丁酸梭菌稳定性对肉鸡肠道菌群调控作用的影响
评估1株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)制粒及其贮存稳定性对肉鸡生长性能及肠道菌群的影响。
将200只1日龄爱拔益加(Arbor Acres，AA)肉鸡分为2组，对照组饲喂基础日粮，试验组在日粮中添加丁酸梭菌1.00×107 CFU/g。在肉鸡21日龄时，测定其生长性能及盲肠食糜中的大肠杆菌、乳酸杆菌和丁酸梭菌总菌数，评估该株丁酸梭菌的抑菌性能、制粒及贮存稳定性。
(1) 与对照组相比，试验组肉鸡的平均日增量和乳酸杆菌数量显著提高 (P<0.05)，但料重比和大肠杆菌数量无显著差异 (P>0.05)。试验组肉鸡盲肠中丁酸梭菌总菌数为2.82×104 CFU/g，偏低。(2) 丁酸梭菌与大肠杆菌K88按1.0∶1.0进行体外抑菌试验，抑菌圈直径 (diameter of inhibition zone，DIZ)为12.14 mm；而按0.1∶1.0试验时，DIZ显著降低至10.42 mm，下降了14.17% (P<0.05)。(3) 与饲粮中添加的丁酸梭菌相比，试验第1天制粒试验组颗粒料中丁酸梭菌总菌数损失44.13%，且贮存第21天后进一步下降了21.36%。
饲粮添加丁酸梭菌对肉鸡生长性能及肠道菌群有显著改善作用，但制粒及其贮存过程中丁酸梭菌总菌数显著下降，影响其对肠道大肠杆菌的调控效果。
Effects of the Stability of Clostridium butyricum Additive on Intestinal Microflora Regulation in Broiler Chickens
To evaluate the effects of the pelleting and storage stability of Clostridium butyricum feed additives on the growth performance and intestinal microflora in broiler chickens.
A total of 200 one-day-old Arbor Acres (AA) broiler chickens were divided into two treatment groups. The control group was fed a basic diet, while the experimental group received the basic diet supplemented with C. butyricum (1.00×107 CFU/g in the complete formula feed). At 21 days of age, growth performance and the total number of Escherichia coli, Lactobacillus, and C. butyricum in cecal chyme were measured; and the antibacterial properties, the pelleting and storage stability of the C. butyricum were also evaluated.
1) Compared with the control group, the average daily gain and the number of Lactobacillus of the experimental group increased significantly (P<0.05), but there was no significant difference in the feed conversion ratio and the number of E. coli (P>0.05). The number of C. butyricum in the experimental group was 2.82×104 CFU/g, which was relatively low. 2) The Oxford Cup test showed a diameter of inhibition zone (DIZ) of 12.14 mm for a 1.0∶1.0 of C. butyricum to E. coli K88, but the DIZ was significantly reduced to 10.42 mm at a 0.1∶1.0 ratio, with a decrease of 14.17% (P<0.05). 3) Compared with the amount of C. butyricum added to the diet, pelleting resulted in a loss of 44.13% of C. butyricum in the experimental pellets on the 1st day, and storage for 21 days further reduced by 21.36%.
Dietary supplementation with C. butyricum additives can improve the growth performance and intestinal microflora of broiler chickens. However, the total number of C. butyricum significantly decrease during the pelleting and storage processes, partially affecting its ability to regulate intestinal E. coli.
-
Keywords:
- Clostridium butyricum /
- storage stability /
- pelleting stability /
- broiler chicken /
- intestinal flora
-
固醇调节元件结合转录因子1 (sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBF1)蛋白是一种DNA结合蛋白，属于碱性螺旋—环—螺旋—亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix-leucine zipper，bHLH-Zip)转录因子超家族，于1993年被BRIGGS等[1]首次报道。SREBFs家族成员包括SREBF1和SREBF2，虽然它们均含有bHLH结构域，但两者具有不同的功能。SREBF1主要调控脂肪酸合成相关基因的表达，SREBF2主要调控胆固醇合成相关基因的表达[2-3]。具体来说，bHLH是SREBFs家族的核心结构域，可特异性结合核内固醇调控元件(sterol regulatory element，SRE)和E-Box元件[2]，在调控细胞分化[4]和细胞内脂肪酸、胆固醇合成[5]中发挥作用。SREBF1靶基因包括脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)、低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDLR)等[6]，FAS和LDLR基因均参与脂质合成。此外，SREBF1还能与过氧化物酶体增殖剂激活受体γ (peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPARγ)等蛋白形成调控网络，调控奶牛乳脂合成相关基因的表达[7]。
牛SREBF1位于19号染色体上，含有19个外显子和18个内含子，其cDNA已被克隆，全长3 441 bp[8]。水牛SREBF1位于3号染色体上，含有20个外显子和19个内含子，其cDNA已被克隆，全长3 438 bp[9]。研究表明：SREBF1在奶牛[10]和山羊[11]的乳腺上皮细胞中调控乳脂合成。此外，SREBF1多态性与牛肌内脂肪含量[12]，与绵羊产奶量、乳脂率和乳蛋白率[13]等经济性状关联。
家养水牛(Bubalus bubalis)可提供肉、奶和畜力，在许多亚热带和热带国家农业经济中发挥关键作用。目前，世界上水牛奶产量已超过动物奶总供应量的5%，被用来制作酸奶、奶酪等高端乳制品[14]。但截至目前，鲜有水牛SREBF1的研究报道。 为此， 本研究以槟榔江水牛为研究对象， 对水牛的SREBF1 编码序列(coding sequence， CDS)进行克隆，结合已发表的同源序列，采用生物信息学方法对水牛SREBF1的结构及理化特征进行探讨和比较分析，探究水牛SREBF1的功能；采用qPCR技术检测SREBF1在泌乳期水牛8个组织中的表达水平，为深入研究SREBF1在水牛乳脂合成中的功能及调控机制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
在云南省腾冲市槟榔江水牛核心养殖区，选取3头成年、健康且均处于泌乳高峰期的槟榔江水牛。所有取样水牛饲养管理条件一致。屠宰后，迅速将采集的心肌、肝脏、脾脏、肾脏、瘤胃、垂体、乳腺和骨骼肌样品放入冻存管，于液氮中贮存，用于总RNA提取。所有样品采集程序均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经云南农业大学动物护理与使用委员会批准(批准号：YNAU2019llwyh019)。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成
根据TRIzol试剂 (Takara，中国大连)说明书提取各组织RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。使用紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)检测RNA浓度和纯度；采用逆转录酶试剂盒(Invitrogen M-MLV，Takara， 中国大连)将RNA逆转录为cDNA， 于−20 ℃保存备用。
1.2.2 水牛SREBF1基因CDS克隆及鉴定
参考NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已公布的水牛SREBF1序列(登录号：XM_006040774)，使用Oligo 6设计2对引物(表1)克隆SREBF1 CDS，分别获得2个PCR产物(片段1和片段2)。PCR反应体系为20.0 µL，包括：10×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+ Plus) 2.0 µL， 2.5 mmol/L dNTPs 3.2 µL， 10 µmol/L上、 下游引物各0.4 µL，5 U/µL LA Taq (Takara， 中国大连) 0.1 µL， 50 ng/µL cDNA模板2.0 µL，ddH2O 11.9 µL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min (35个循环)；72 ℃终延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物经切胶、 回收， 连接克隆载体pMD18-T (Takara，中国大连)，转化、复苏、培养后挑取单菌落摇菌，以菌液为模板进行PCR扩增 (其余步骤与连接克隆载体前的步骤一致)，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，选取目的条带菌样送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。
表 1 引物信息Table 1. Primer information引物名称
primer name序列号
serial number引物序列 (5'→3')
primer sequence扩增长度/bp
amplification
length退火温度/°C
annealing
temperature用途
purposeSREBF1-1 XM_006040774 F：GTCGCTGATTCTGTATGCTTGA
R：TTGCGATGCCTCCAGAAGTG1 757 62.3 cDNA扩增
cDNA amplificationSREBF1-2 XM_006040774 F：GAATGGGCTGCTGGTGCTCTT
R：TGATACGGAGACCGGGCTCTA1 829 62.9 cDNA扩增
cDNA amplificationSREBF1-qPCR KU517671.1 F：GCACCGAGGCCAAGTTGAATAA
R：CAGGTCCTTCAGCGATTTGCTT146 60.0 组织表达
tissue expressionβ-actin NM_001290932 F：TGGGCATGGAATCCTG
R：GGCGCGATGATCTTGAT196 60.0 组织表达内参
internal reference
expressed in tissues通过Lasergene软件包 (DNAstar Inc.，美国)中的SeqMan工具，对水牛SREBF1序列进行核对和组装。 通过ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定开放阅读框(open reading frame，ORF)，并翻译成氨基酸序列。用BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源搜索，以确定基因属性。
1.2.3 分子特征、进化关系和分子功能分析
用于数据分析的各物种SREBF1核苷酸序列、蛋白序列和基因组注释GTF文件均从NCBI数据库下载。使用CodonW软件 (https://codonw.sourceforge.net/)估算水牛SREBF1 CDS密码子的同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)、有效密码子数(effective number of codons，ENc)、GC含量和第3位碱基GC含量(GC content of the third base，GC3s)。通过在线软件Compute pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/)、Protparam tool (https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)、TMHMM server 2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 4.1 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分别预测SREBF1的相对分子质量、等电点、疏水性、跨膜区和信号肽。通过ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml)和WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)在线工具进行亚细胞定位。利用Prosite (https://prosite.expasy.org/)预测SREBF1蛋白质功能位点，使用TBtools软件[15]的Basic Biosequence View工具绘图。SREBF1的二级结构和三维结构通过SOPMA (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)预测。使用Lasergene软件包 (DNAstar Inc.， 美国)的MegAlign软件分析物种氨基酸序列一致性。用MEGA 6.0软件[16]基于JTT+I+F模型最大似然法构建系统发育树；通过NCBI数据库的Batch Web CD-Search程序确定蛋白保守结构域；将系统发育树和蛋白保守结构域分析结果输入到TBtools软件[15]中的Graphics工具，输出可视化结果图。使用在线工具STRING (https://cn.string-db.org/)预测SREBF1蛋白互作网络；通过InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/)和DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)在线工具分析蛋白质分子功能和生物学路径。
1.2.4 组织差异表达分析
使用荧光定量RT-PCR检测泌乳高峰期水牛8个组织中的SREBF1 mRNA表达情况，引物见表1。反应体系为22.0 μL， 包括： SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ(Takara，中国大连) 10.0 μL，10 µmol/L上、下游引物各0.8 μL，55 ng/μL cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.4 μL。运行程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次；添加熔解曲线，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以β-actin基因为内参基因，利用2−ΔΔCt法计算SREBF1 mRNA在各组织中的相对表达量，所有数据均以3个独立的“平均数±标准误”表示。基因相对表达量采用GraphPad Prism 9进行统计分析和可视化。多组间比较采用一般线性模型程序进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Tuket’s检验。
2. 结果与分析
2.1 水牛SREBF1基因的克隆与鉴定
水牛SREBF1 CDS全长3 438 bp (图1)。经NCBI数据库BLAST程序进行同源性搜索，确定本研究水牛SREBF1 CDS序列与瘤牛(登录号：XM_019980920.1)、普通牛(登录号：NM_001113302.1)、野牛(登录号：XM_010842897.1)、山羊(登录号： NM_001285755.1)和绵羊(登录号： XM_027974784.2)的相似性分别为98.17%、98.11%、98.08%、96.77%和96.75%。水牛SREBF1 CDS的A、 G、 T、 C 含量分别为16.84%、 30.72%、 17.51%和34.93%，编码
1145 个氨基酸。![]()
图 1 水牛SREBF1基因RT-PCR产物注：a) 片段1；b) 片段2。M. DL2000 Marker；1和2. 水牛SREBF1基因目的片段。Figure 1. RT-PCR products of buffalo SREBF1 geneNote: a) fragment 1; b) fragment 2. M. DL2000 Marker; 1 and 2. the target fragments of buffalo SREBF1 gene.2.2 水牛SREBF1的分子特征、系统发育关系和分子功能
2.2.1 基因密码子使用偏好性
由表2可知：水牛与其他牛科物种SREBF1 CDS的ENc范围为40.910~44.030，水牛的最小；GC3s范围为0.733~0.761，水牛的最大；GC含量范围为0.657~0.661，水牛和瘤牛的GC含量一致，均为0.657。此外，水牛SREBF1基因RSCU值最大的3个密码子分别为：CUG (3.70)、GUG (2.45)和AGC (2.30)，说明水牛SREBF1基因更偏好使用这3个密码子，它们分别编码亮氨酸、缬氨酸和丝氨酸。值得一提的是，CUG和GUG也是其他牛科物种SREBF1更偏好使用的密码子。
表 2 SREBF1的ENc以及GC3s和GC含量Table 2. ENc, GC3s and GC content of SREBF1物种 species ENc GC3s GC 水牛 Bubalus bubalis 40.910 0.761 0.657 普通牛 Bos taurus 41.280 0.759 0.658 瘤牛 Bos indicus 44.030 0.733 0.657 野牛 Bison bison bison 43.860 0.733 0.659 山羊 Capra hircus 41.680 0.760 0.661 绵羊 Ovis aries 42.880 0.744 0.660 注：ENc. 有效密码子数；GC3s. 第3位碱基GC含量；GC. GC含量。
Note: ENc. effective number of codons; GC3s. GC content of the third base; GC. GC content.2.2.2 基因转录区结构
比较水牛与另外6个牛科物种的SREBF1基因转录区结构(图2)可知：不同牛科物种的SREBF1基因转录变异体数量不同，5'和3'端非翻译区(untranslated region，UTR)长短不一致，内含子和外显子数量不一致，但各牛科物种SREBF1 CDS的长度和结构大致相同。
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图 2 水牛与其他6个牛科物种SREBF1基因转录区的结构Figure 2. Transcribed region structure of SREBF1 gene in buffalo and other six species in Bovidae2.2.3 蛋白基本理化特征
比较水牛(登录号：AOT28348.1)、普通牛(登录号：NP_001106773.1)、瘤牛(登录号：XP_019836479.1)、野牛(登录号：XP_010841199.1)、山羊(登录号： NP_001272684.1)和绵羊(登录号： XP_027830585.1)的SREBF1蛋白基本理化特征(表3)可知：水牛与其他牛科物种的SREBF1基本理化特征相似性较高，均为亲水性蛋白，但水牛SREBF1蛋白的稳定性和极性氨基酸数量略高。
表 3 水牛与其他牛科物种SREBF1的蛋白理化特征Table 3. Physicochemical characteristics for SREBF1 protein in buffalo and other Bovidae species物种
species氨基酸数量
number of amino acids分子质量/ku
molecular weight等电点
isoelectric point强酸性氨基酸数量
number of strongly
acidic amino acids强碱性氨基酸数量
number of strongly
basic amino acids水牛 Bubalus bubalis 1145 120.88 8.79 92 103 普通牛 Bos taurus 1146 120.93 8.72 93 103 瘤牛 Bos indicus 1146 120.94 8.66 93 102 野牛 Bison bison bison 1146 120.85 8.79 92 103 山羊 Capra hircus 1146 120.86 8.66 93 102 绵羊 Ovis aries 1146 120.97 8.75 93 103 物种
species疏水性氨基酸数量
number of hydrophobic
amino acids极性氨基酸数量
number of polar
amino acids不稳定系数
instability index脂肪系数
aliphatic index平均亲水系数
grand average of
hydropathicity水牛 Bubalus bubalis 428 281 55.13 90.69 −0.087 普通牛 Bos taurus 432 278 55.91 91.13 −0.078 瘤牛 Bos indicus 431 278 55.96 90.62 −0.081 野牛 Bison bison bison 431 278 55.26 90.28 −0.086 山羊 Capra hircus 428 275 56.55 89.77 −0.086 绵羊 Ovis aries 427 273 56.27 89.61 −0.095 2.2.4 蛋白质功能修饰位点、信号肽和跨膜结构
水牛SREBF1蛋白质功能修饰位点预测结果(图3a)表明：其含有5种功能修饰位点，包括酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点17个、N端豆蔻酰化位点23个、蛋白激酶C磷酸化位点12个、N端糖基化位点2个和酪氨酸激酶磷酸化位点1个。水牛SREBF1蛋白无信号肽(图3b)和跨膜结构(图3c)。
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图 3 水牛SREBF1的序列特征与结构注：a) 蛋白质功能修饰位点；b) 信号肽；c) 跨膜结构；d) 三维结构；e) 互作蛋白网络。Figure 3. Sequence characteristics and structure of buffalo SREBF1Note: a) protein functional modification site; b) signal peptide; c) transmembrane structure; d) three-dimensional structure; e) interacting protein network.2.2.5 二级结构的构成、三维结构和蛋白质互作
在水牛SREBF1的二级结构中，α螺旋占43.14%，延伸链占2.36%，β转角占1.22%，无规则卷曲占53.28% (表4)。三维结构同源建模显示：构建水牛和其他牛科物种SREBF1蛋白的最佳模型均为猪固醇调节元件结合蛋白1模板(O97676.1.A)(图3d)，序列一致性为88.02%~88.37%，覆盖率均为100.00%。
表 4 水牛和其他牛科物种SREBF1蛋白二级结构Table 4. Secondary structure of SREBF1 protein in buffalo and other Bovidae species% 物种 species α螺旋 alpha helix 延伸链 extended strand β转角 beta turn 无规则卷曲 random coil 水牛 Bubalus bubalis 43.14 2.36 1.22 53.28 普通牛 Bos taurus 40.84 2.53 0.87 55.76 瘤牛 Bos indicus 42.23 1.92 1.05 54.80 野牛 Bison bison bison 40.92 2.09 0.96 56.02 山羊 Capra hircus 40.14 2.79 1.40 55.67 绵羊 Ovis aries 41.62 2.36 1.13 54.89 水牛SREBF1的主要互作蛋白包括PPARGC1B、MED15、SCAP、INSIG1、INSIG2、NPC1、FBXW7、MED15、EP300和LMNA (图3e)。这些蛋白主要涉及转录调控过程，包括识别并与靶蛋白磷酸化位点结合、辅助RNA聚合酶Ⅱ激活多种转录因子和核受体等。此外，还涉及脂质代谢过程、葡萄糖代谢、细胞增殖和分化过程。值得注意的是，与水牛SREBF1互作的蛋白可以在核组装、染色质、核膜和端粒动力学中发挥重要作用。
2.2.6 亚细胞定位、生物学过程及分子功能
水牛SREBF1主要定位于细胞核和内质网，含有1个bHLHzip_SREBP1结构域，具有的分子功能包括转录调节活性(GO：0140110)、蛋白质二聚体活性(GO：0046983)和蛋白组氨酸激酶活性(GO：0004673)。水牛SREBF1既能与RNA聚合酶Ⅱ顺式调控区DNA结合(GO：0000978)，又能与染色质结合(GO：0003682)。此外，该蛋白调控DNA模板的转录(GO：0006355)，还参与脂质代谢(GO：0006629)、胆固醇代谢过程(GO：0008203)、AMP依赖的活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信号通路、胰岛素信号通路。
2.2.7 保守结构域与系统发育树
水牛SREBF1氨基酸序列与普通牛、瘤牛、野牛、山羊、绵羊氨基酸序列一致性达到97.2%以上(表5)。各物种间SREBF1氨基酸序列较保守，水牛与其他牛科物种氨基酸序列一致性较高。
表 5 水牛与其他牛科物种SREBF1序列一致性与分歧度Table 5. Percent identity and divergence of SREBF1 sequence of buffalo and other species in Bovidae% 物种
species水牛
Bubalus bubalis普通牛
Bos taurus瘤牛
Bos indicus野牛
Bison bison bison山羊
Capra hircus绵羊
Ovis aries水牛 Bubalus bubalis *** 99.0 99.0 98.6 97.6 97.6 普通牛 Bos taurus 1.1 *** 99.7 99.4 97.8 97.8 瘤牛 Bos indicus 1.1 0.3 *** 99.5 97.8 97.8 野牛 Bison bison bison 1.4 0.6 0.5 *** 97.5 97.5 山羊 Capra hircus 2.4 2.2 2.2 2.6 *** 99.5 绵羊 Ovis aries 2.4 2.2 2.2 2.6 0.5 *** 注：“***”线上方的数值为序列一致性，“***”线下方的数值为序列分歧度。
Note: The values above the “***” line represent the percent identity of sequence, and the values below the “***” line represent the divergence of sequence.基于各物种SREBF1氨基酸序列构建的系统发育树(图4a)显示：水牛与普通牛、瘤牛、野牛、山羊、 绵羊聚为一大类。 此外， 所有牛科物种都含有相同的bHLHzip_SREBP1保守结构域(图4b)，揭示水牛与其他牛科物种SREBF1功能的相似性。
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图 4 8个物种SREBF1氨基酸序列的系统发育关系(a)和保守结构域(b)Figure 4. Phylogenetic relationships (a) and conserved domains (b) of SREBF1 in eight species2.3 组织差异表达分析
由图5可知：SREBF1基因在泌乳期水牛的8个组织中均有表达，其中，在乳腺、肝脏和骨骼肌组织中的表达较高，尤其在乳腺中的表达水平最高，而在心脏、脾脏、瘤胃组织中的表达水平较低。
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图 5 SREBF1基因在水牛泌乳期8个组织中的表达注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。Figure 5. Expressions of the SREBF1 gene in eight tissues of buffalo during lactationNote: Different letters indicate significant differences (P<0.05).3. 讨论
3.1 SREBF1分子特征
目前，已有牛、羊等家养动物SREBF1的相关报道，而水牛SREBF1鲜有研究。本研究克隆了槟榔江水牛SREBF1 CDS，同源搜索确定为水牛SREBF1序列，CDS全长3 438 bp，编码
1145 个氨基酸。生物信息学分析显示：水牛SREBF1为亲水蛋白，无信号肽和跨膜结构。水牛与其他牛科物种SREBF1的基本理化特征相似性较高。在密码子使用模式上，水牛和其他牛科物种SREBF1 的ENc、GC3s和GC含量相似，且均偏好使用密码子CUG和GUG，表明水牛和其他牛科物种SREBF1在使用同义密码子上具有相似的模式。水牛SREBF1主要定位于细胞核和内质网，这与其作用机制有关。具体来说，SREBF1受胆固醇负调控，其前体无活性且以SREBF-SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)—胰岛素诱导基因1编码蛋白(insulin induced gene 1，INSIG1)复合体的形式存在于内质网膜上，且SCAP具有固醇敏感结构域(sterol sensor domain，SSD)。因此，当细胞内胆固醇水平升高时，SREBF-SCAP-INSIG复合体滞留于内质网；而当细胞内胆固醇水平降低时，该复合体分离出的SREBF-SCAP在高尔基体膜上进一步被蛋白水解酶切割，释放出具有活性的核型SREBF1 (nuclear SREBF1，nSREBF1)[11]。nSREBF1进入细胞核后与靶基因结合，并调控靶基因表达[17]。在细胞核内，与乳脂合成相关的脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶-α (acetyl-CoA carboxylase alpha，ACACA)、Insig1等基因均可被SREBF1调控，调控方式分别为直接调控、间接或远程调控、潜在调控[18]。
3.2 SREBF1的功能与调控机制
保守结构域预测结果显示：槟榔江水牛与其他5个牛属物种SREBF1均含有bHLHzip_SREBP1结构域，该结构域是固醇调节元件结合蛋白家族的特征结构域，表明其在不同物种间具有一定保守性。序列一致性与系统发育分析表明：槟榔江水牛与其他牛科物种SREBF1氨基酸序列一致性较高，达97%以上，这与前人研究结果[19]相似。在构建的系统发育树上，水牛与其他牛科物种的SREBF1聚在一起。此外，蛋白质功能与其二级、三维结构紧密相关[20]。在水牛SREBF1二级结构中，α螺旋和无规则卷曲占比较大，分别为43.14%和53.28%，前者主要对蛋白质骨架起到稳定作用，后者则是决定蛋白质功能的重要区域；β转角和伸展链占比较小，分别为1.22%和2.36%，β转角在蛋白质折叠过程和维持蛋白质三维结构的稳定性方面发挥重要作用。此外，水牛与其他牛科物种SREBF1的二级结构和三维结构相似。结合以上研究，表明水牛与其他牛科物种SREBF1的氨基酸序列具有高度的保守性，推测水牛与其他牛科物种SREBF1的功能相似。
SREBF1在细胞核内调控脂质代谢相关基因的表达[21]。本研究发现：水牛SREBF1参与AMPK信号通路和胰岛素信号通路，并与具有脂肪酸、胆固醇等合成功能的蛋白相互作用。具体来说，AMPK能直接使SREBF1磷酸化，抑制SREBF1酶解和阻止nSREBF1转运，导致SREBF1不能调控脂质代谢相关靶基因的表达[22]。在胰岛素信号通路中，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)磷酸化作用下被激活，且mTOR可促进SREBF1的切割，从而促进脂质代谢相关基因转录[23]。因此，推测水牛SREBF1可通过AMPK和胰岛素信号通路调控乳脂合成。
3.3 SREBF1在乳腺组织中的表达
SREBF1是乳脂合成相关候选基因。有研究显示：SREBF1与脂肪酸代谢、丙酮酸代谢、胆固醇生物合成有关[24]，可协助调控脂质和蛋白质生物合成[25]。在转基因小鼠肝脏中，SREBF1过表达后可导致脂肪肝，同时，脂肪酸合成酶mRNA和脂肪酸合成速率提高了4倍[26]。研究发现：牛SREBF1在乳腺乳脂合成相关基因的调控网络中发挥关键的调节作用[7]。本研究中，SREBF1 mRNA在泌乳期水牛乳腺和肝脏中的表达水平较高，且乳腺和肝脏均是脂质代谢旺盛的器官，推测该基因调控水牛脂质合成相关基因的表达，促进乳腺中乳脂的合成，但需进一步深入研究。
4. 结论
本研究成功克隆了水牛SREBF1 CDS序列，其全长3 438 bp，编码1 145个氨基酸。水牛与其他牛科物种的SREBF1氨基酸序列具有高度的相似性。水牛SREBF1主要在细胞核内发挥作用，参与结合并调控DNA转录等生物学过程。SREBF1在泌乳期水牛脂质代谢旺盛的组织中高水平表达，可能参与了乳脂合成。
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图 1 丁酸梭菌对大肠杆菌K88的抑制作用
注：Ⅰ. 无菌蒸馏水；Ⅱ. 丁酸梭菌。
Figure 1. Antibacterial properties of Clostridium butyricum on Escherichia coli K88
Note: Ⅰ. sterile distilled water; Ⅱ. C. butyricum.
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图 2 试验组颗粒料(a)及丁酸梭菌制品(b)中的丁酸梭菌总菌数
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Figure 2. Total count of C. butyricum in pellet feed of the experimental group (a) and in C.butyricum product (b)
Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).
表 1 试验基础日粮配方及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (dry weight)
原料 ingredients 含量/% content 玉米 corn 54.80 大豆油 soybean oil 3.70 豆粕 soybean meal 32.60 鱼粉 fishmeal 3.00 玉米蛋白粉 corn gluten meal 1.00 石粉 limestone 1.60 磷酸氢钙 dicalcium phosphate 0.83 食盐 salt 0.25 DL-蛋氨酸 DL-methionine 0.22 1复合预混料 premix 2.00 2营养水平 nutrient levels 代谢能/(MJ·kg−1) metabolic energy 12.54 粗蛋白/% crude protein 21.53 钙/% calcium 1.04 总磷/% total phosphorus 0.62 赖氨酸/% lysine 1.16 蛋氨酸/% methionine 0.55 蛋氨酸+胱氨酸/% methionine+cystine 0.92 苏氨酸/% threonine 0.79 注：1. 复合预混料中含有的维生素和矿物质 (每千克全价配合饲料)：维生素A 12 000 IU，维生素D3 3 000 IU，维生素E 25 IU，维生素K 2.60 mg，维生素B1 2.30 mg，维生素B2 5.20 mg，维生素B6 3.80 mg，叶酸 0.60 mg，烟酸 35.00 mg，泛酸 12.00 mg，生物素 0.18 mg，铁 100.00 mg，铜 8.00 mg，锌 80.00 mg，硒 0.30 mg，碘 0.60 mg，锰 100.00 mg；2. 代谢能为计算值，其余指标为实测值。
Note: 1. the premix provided per kilogram of diet (per kilogram of complete compound feed): vitamin A 12 000 IU, vitamin D3 3 000 IU, vitamin E 25 IU, vitamin K 2.60 mg, vitamin B1 2.30 mg, vitamin B2 5.20 mg, vitamin B6 3.80 mg, folic acid 0.60 mg, nicotinic acid 35.00 mg, D-pantothenic acid 12.00 mg, biotin 0.18 mg, iron 100.00 mg, copper 8.00 mg, zinc 80.00 mg, selenium 0.30 mg, iodine 0.60 mg, manganese 100.00 mg; 2. metabolic energy was the calculated value, and the others were the measured values.
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表 2 饲粮添加丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响
Table 2 Effects of dietary supplementation of Clostridium butyricum on the growth performance of broilers
处理
treatments第1天体质量/g
body weight on
the 1st day第21天体质量/g
body weight on
the 21st day平均日增量/g
average daily
gain平均日采食量/g
average daily
feed intake料重比
ratio of feed
to weight死亡率/%
mortality对照组 control group 43.23±1.29 a 792.93±51.3 b 35.70±2.42 b 50.24±2.26 b 1.41±0.07 a 3.00 a 试验组 experimental group 43.20±1.28 a 835.90±67.85 a 37.75±3.22 a 53.83±2.69 a 1.42±0.08 a 0.00 a 注：同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05); the same as below.
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表 3 饲粮添加丁酸梭菌对肉鸡盲肠食糜菌群的影响(以10为底的对数值计)
Table 3 Effects of dietary supplementation of C. butyricum on the cecal chyme microflora of broilers (measured in the values of the logarithm to base 10)
处理
treatments乳酸杆菌
Lactobacillus大肠杆菌
Escherichia coli丁酸梭菌
C. butyricum对照组 control group 7.36±0.06 b 5.75±0.07 a 1.69±0.11 b 试验组 experimental group 7.74±0.06 a 5.69±0.06 a 4.45±0.08 a
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表 4 涂布不同密度大肠杆菌K88后的抑制圈直径
Table 4 Diameter of inhibition zone after coating with different densities of E. coli K88
mm 涂布密度/(CFU·mL−1)
coating densities丁酸梭菌
C. butyricum无菌蒸馏水
sterile distilled water2.5×106 12.14±0.49 a 7.80±0.00 a 2.5×107 10.42±0.72 b 7.80±0.00 a
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