菜豆(Phaseolus vulgaris L.)也称芸豆、四季豆、刀豆等，是深受大众喜爱的蔬菜之一，在闽西地区广泛种植。菜豆属喜温蔬菜，但不耐高温，生长最适温度为20~30 ℃；其幼苗对温度的适应性较高，但对温度变化敏感，温度超过35 ℃时生长发育不良^[1]，高温胁迫后菜豆幼苗叶绿素含量降低，抗氧化酶活性发生不同程度的变化^[2]。近年来，全球温室效应导致闽西地区极端高温天气频繁发生，露地及设施大棚栽培常出现40 ℃以上高温危害，高温胁迫可对作物幼苗外部形态结构和生理造成伤害^[3-5]。在夏延秋栽培过程中，高温胁迫已成为限制当地菜豆幼苗生长的主要因素之一，如何提高菜豆在生产中抵御高温胁迫的能力已成为当地农户关注的焦点。

高温胁迫下施用外源生长调节物质被认为是提高作物高温耐受力的有效方法^[6]，适时、科学地利用外源物质可以有效减轻高温伤害，提高植物耐高温的能力^[7-8]。气体信号分子一氧化氮(nitric oxide，NO)可调控种子萌发和开花等植物生长发育过程^[9-10]，近年来在非生物逆境防御反应中的作用备受关注^[11]。尚宏芹等^[12]研究认为：外源NO的直接供体硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)通过诱导抗氧化酶活性和提高渗透调节物质含量进而减轻细胞的膜脂过氧化，增强了高温胁迫下辣椒幼苗的耐热性；吴雪霞等^[13]研究表明：SNP处理能够显著提高抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，缓解高温胁迫对茄子幼苗的氧化损伤，增强茄子的耐热性。目前，鲜有关于高温胁迫下喷施外源NO对菜豆幼苗相关生理特性影响的研究。本研究以闽西地区广泛种植的菜豆地方品种黄种豆幼苗为试材，利用人工气候箱模拟高温昼43 ℃/夜35 ℃胁迫，研究喷施外源NO供体SNP对菜豆幼苗高温胁迫及恢复生长后的缓解效应，以期为生产实践中缓解高温逆境对地方菜豆品种的伤害提供参考。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

外源NO供体SNP试剂购自福晨(天津)化学试剂有限公司，纯度大于99.0%；挑选健壮的地方菜豆黄种豆种子为试验材料，播种于72孔穴盘，待幼苗长至2~3片真叶时，挑选生长一致、健壮的植株移入光照12 h/黑暗12 h、湿度75%、光照强度约8 000 lx的人工气候箱处理48 h。

1.2   试验方法

1.2.1   幼苗高温生长试验

设置昼/夜温度各12 h的8个处理：常温对照组CK₁为25 ℃/20 ℃+清水；高温对照组CK₂为43 ℃/35 ℃+清水；高温试验组T₁~T₆为43 ℃/35 ℃条件下分别喷施0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和2.0 mmol/L SNP。每天08： 00和18： 00将清水或不同浓度的SNP液体均匀喷洒于黄种豆的叶片，至正、反叶片挂满水珠但不滴水为止，喷施处理48 h；结束后每个处理随机选取5株，先用自来水冲洗干净，后用吸水纸将植株表面水分吸干，再测定植株株高、茎粗和鲜质量，然后放置于105 ℃下杀青20 min，最后75 ℃烘干至恒质量，称取干质量。

1.2.2   幼苗恢复生长试验

根据幼苗高温生长试验结果，发现0.5、0.7和1.0 mmol/L SNP可较好地缓解高温胁迫对菜豆幼苗生长的影响，故设置昼/夜温度各12 h的5个处理：常温对照组S₀为25 ℃/20 ℃+清水；高温对照组S₁为43 ℃/35 ℃+清水；高温试验组S₂~S₄为43 ℃/35 ℃条件下分别喷施0.5、0.7和1.0 mmol/L SNP。喷施处理48 h (方法同1.2.1节)后移入常温25 ℃/20 ℃ (昼/夜)下分别恢复0、24、48和72 h，结束后从各处理组菜豆幼苗中选取长势一致的幼苗第2片真叶测定相关生理指标。

内源NO含量的测定参考张丽丽等^[14]的方法；叶绿素含量的测定采用叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收原理和方法^[15]；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法^[15]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法^[15]；脯氨酸含量的测定采用茚三酮反应法^[15]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用NBT光还原法^[16]；过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚比色法^[17]；过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外吸收法^[15]；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法^[16]。以上指标均采用苏州科铭生物技术有限公司生产的检测试剂盒测定，均以鲜质量计。

1.3   数据处理

试验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析和差异显著性分析；采用WPS 2021软件进行图、表绘制。

2.   结果与分析

2.1   高温胁迫对菜豆幼苗生长的影响

2.1.1   对外部形态的影响

由图1可知：与常温对照(CK₁)相比，高温胁迫48 h可对菜豆幼苗造成损伤，CK₂处理的菜豆生长明显受到抑制，大部分植株叶片萎蔫、变小、翻卷甚至灼伤。高温胁迫下，不同浓度SNP处理效果不同，其中T₁和T₆处理的叶片萎蔫较严重，部分幼苗出现整株枯死现象；T₂、T₃和T₅处理的叶色失绿，叶片萎蔫；T₄处理效果最好，除叶色较淡外，与CK₁差异不明显。说明适宜浓度的SNP能够缓解高温胁迫对菜豆幼苗叶片的损伤，过高或过低浓度的SNP反而会增加胁迫对幼苗的伤害。

图  1  不同处理下菜豆幼苗的生长情况

Figure  1.  Growth of Phaseolus vulgaris under different treatments

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2.1.2   对生长指标的影响

由表1可知：高温对照组CK₂菜豆幼苗的株高、茎粗、鲜质量和干质量均显著低于常温对照组CK₁，分别比CK₁降低了8.13%、21.48%、15.92%和12.00%，说明高温可显著抑制菜豆幼苗的生长发育；T₁处理的幼苗株高显著低于CK₂，茎粗、鲜质量和干质量均与CK₂无显著差异，T₆处理的各项指标均与CK₂无显著差异，说明SNP浓度过高(T₆)或过低(T₁)均不能缓解高温对菜豆幼苗生长的影响；T₂~T₅处理能有效缓解高温胁迫对菜豆幼苗生长的抑制作用，增加生长量；T₃、T₄和T₅处理间的株高、鲜质量和干质量无显著差异，但都显著高于CK₂处理；T₄和T₅处理的茎粗也显著高于CK₂处理，其中以T₄处理效果最佳。可见，高温胁迫可影响菜豆幼苗的生长，一定浓度的SNP处理可缓解高温胁迫对菜豆幼苗生长的影响，并以T₃、T₄和T₅处理的缓解效果较佳。

表  1  不同处理对菜豆幼苗生长指标的影响

Table  1.  Growth indicators of Phaseolus vulgaris under different treatments

处理 treatments	株高/cm plant height	茎粗/cm stem diameter	鲜质量/g fresh weight	干质量/g dry weight
CK1	12.80±0.23 a	4.47±0.21 a	3.14±0.10 a	0.25±0.01 a
CK2	11.76±0.45 b	3.51±0.19 d	2.64±0.11 bc	0.22±0.02 cd
T1	10.86±0.41 c	3.54±0.16 d	2.61±0.20 bc	0.21±0.01 d
T2	12.43±0.38 a	3.41±0.18 d	2.73±0.12 b	0.23±0.01 bc
T3	12.47±0.41 a	3.62±0.29 d	3.10±0.14 a	0.24±0.01 ab
T4	12.58±0.28 a	4.45±0.29 b	3.12±0.07 a	0.25±0.01 a
T5	12.32±0.16 a	4.07±0.14 c	3.07±0.12 a	0.24±0.01 ab
T6	11.32±0.76 bc	3.59±0.13 d	2.56±0.08 c	0.21±0.01 d
注：不同小写字母表示各处理间在0.05水平上差异显著。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0.05 level.

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2.2   高温胁迫对菜豆幼苗恢复生长期生理指标的影响

2.2.1   对叶绿素含量的影响

由图2可知：高温胁迫结束时(恢复生长0 h)，与高温对照组S₁相比，S₂、S₃和S₄处理能够显著提高叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，且S₃处理效果最优，分别比S₁处理增加222.00%、113.30%和177.61%；恢复生长24~72 h，S₁处理的叶绿素a含量呈下降趋势，叶绿素b和总叶绿素含量则呈现先下降后增加的趋势，S₂、S₃和S₄处理的各指标均呈上升趋势，其中S₃处理的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在恢复生长72 h均最高，且接近于常温对照组S₀。可见，外源NO能帮助菜豆幼苗抵御高温胁迫，缓解高温导致的叶绿素流失现象，其中以S₃处理的缓解效果最佳。

图  2  不同浓度SNP对恢复生长期菜豆叶片叶绿素含量的影响

注：不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著；下同。

Figure  2.  Effects of different concentrations of SNP on the chlorophyll contents of P. vulgaris leaves in the recovery growth period

Note: Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0.05 level; the same as below.

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2.2.2   对内源NO含量的影响

由图3可知：恢复生长期0 h时，高温对照组S₁处理的菜豆幼苗叶片NO含量较常温对照组S₀显著下降66.52%，S₂、S₃和S₄处理的NO浓度分别较S₁显著提高170.73%、232.02%和241.40%；恢复生长24~72 h，S₂、S₃和S₄处理的NO含量显著高于S₁处理，S₃处理在48和72 h时的NO含量已基本恢复到S₀水平，且分别较S₁处理显著提高255.04%和170.94%。说明高温胁迫后菜豆幼苗叶片NO含量急剧降低，而外源添加SNP具有显著的缓解作用。

图  3  不同浓度SNP对恢复生长期菜豆叶片NO含量的影响

Figure  3.  Effects of different concentrations of SNP on the NO contents of P. vulgaris leaves in the recovery growth period

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2.2.3   对MDA含量的影响

由图4可知：高温胁迫结束时，高温对照组S₁处理的菜豆幼苗叶片MDA含量最高，较S₀显著提高了167.38%；与S₁处理相比，不同浓度的SNP处理均能显著降低幼苗叶片MDA含量，S₂、S₃和S₄处理的叶片MDA含量分别较S₁降低了24.47%、55.08%和25.64%，解除高温胁迫，其中，S₃处理的MDA含量在恢复生长48和72 h时最低，接近常温对照S₀。说明高温胁迫后菜豆幼苗叶片MDA急剧累积，而喷施外源NO能够减少MDA含量。

图  4  不同浓度SNP对恢复生长期菜豆叶片MDA含量的影响

Figure  4.  Effects of different concentrations of SNP on the MDA content of P. vulgaris leaves in the recovery growth period

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2.2.4   对渗透调节物质的影响

由图5可知：恢复生长0 h，S₂、S₃和S₄处理的可溶性糖含量较高温对照组S₁处理显著提高了67.20%、348.05%和143.01%；随着恢复生长时间的延长(24~72 h)，S₂、S₃和S₄处理的可溶性糖含量均呈逐渐增加的趋势，且均显著高于S₁处理，其中S₃处理的可溶性糖含量在恢复生长48和72 h时与S₀处理无显著差异，分别较S₁处理显著提高了221.83%和228.79%。恢复生长0 h，S₂、S₃和S₄处理的可溶性蛋白含量显著高于S₁处理，随着恢复生长时间的延长(24~72 h)，S₂、S₃和S₄处理的可溶性蛋白含量均呈逐渐增加的趋势，且均显著高于S₁处理，其中S₃处理的可溶性蛋白含量在恢复生长48和72 h时与S₀差异不显著，分别较S₁显著提高了400.13%和396.51%。恢复生长0 h，S₂、S₃和S₄处理的脯氨酸含量显著高于S₁处理；S₃处理的脯氨酸含量在恢复生长48和72 h时与S₀含量相似，分别较S₁处理增加了65.36%和58.59%。说明外源NO能有效提高渗透调节物质的积累。

图  5  不同浓度SNP对恢复生长期菜豆叶片渗透调节物质含量的影响

Figure  5.  Effects of different concentrations of SNP on the osmoregulation substance contents of P. vulgaris leaves in the recovery growth period

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2.2.5   对抗氧化酶活性的影响

由图6可知：恢复生长0 h，S₂、S₃和S₄处理的菜豆幼苗叶片的SOD和CAT活性分别较S₁处理显著提高了153.48%、243.27%、114.24%和72.77%、100.55%、76.60%；随着恢复时间的延长，S₁处理的SOD、POD和CAT活性变化差异不大，S₂、S₃和S₄叶片的SOD、POD和CAT活性整体均呈下降的趋势，其中以S₃处理的变化最明显，缓解高温胁迫的效果最优。

图  6  不同浓度SNP对恢复生长期菜豆叶片SOD、POD和CAT活性的影响

Figure  6.  Effects of different concentrations of SNP on the SOD, POD and CAT activities of P. vulgaris leaves in the recovery growth period

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3.   讨论

高温胁迫下植株形态特征的变化可以直接反映植物对高温逆境的抗性强弱^[18-19]。本研究对常温和高温胁迫下菜豆幼苗表型变化和生物量等指标进行分析，结果显示：高温逆境可显著抑制菜豆幼苗生长，这与李书涵等^[20]对生菜的研究结果相似。喷施适宜浓度的SNP (0.5~1.0 mmol/L)能够缓解菜豆叶片萎蔫和灼伤等症状，可显著提高菜豆幼苗株高、鲜质量和干质量等指标，提高其耐热性，这与对大白菜耐热性^[21]和菊花抗高温胁迫^[22]的研究结果一致。本研究发现：0.1和2.0 mmol/L SNP不能缓解高温对菜豆幼苗的伤害，这可能是喷施低浓度的SNP达不到缓解效果，而高浓度NO进入植物体内可能导致细胞内NO浓度过高反而产生抑制作用。

正常条件下，植物体内的NO含量较低，本研究中，解除高温胁迫后，恢复生长期S₁处理叶片的NO含量显著降低，且添加外源NO处理与未经外源NO处理的菜豆幼苗叶片NO含量差异显著，说明NO在植物对高温胁迫的应答反应中起着重要作用。外源NO是否有利于高温胁迫下NO的激发还有待于进一步研究。叶绿体是进行光合作用的主要场所，对于高温胁迫非常敏感^[23]，其中的叶绿素含量直接影响光合作用^[24]。本研究中，S₁处理的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著降低，这可能是高温胁迫导致幼苗叶片叶绿体遭受了一定程度的破坏和降解^[25]，恢复生长也难以修复。齐红岩等^[26]研究发现：高温胁迫下番茄叶片中的叶绿素含量下降，这与本研究的结果一致。适宜浓度的SNP处理可使菜豆幼苗的叶绿素相对含量较S₁处理显著提高，表明叶面喷施外源NO能够增强叶绿素合成中的酶促反应，进而促进叶绿素合成，增加叶绿素含量^[27]。

植物受到高温胁迫时，渗透调节物质、细胞膜系统和抗氧化系统等一系列物质会发生变化^[28]，本研究发现：恢复生长期间，与常温对照组S₀相比，高温对照组S₁处理叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均显著降低。可溶性蛋白含量的降低可能是受到高温胁迫导致植株体内蛋白质变性而凝聚，当恢复正常温度后，已发生变性的蛋白质无法还原^[29]；可溶性糖含量的降低可能与叶片表面温度上升、细胞呼吸作用大幅度增加以及可溶性糖迅速分解有关^[30]；脯氨酸含量下降可能与其参与渗透调节、蛋白质形成和保护蛋白质分子等功能有关^[31-32]。与S₁处理相比，外施SNP能显著增加高温胁迫下菜豆的渗透调节物质含量，从而促进恢复生长期的渗透调节，提高植株应对逆境胁迫后的恢复能力。丙二醛(MDA)是高活性的脂质过氧化物，是逆境导致的膜脂过氧化反应的有害过氧化产物之一，是鉴定逆境伤害的指标之一^[33]。与S₀处理相比，S₁处理的MDA含量升高，这可能与高温胁迫造成质膜损伤、细胞结构遭到破坏^[34]以及解除高温不能及时修复有关。外施SNP能显著减少恢复生长期菜豆MDA的产生，是应对高温胁迫的积极保护机制。SOD活性对逆境条件下的植物起着重要作用，它是植物体清除自由基的第一道防线^[35]。本研究表明：CAT和SOD活性的变化相似，S₁处理的SOD和CAT活性显著降低可能与高温胁迫过于严重有关，从而导致细胞SOD和CAT合成受阻^[36]；外施SNP能显著提高SOD和CAT活性，说明叶面喷施外源NO能够增强对活性氧的清除能力，从而减轻高温逆境引起的氧损伤对植物的伤害；S₁处理POD的活性增强表明这3种抗氧化酶可能对高温胁迫的响应存在一定差异。

4.   结论

叶面喷施SNP能提高幼苗叶片内源NO含量、叶绿素含量、渗透调节物质含量和抗氧化酶活性，并降低MDA含量，提高菜豆幼苗对高温胁迫的耐受能力，加快幼苗生长恢复进程，其中以0.7 mmol/L SNP的缓解效果最好。