溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病的主要形式之一，炎症始于直肠，并向结肠近端不断延伸，继而分布于部分或整个结肠中^[1]。近年来，世界UC发病率呈上升趋势，症状多以腹痛、腹泻、黏液血便和里急后重为主^[2]。由于UC发病机理尚不清楚，当前治疗多以缓解病情为主，临床上治疗UC的药物以5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)为主^[3]，搭配激素与免疫抑制剂，虽有一定疗效，但常伴随诸多不良反应^[4]。蚯蚓作为动物性中药材在中国已有几千年的应用历史^[5]，《本草纲目》虫部42卷中用蚯蚓入药的处方就有40多种，如治疗口疮、刀箭伤等。有研究表明蚯蚓提取物(earthworm extracts，EE)具有抗菌消炎、促进创面愈合等作用^[6-8]。本研究通过建立葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的小鼠UC模型^[9]，采用不同剂量EE进行干预，探究EE能否缓解UC炎症，以期为EE抗UC药效成分的挖掘及蚯蚓药用价值的开发利用提供试验依据。

1.   材料与方法

1.1   供试药物

蚯蚓：云南农业大学动物医学院卫生检测实验室自繁自养的掘穴环爪蚓。EE制备：取新鲜蚯蚓，洗净后清肠，于组织匀浆机内充分研磨，离心取上清，加入固体硫酸铵搅拌(饱和度达到80%)，静置过夜，离心取沉淀，PBS溶解沉淀灌入透析袋，透析过夜，每4 h换1次透析液。透析结束后，离心取上清得到蚯蚓蛋白，测定质量浓度(蚯蚓蛋白质量浓度为2 mg/mL)，按小鼠每日灌胃量分装于 1.5 mL无菌离心管中，−80 ℃保存。

1.2   主要试剂与仪器

试剂：DSS，北京酷莱博生物科技有限公司；5-ASA，北京索莱宝科技有限公司；粪便隐血定性检测试剂盒，上海源叶生物科技有限公司； PrimeScript RT反转录试剂盒和TB GreenPremix，宝生物工程 (大连) 有限公司；小鼠闭锁小带蛋白1 (ZO-1)、黏蛋白2 (Muc2)和咬合蛋白 (occludin) ELISA试剂盒，上海酶免生物科技有限公司。仪器：多功能酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；荧光定量PCR仪，罗氏Light Cycle (Roche)。

1.3   试验动物与处理

1.3.1   试验动物及饲养管理

C57BL/6 雌性小鼠72只，SPF级，4~6周龄，体质量(19±2) g，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，许可证号码SCXK (豫) 2020-0005，动物合格证编号No.410983220100050028。将小鼠饲养于无特定病原体级(SPF级)实验动物房，使用独立通气系统，平均室温(22±2) ℃，相对湿度(55±5)%，自由饮食。

1.3.2   试验分组与处理

经过1周适应期后对小鼠进行随机分组，每组小鼠12只，每笼饲养3只，不同药物均采用灌胃法处理，每天固定时间处理1次。采用3.5% DSS建立小鼠UC模型，期间用不同剂量的EE和阳性药物5-ASA连续干预小鼠9 d，于第10 天处死。每2 d更换新鲜配制的DSS溶液。

设置6个试验组。① 空白对照组(CK)：自由饮用无菌水，持续9 d，同时灌胃PBS；② UC模型组(DSS)：前7 d自由饮用3.5% DSS溶液，后2 d自由饮用无菌水，同时灌胃PBS；③ 模型组+EE高剂量组(DSS+EE-H)：前7 d自由饮用3.5% DSS溶液，后2 d自由饮用无菌水，同时灌胃20 mg/kg EE；④ 模型组+EE中剂量组(DSS+EE-M)：前7 d自由饮用3.5% DSS溶液，后2 d自由饮用无菌水，同时灌胃10 mg/kg EE；⑤ 模型组+EE低剂量组(DSS+EE-L) ：前7 d自由饮用3.5% DSS溶液，后2 d自由饮用无菌水，同时灌胃5 mg/kg EE；⑥ 模型组+阳性药物对照组(DSS+5-ASA)：前7 d自由饮用3.5% DSS溶液，后2 d自由饮用无菌水，同时灌胃50 mg/kg 5-ASA。

1.4   测定指标与方法

1.4.1   小鼠临床症状观察和疾病活动指数评分

给药后每天观察试验小鼠的毛色、精神状态和饮食情况等，每天固定时间对小鼠称量、观察粪便性状及粪便隐血情况，参考 HAMAMOTO等^[10]的方法进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分(表1)。DAI总分=体质量损失评分+粪便性状评分+隐血情况评分；体质量损失= (造模后某时间点的体质量－造模前体质量) /造模前体质量×100%。

表  1  疾病活动指数评分标准

Table  1.  Disease activity index scoring standard

体质量损失/% body weight loss	粪便性状 stool trait	隐血情况 occult blood	分数 score
<1	正常 normal	无 no	0
[1，5]	正常 normal	无 no	1
(5，10]	稀便 loose stools	阳性 positive	2
(10，15]	稀便 loose stools	阳性 positive	3
>15	腹泻 diarrhoea	便血 gross bleeding	4
注：正常粪便指可成形粪便，稀便指不与肛门相粘的稀状粪便，腹泻指粘于肛门的液化粪。 Note: Normal stools mean well formed pellets, loose stools mean pasty stools that do not stick to the anus, diarrhea mean liquid stools that stick to the anus.

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1.4.2   小鼠结肠组织病理分析及损伤评分

采用4%多聚甲醛固定小鼠结肠组织，石蜡包埋，并进行苏木精—伊红染色，于光学显微镜下观察病理切片，参照 EKSTRÖM^[11]的标准进行损伤评分(表2)。每只小鼠的损伤总分=上皮细胞评分+炎细胞浸润评分。

表  2  结肠组织损伤评分标准

Table  2.  Colon tissue histopathological scores standard

上皮细胞 epithelial cells	炎细胞浸润 inflammatory cell infiltration	分数 score
正常 normal	没有浸润 no infiltrate	0
杯状细胞丢失 loss of goblet cells	浸润在隐窝基底层 infiltrate the crypt basal layer	1
杯状细胞大面积丢失 large areas loss of goblet cells	浸润到达黏膜肌层 infiltrate to the muscularis mucosae	2
隐窝细胞丢失 loss of crypt cells	浸润到达黏膜肌层，明显水肿 infiltrate to the muscularis mucosae, edema	3
隐窝细胞大面积丢失 large areas loss of crypt cells	浸润到达黏膜下层 infiltrate to submucosa	4

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1.4.3   小鼠结肠组织中目标基因mRNA表达量的测定

使用 TRIzol 从小鼠结肠样本中提取总RNA并进行浓度检测，采用PrimeScript RT反转录试剂盒进行反转录。按照SYBR试剂盒说明书在荧光定量PCR仪进行目标基因表达的测定，基因的表达水平采用 2^−ΔΔCt 法进行计算。测定的目标基因引物序列见表3。

表  3  供试引物序列

Table  3.  Primer sequences for test

基因 gene	序列 (5′→3′) sequence
GAPDH	F：ACTTTGTCAAGCTCATTTCC R：TGCAGCGAACTTTATTGATG
TNF-α	F：ACCGTCAGCCGATTTGCTAT R：CCGGACTCCGCAAAGTCTAA
IL-1β	F：GGATGAGGACATGAGCACCT R：AGCTCATATGGGTCCGACAG
IL-6	F：GCCTTCTTGGGACTGATGCT R：CTGCAAGTGCATCATCGTTGT
IL-10	F：ACTGGCATGAGGATCAGCAG R：AGAAATCGATGACAGCGCCT

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1.4.4   小鼠结肠组织中目标蛋白表达量的测定

准确称取结肠组织，按质量(mg)∶体积(μL)为1∶9的比例加入9倍体积的匀浆介质(0.9%生理盐水) ，冰水浴条件下机械匀浆，制备成10%匀浆液，于2 500 ~3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书测定ZO-1、Muc2和occludin蛋白的表达量。

1.5   数据统计与分析

采用GraphPad Prism 9.0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

2.   结果与分析

2.1   EE对DSS诱导结肠炎小鼠一般体征和体质量的影响

由图1可知：CK组小鼠体质量持续增加，其他试验组小鼠于第2天开始体质量下降，各试验组小鼠均出现活跃度降低、精神状态不佳等情况。与CK组相比，DSS组小鼠体质量极显著下降(P<0.01)；与DSS组相比，经不同剂量EE处理和5-ASA治疗后，DSS+EE-H组、DSS+EE-M组和DSS+5-ASA组小鼠体质量极显著升高 (P<0.01)、DSS+EE-L组小鼠体质量显著升高 (P<0.05)。说明EE可以缓解DSS诱导的结肠炎小鼠体质量下降。

图  1  不同处理组小鼠体质量的变化

注：CK. 空白对照组，DSS. 溃疡性结肠炎模型组，DSS+EE-H. 模型组+蚯蚓提取物高剂量组，DSS+EE-M. 模型组+蚯蚓提取物中剂量组，DSS+EE-L. 模型组+蚯蚓提取物低剂量组，DSS+5-ASA. 模型组+阳性药物对照组；与CK组相比，“#”表示差异显著(P<0.05)，“##”表示差异极显著(P<0.01)；与DSS组相比，“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)；下同。

Figure  1.  Changes in body weight of mice indifferent treatment groups

Note: CK. control group, DSS. ulcerative colitis model group, DSS+EE-H. DSS+earthworm extracts high-dose group, DSS+EE-M. DSS+earthworm extracts medium-dose group, DSS+EE-L. DSS+earthworm extracts low-dose group, DSS+5-ASA. DSS+5-ASA-dose group; compared with CK group, “#” indicates significant difference (P<0.05), “##” indicates extremely significant difference (P<0.01); compared with DSS group, “*” indicates significant difference (P<0.05), “**” indicates extremely significant difference (P<0.01); the same as below.

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2.2   EE对DSS诱导结肠炎小鼠DAI评分的影响

由图2可知：CK组中小鼠体质量持续增加，大便外观正常，没有粪便隐血；随着连续摄入3.5% DSS水溶液，其他试验组小鼠逐渐出现体质量减轻、精神状态不佳、血便、腹泻等临床症状，其DAI评分明显升高。与CK组相比，DSS组小鼠DAI评分极显著增高(P<0.01)，第5天开始出现便血，大便松软，到第9天时评分达到最高；与DSS组相比，DSS+EE-H组、DSS+EE-M组、DSS+EE-L组和DSS+5-ASA组小鼠的DAI评分极显著降低(P<0.01)。说明EE呈剂量依赖性降低DSS诱导的结肠炎小鼠DAI评分。

图  2  不同处理组小鼠疾病活动指数评分

Figure  2.  Disease activity index of mice indifferent treatment groups

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2.3   EE对DSS诱导结肠炎小鼠脾脏肿大的影响

由图3可知：与CK组小鼠脾脏质量相比，经DSS诱导后小鼠脾脏质量极显著增加(P<0.01)，脾脏肿大；与DSS组小鼠脾脏相比，经EE处理和5-ASA治疗后，DSS±EE-H组、DSS±EE-M组、DSS+EE-L组和DSS+5-ASA组的脾脏肿大现象均得到极显著改善(P<0.01)。说明EE能在一定程度上改善DSS诱导的结肠炎小鼠脾脏肿大。

图  3  不同处理组小鼠脾脏质量变化

Figure  3.  Changes in spleen weight of mice in different treatment groups

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2.4   EE对DSS诱导结肠炎小鼠结肠长度的影响

由图4a可知：CK组小鼠肠道内容物形态完整，为颗粒状，无血便和稀便；而DSS组结肠肠道呈暗红色，肿胀，内容物减少，粪便形态不完整，有血便；经EE处理和5-ASA治疗后，肠道肿胀情况得以改善，粪便残留具有一定的形状，血便和稀便情况得以改善。由图4b可知：与CK组小鼠结肠长度相比，DSS组小鼠结肠长度极显著缩短(P<0.01)；与DSS组相比，经EE处理和5-ASA治疗后，DSS+EE-H组和DSS+EE-M组结肠缩短现象极显著改善(P<0.01)，DSS+EE-L组和DSS+5-ASA组结肠缩短现象显著改善(P<0.05)。说明EE可以改善DSS诱导的结肠炎小鼠结肠缩短，保护小鼠结肠组织。

图  4  不同处理组小鼠结肠长度的变化

Figure  4.  Changes in colon length of mice in different treatment groups

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2.5   EE对DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织病理损伤的影响

由图5a可知：CK组黏膜层肠上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常、排列紧密，固有层肠腺丰富，可见较多杯状细胞，未见明显炎症。与CK组相比，DSS组黏膜层可见较大面积溃疡，肠上皮细胞及隐窝结构被破坏，杯状细胞基本消失，并伴有较多炎性细胞浸润，部分炎性细胞浸润至黏膜下层。与DSS组相比，经过EE处理和5-ASA治疗后，病变程度有较大缓解，炎性病变范围减小，隐窝结构和组织上皮细胞恢复完整，炎性浸润的程度减少。图5b可知：与CK组相比，DSS组小鼠损伤评分极显著升高(P<0.01)；与DSS组相比，DSS+EE-H组和DSS+EE-M组小鼠的损伤评分极显著降低(P<0.01)，DSS+5-ASA组小鼠的损伤评分显著降低(P<0.05)。说明EE可以缓解DSS诱导的小鼠结肠组织病理性损伤。

图  5  不同处理组小鼠结肠组织学观察(200×)及损伤评分

注：GC. 杯状细胞；IC. 炎状细胞。

Figure  5.  Histological proximal sections and histopathological scores of colon of mice in different treatment groups

Note: GC. goblet cell; IC. inflammatory cell.

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2.6   EE对DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中炎症因子mRNA的影响

由图6可知：与CK组相比，DSS组促炎细胞因子TNF-α、IL-6和 IL-1β以及抗炎因子IL-10的表达量极显著增加(P<0.01)；与DSS组相比，经EE处理和5-ASA治疗后，促炎细胞因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的表达量均显著或极显著下降(P<0.01或P<0.05)，抗炎因子IL-10的表达量均升高，其中，DSS+EE-H组和DSS+EE-M组极显著升高(P<0.01)，DSS+EE-L组显著升高(P<0.05)。说明EE可以通过调控炎症因子平衡来缓解小鼠UC，且EE对相关炎症因子的调控效果优于阳性药物5-ASA。

图  6  EE对DSS诱导UC小鼠组织中炎症因子表达的影响

Figure  6.  Effects of EE on the expression of inflammatory factors in the tissue of DSS induced UC mice

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2.7   EE对DSS诱导结肠炎小鼠肠道屏障功能的影响

由图7可知：与 CK组相比，DSS组小鼠肠黏膜蛋白Muc2、ZO-1和occludin的表达量极显著降低(P<0.01)。与 DSS组相比，DSS+EE-H组、DSS+EE-M组和DSS+5-ASA组(P<0.05)的Muc2表达量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)；DSS+EE-H组和DSS+EE-M组的ZO-1表达量极显著增加(P<0.01)；DSS+EE-H组的occludin表达量极显著增加(P<0.01)。说明EE能够增加DSS诱导UC小鼠肠黏膜蛋白Muc2、ZO-1和occludin的表达量，修复肠道屏障受损和调节肠道稳态失衡。

图  7  EE对DSS诱导UC小鼠肠道屏障功能的影响

Figure  7.  Effect of EE on the intestinal barrier function in DSS induced UC mice

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3.   讨论

本研究采用自由饮用3.5% DSS诱导小鼠UC模型，小鼠在疾病发展过程中表现出与UC患者相似的症状，如体质量减轻、腹泻、活动量减少、结肠长度缩短等，与已有研究结果^{[9, 12]}一致。DAI评分和结肠长度被认为是衡量UC严重程度的常用指标，中性粒细胞浸润和上皮细胞损伤也是UC的主要组织学特征^[2]。脾脏是炎症发生严重程度的重要指标之一，炎症越严重，脾脏质量也会增大。EE处理后，小鼠DAI评分降低，体质量下降恢复，结肠长度和脾脏肿大改善，肠组织黏膜上皮损伤和炎症浸润减轻，且随着EE浓度的提高，改善效果越明显。以上结果说明EE处理对改善DSS诱导的UC小鼠临床症状和结肠病理变化具有良好的效果。

据报道，促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子之间的失衡在UC发病机制中起着重要的作用^[13]，TNF-α、IL-6和IL-1β是常见的促炎因子，IL-10是常见的抗炎因子。本研究中，DSS组抗炎因子IL-10的表达相对于正常组显著增加，这可能与自身抗炎机制激活有关，但自身抗炎机制的激活并不足以抵抗UC带来的炎症因子表达失衡。经EE处理后，TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平降低，而IL-10表达水平升高。提示EE可以通过调节炎性细胞因子分泌减轻机体炎症反应，最终达到缓解UC的作用。

本研究测定了小鼠结肠组织中与肠道屏障完整性相关的黏蛋白Muc2以及紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达情况。紧密连接是肠道屏障的重要组成部分，对维持肠上皮结构的稳定性起着重要作用，屏障功能异常是人肠道炎症的重要表征，也是发生UC的原因之一^[14]。维持肠道的屏障功能可改善其防御功能，维持其免疫功能，减轻炎症，降低此类疾病复发的可能性。本研究中，DSS组小鼠的Muc2、occludin和ZO-1表达量明显降低，这与已有研究^[15-16]结果一致；而经EE处理后，Muc2、occludin和ZO-1的表达量显著提升，表明EE可保护UC小鼠的结肠黏膜完整性和肠黏膜屏障功能。

4.   结论

蚯蚓提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)具有缓解作用，可减轻小鼠结肠组织炎性损伤和UC症状，保护结肠黏膜完整性和屏障功能。