng in Lancang CountyNote: a) C. nomame (Sieb.) Kitagawa; b) R. serra (Maxim.) Hara; c) A. adenophora (Spreng.) R.M. King et H.Rob; d) B. pilosa L.; e) L. alata (D. Don) Sch.-Bip. ex Oliv; f) C. crepidioides (Benth.) S. Moore; g) E. ciliate (Thunb.) Hyland; h) E. sonchifolia (L.) DC; i) C. asiatica (L.) Urban; j) A. rivularis Buch.-Ham; k) S. orientalis L.; l) A.argyi Levl. et Van.大塘子和哈果马三七育苗基地的杂草类型基本一致，分布杂草124种，其中有隶属菊科、唇形科、伞形科、豆科和毛茛科等5科，有12种相同的杂草发生根结线虫病(表1、图2)。其中，溪黄草、紫茎泽兰、六棱菊、豆茶决明、香薷、积雪草、草玉梅和艾等8种杂草为多年生草本植物；鬼针草、野茼蒿、一点红和豨莶为一年生草本；其中鬼针草、野茼蒿和紫茎泽兰同为两基地的优势杂草，且这3种优势杂草线虫危害严重，平均根结百分率高达41.25%以上(表1)。可初步推测溪黄草、紫茎泽兰、鬼针草、六棱菊、豆茶决明、野茼蒿、香薷、一点红、积雪草、草玉梅、豨莶和艾等12种杂草可能为三七育苗基地病原线虫的中间寄主，其中鬼针草、野茼蒿和紫茎泽兰可能为主要中间寄主。
2.3 雌成虫会阴花纹形态学鉴定结果
通过观察澜沧各基地感病三七和感病杂草上的病原线虫雌成虫的形态特征，发现雌成虫均为乳白色梨形状(图3a)，且雌成虫会阴花纹特征相同(图3c、d)：花纹多为卵圆形，背弓稍扁平，背腹线纹相遇处有一定的角度，有的形成“翼”，侧线不明显，线纹从波浪形到平滑形变化，肛门至2个侧尾线之间有一片刻点区，与杨佩文等[12]报道的危害云南三七主产区的北方根结线虫的描述相符。因此，初步判断澜沧县感病三七和感病杂草上的病原线虫相同，均为北方根结线虫(M. hapla)。
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图 3 根结线虫雌成虫及会阴花纹注：a) 雌成虫；b) 二龄幼虫；c)和d) 雌成虫会阴花纹。Figure 3. Female adult of root knot nematode and perineal patternNote: a) female adult; b) second-stage juveniles; c) and d) perineal pattern.2.4 感病三七病原线虫SCAR-PCR鉴定结果
从林下基地及育苗基地的三七上分离出来的雌成虫DNA作为模板，分别用北方根结线虫的2对特异性引物Mh-F1/Mh-R1和Mh-F2/Mh-R2进行单引物SCAR-PCR鉴定。结果表明(图4)：林下及2个育苗基地三七上的所有供试线虫均扩增得到1500 bp (图4a)和462 bp (图4b)大小的特异性条带，分别与2对北方根结线虫特异性引物设计相符，与阳性对照(实验室保存的北方根结线虫标准种)一致，且以ddH2O为阴性对照的扩增中未出现特异性条带，表明感染澜沧县大塘子林下基地和2个育苗基地的三七的病原线虫相同，均为北方根结线虫(M. hapla)。
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图 4 感病三七病原线虫特异性引物PCR扩增电泳检测结果注：M. DNA标准分子量；CK1. 北方根结线虫(云木香)(阳性对照)；1~3、4~6和7~9. 分别对林下、大塘子和哈果马育苗地病原线虫的扩增结果；CK2. ddH2O (阴性对照)。Figure 4. Detection results of specific primers PCR amplification and electrophoresis for the pathogenic nematodes of P. notoginsengNote: M. DNA Marker; CK1. M. hapla was from Saussurea costus (positive control); 1-3, 4-6, 7-9. the amplification results for pathogenic nematodes from understory plantation, Datangzi nursery and Haguoma nursery; CK2. ddH2O (negative control).2.5 感病杂草病原线虫SCAR-PCR鉴定结果
将杂草上分离到的根结线虫通过北方根结线虫特异性引物Mh-F1/Mh-R1和Mh-F2/Mh-R2进行SCAR-PCR鉴定病原种类。结果表明(图5)：有11种杂草的雌成虫与阳性对照(三七上分离鉴定的北方根结线虫)均分别扩增得到1500 bp (图5a)和464 bp (图5b)大小的特异性条带，与2对特异性引物设计相符，而杂草艾(图5a-12、5b-12)的雌成虫和阴性对照ddH2O扩增中未出现特异性条带，表明侵染11种杂草的根结线虫为北方根结线虫(M. hapla)，与侵染三七的根结线虫相同，因此可以进一步明确以上11种杂草为三七病原根结线虫的中间寄主。
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图 5 澜沧县杂草根结线虫特异性引物PCR鉴定电泳图注：M. DNA标准分子量；CK1. 北方根结线虫(三七)(阳性对照)；1. 溪黄草；2. 紫茎泽兰；3. 鬼针草；4. 六棱菊；5. 豆茶决明；6. 野茼蒿；7. 香薷；8. 一点红；9. 积雪草; 10. 草玉梅；11. 豨莶；12. 艾草；CK2. ddH2O (阴性对照)。Figure 5. Detection results of specific primers PCR amplification and electrophoresis for weeds root knot nematodes in Lancang CountyNote: M. DNA Marker; CK1. M. hapla (P. notoginseng) (positive control); 1. R. serra (Maxim.) Hara; 2. A. adenophora (Spreng.) R.M. King et H.Rob; 3. B. pilosa L.; 4. L. alata (D.Don) Sch.-Bip. ex Oliv; 5. C. nomame (Sieb.) Kitagawa; 6. C. crepidioides (Benth.) S. Moore; 7. E. ciliata (Thunb.) Hyland; 8. E. sonchifolia (L.) DC.; 9. C. asiatica (L.) Urban; 10. A. rivularis Buch.-Ham; 11. S. orientalis L.; 12. A. argyi Levl. et Van.; CK2. ddH2O (negative control).3. 讨论
调查发现大塘子思茅松林下有机三七种植基地根结线虫发病率为19.66%，病情指数为10.43。思茅松林生境下分布杂草97种，其中发生根结线虫病的杂草2种，根据杂草的分布丰度和根结线虫寄生的程度可以判断紫茎泽兰和积雪草是林下三七根结线虫病的主要中间寄主。土根结线虫为土壤习居的专性寄生生物，以土传的方式进行传播。大塘子思茅松林下有机三七种植基地十余年前是农地，退耕还林十多年，农地中根结线虫残留至今的可能性微乎其微。大塘子思茅松林下有机三七种植基地采用当地种苗，即种苗来源于大塘子和哈果马三七育苗基地，这2个育苗基地均采取种子播种的方式进行种植，未从外地调运种苗，因此可以判断病原线虫来自本地土壤。根据云南农业大学线虫研究室的前期调查，澜沧地区农田作物的根结线虫优势种类为爪哇根结线虫(M. javanica)，而林下三七上发生的根结线虫病病原与紫茎泽兰和积雪草2种杂草上的同为北方根结线虫，其中紫茎泽兰为思茅松林下的草本优势种，可以推测林间杂草紫茎泽兰是三七根结线虫病的主要侵染来源，土壤中根结线虫种类的演化过程可能是在退耕还林后。由于思茅松的荫蔽和根系强烈的化感作用，当地大部分原有的农地植物因不能适应而退出生态系统，而抗逆性很强的入侵植物紫茎泽兰则继续生长蔓延，目前已知自然条件下仅发现北方根结线虫可以侵染紫茎泽兰[30]，通过多年的筛选和富集，思茅松林下土壤中原本微量的北方根结线虫逐渐上升为土壤优势病原线虫种群，当林下种植三七后转而侵染三七，引起了林下三七根结线虫病的发生。但是由于松林的荫蔽作用林下基地里的杂草种类和数量都显然不足以引起这么严重的病害，推测可能移栽进基地的种苗上有根结线虫病。
通过2个育苗基地的病害调查和种类鉴定结果表明：三七种苗发生严重的根结线虫病，尤其是大塘子三七育苗基地的根结线虫危害最严重，发病率高达66.82%，病情指数达到33.18。大塘子和哈果马育苗基地未种三七前一直是农用地，上茬作物为玉米或旱稻。经调查发现：大塘子和哈果马三七育苗基地的田间杂草种类丰富，杂草类型基本一致，在相同的生境下分布杂草124种，有隶属菊科、唇形科、伞形科、豆科和毛茛科等5科11种杂草发生根结线虫病，其中紫茎泽兰为多年生优势草本，鬼针草和野茼蒿为一年生优势草本，可以推测溪黄草、紫茎泽兰、鬼针草、六棱菊、豆茶决明、野茼蒿、香薷、一点红、积雪草、草玉梅和豨莶等11种杂草为三七育苗基地病原线虫的寄主，其中鬼针草、野茼蒿和紫茎泽兰可能为主要寄主。由此可见，2个育苗基地未种三七之前不仅通过紫茎泽兰等多年生杂草累年富集，同时借助一年生杂草尤其是优势杂草鬼针草和野茼蒿快速大量繁殖北方根结线虫，使其逐渐上升为土壤中优势病原线虫种群，当三七种子发芽长根后，病原线虫转而侵染三七，引起了育苗地的三七种苗发生严重的根结线虫病。
病原根结线虫种类的准确鉴定是进一步研究病原线虫致病性、与寄主植物的互作关系、生物学及防治技术措施的基础[31]。当前国内外研究者通常采用将形态学和分子生物学相结合的方法来鉴定根结线虫种类[32]。本研究主要通过观察三七病原根结线虫雌成虫的会阴花纹形态特征，同时结合SCAR-PCR方法进行特异性鉴定，明确了危害澜沧县林下及育苗基地三七的病原线虫为北方根结线虫(M. hapla)，与胡先奇等[16-17]、陈昱君等[18-19]、杨佩文等[12]和冯光泉等[20]相继报道的云南文山、砚山、马关和蒙自等三七种植主产区的三七根结线虫病病原相同。三七根结线虫病在云南首次报道至今已经有20余年，令人惊奇的是尽管北方根结线虫并不是云南农田中的常见种，但至今从云南各地采集的三七根结线虫病样本中鉴定出的病原只有北方根结线虫1种。因此，三七是否对南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫等农田常见种具有抗性、抗病机制如何值得深入研究。目前对三七根结线虫病的研究仅停留在对其病原线虫种类的鉴定及其分布，今后仍需进一步深入研究三七与北方根结线虫的互作机制并解析其机制，将有助于合理利用三七植株本身的抗性，设计完善经济、高效、安全的三七根结线虫病防病栽培技术体系，为云南三七种植产业的健康发展提供有力的支持。
4. 结论
本研究首次明确了澜沧县思茅松林下有机三七基地及三七育苗基地的三七根结线虫病病原的种类及来源，研究结果可为防治三七根结线虫提供理论依据，为建立三七根结线虫综合防治技术体系提供借鉴，为保证三七产业的良好发展提供保障。
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图 1 供试樟叶越橘的不同组织
注：TL. 幼嫩叶片；ML. 成熟叶片；FB. 花芽；F. 花；GF. 绿色果实；RF. 红色果实；GRS. 绿果果梗；RFS. 红果果梗；下同。
Figure 1. Different tissues of Vaccinium dunalianum in this experiment
Note: TL. tender leaves; ML. mature leaves; FB. flower buds; F. flowers; GF. green fruits; RF. red fruits; GFS. green fruit stems; RFS. red fruit stems; the same as below.
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图 2 樟叶越橘8个样品总RNA电泳检测
注/Note: M. DL2000 Marker; 下同/the same as below.
Figure 2. Electrophoresis detection of total RNA from eight samples of V. dunalianum
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图 3 樟叶越橘7个候选内参基因PCR产物
注/Note: 1. PP2A-1; 2. PP2A-2; 3. EIF-4A-1; 4. EIF-4A-2; 5. 60S-1; 6. 60S-2; 7. ARP-1.
Figure 3. PCR products of the seven candidate reference genes in V. dunalianum
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图 5 7个候选内参基因的综合排名
Figure 5. Comprehensive ranking of the seven candidate reference genes
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图 6 樟叶越橘不同组织绿原酸含量和PAL基因相对表达量
注：不同小写字母表示差异显著( P<0.05)。
Figure 6. Chlorogenic acid content and relative expression level of PAL gene in different tissues of V. dunalianum
Note: Different lowercase letters indicate significant differences ( P<0.05).
表 1 候选内参基因及PAL的qRT-PCR引物
Table 1 qRT-PCR primers of candidate reference genes and PAL
内参基因
reference gene基因序列号
accession number引物序列 (5'→3')
primer sequence产物长度/bp
length of products熔解温度/ ℃
melting temperaturePP2A-1 ON799221 F：GCCCGAGTATCTTCTTGT
R：AGCAGACCTCCTCACCAT129 52.6
54.9PP2A-2 ON799222 F：CGCCTCAACATTATCAGC
R：GAACCCTCCAATGCCTAT118 52.6
52.6EIF-4A-1 ON799224 F：ATCTACAACTACGGCTTCG
R：TTGAGTAGCCAGTTCCCT207 53.0
52.6EIF-4A-2 ON799223 F：GCATTGGGTGACTATCTTG
R：AGTGACTGTCTCCGCAAC146 53.0
54.960S-1 ON799225 F：TGAGGGAGGAGTGGTTTG
R：GCCACTAGGCACAATCTTCT160 54.9
55.460S-2 ON637115 F：AGCACCTGAACCTGGATT
R：GATAGCAGCGGTGGACTT104 52.6
54.9ARP-1 ON799226 F：GAAGGGACCAAAGCAATC
R：CTCCCACTTGTTTCCTCC161 52.6
54.9PAL OK624457 F：TCGCATCAATACCCTCCTCC
R：AAGAGAGAGGGACCAAGTCG146 59.7
55.7
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表 2 8个组织样品总RNA的质量检测
Table 2 Quality determination of total RNA in eight tissues of Vaccinium dunalianum
样品名称
name of sampleρRNA/(ng·μL−1) OD260/280值
OD260/280 value成熟叶片 mature leaves 118.80 2.15 幼嫩叶片 tender leaves 256.00 2.07 花芽 flower buds 90.10 2.02 花 flowers 57.40 1.89 绿色果实 green fruits 236.00 1.97 红色果实 red fruits 371.80 1.92 绿果果梗 green fruit stems 122.60 1.91 红果果梗 red fruit stems 67.30 1.89
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表 3 7个候选内参基因的扩增效率
Table 3 Amplification efficiency of seven candidate reference genes
内参基因
reference
gene标准曲线
standard
curve线性相关系数 (R2)
linear correlation
coefficientPCR扩增效率/%
PCR amplification
efficiencyPP2A-1 y=−3.372x+20.906 0.9975 97.95 PP2A-2 y=−3.163x+23.586 0.9996 107.08 EIF-4A-1 y=−3.158x+21.888 0.9971 107.35 EIF-4A-2 y=−3.087x+22.986 0.9920 110.81 60S-1 y=−3.544x+20.356 0.9916 91.51 60S-2 y=−3.398x+20.108 0.9986 96.92 ARP-1 y=−3.261x+22.540 0.9968 102.63
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表 4 geNorm软件分析内参基因的表达稳定性
Table 4 Expression stability of reference genes analyzed by geNorm software
内参基因
reference geneM 值
M value排名
rank60S-2 0.88 1 PP2A-2 0.88 1 ARP-1 1.01 2 EIF-4A-2 1.15 3 60S-1 1.38 4 PP2A-1 1.53 5 EIF-4A-1 1.66 6
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表 5 NormFinder软件分析内参基因的表达稳定性
Table 5 Expression stability of reference genes analyzed by NormFinder software
内参基因
reference geneS 值
S value排名
rank60S-2 0.36 1 60S-1 0.58 2 PP2A-2 0.78 3 ARP-1 0.81 4 PP2A-1 0.84 5 EIF-4A-2 1.12 6 EIF-4A-1 1.26 7
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表 6 BestKeeper软件分析内参基因的表达稳定性
Table 6 Expression stability of reference genes analyzed by BestKeeper software
内参基因
reference gene几何平均数
geometric mean算数平均数
arithmetical mean最小值
minimum最大值
maximum变异系数
coefficient of variation标准差
standard deviation相关系数 (r)
correlation coefficient排名
rank60S-2 26.81 26.98 22.29 31.33 9.31 2.51 0.98 1 60S-1 27.05 27.26 23.31 32.48 11.62 3.17 0.97 2 EIF-4A-2 26.20 26.29 22.53 29.20 7.03 1.85 0.92 3 ARP-1 30.38 30.51 26.66 35.00 7.78 2.37 0.94 3 PP2A-2 27.65 27.80 24.22 31.71 9.37 2.61 0.94 4 PP2A-1 28.91 29.16 24.14 35.20 11.46 3.34 0.97 4 EIF-4A-1 29.14 29.44 23.95 36.09 13.02 3.83 0.96 5
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