德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞抗炎作用的研究
Study on Anti-inflammatory of Aqueous Extract of De’ang Pickled Tea on Murine RAW264.7 Macrophages
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Keywords:
- De’ang pickled tea /
- macrophages /
- nitric oxide /
- NF-κB /
- anti-inflammatory
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人体的免疫系统调控着机体健康的稳定与平衡，能够帮助机体抵御病原微生物及其他抗原入侵，但过强或异常的免疫反应反而会损伤机体。机体在受到某些胞内寄生病原体、化学物质和组织抗原等刺激后，会激活不同信号通路产生细胞因子和炎性介质，在组织损伤或病原体存在的局部造成炎性渗出，发挥杀菌作用；同时，炎症反应产物又可以活化和聚集更多的巨噬细胞和自然杀伤细胞等到达炎症反应部位，增强其对病原体的吞噬和杀伤作用[1]。但是，当炎症反应的调节发生异常时，会产生过量细胞因子或促炎性介质，从而对机体造成一定程度的损伤[2]。
茶叶是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia Linn.)植物的嫩叶，根据其发酵程度不同可分为不发酵茶、半发酵茶和全发酵茶[3]。酸茶是一种厌氧发酵茶，味道清新、口味回甘且具有独特的酸香味，故而得名酸茶[4-5]，主要产于中国云南、泰国北部、缅甸、老挝以及日本德岛县[5-8]。近年来研究发现：酸茶富含茶多酚、糖类、蛋白质、黄酮类、咖啡碱和氨基酸等多种活性物质[9-11]，并具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗肿瘤和肝保护等多种生物学功效[12-13]。乳酸菌作为酸茶发酵过程中的优势菌，对茶多酚类活性成分的含量、组成及活性变化有重要影响，且研究发现酸茶乳酸菌具有良好的益生功能[14-15]。德昂酸茶是云南德昂族一种具有民族特色的发酵茶制品，采摘新鲜茶叶，经过冲洗、晾晒、蒸茶和揉茶后装入龙竹筒，压实，用芭蕉叶封口，埋在干燥阴凉的地下进行厌氧发酵。在德昂族的日常生活中，酸茶通常作为小吃食用或直接泡水饮用。在德昂族民间传说中，常饮酸茶可美容增寿、清热解暑、消炎解酒、爽神润喉和增进消化[16]。研究发现：泰国酸茶Miang提取物对脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和干扰素-γ (interferon-γ，IFN-γ)诱导RAW264.7细胞产生的炎症调节因子NO具有抑制作用[17]，表明酸茶具有抗炎作用。然而，国内外对德昂酸茶的研究主要以文化研究为主，其抗炎功效鲜见报道。
本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象、LPS和IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞为炎症模型、NF-κB关键炎症信号通路为靶点，研究德昂酸茶水提物对小鼠巨噬细胞NF-κB信号通路活化和炎症因子表达的影响，旨在揭示德昂酸茶对小鼠RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路活化的抗炎机制。研究结果可为阐明德昂酸茶的免疫调节功效机制奠定理论基础，对促进酸茶产业发展具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 供试材料及试剂
德昂酸茶(新鲜茶叶采摘后厌氧发酵3个月)，采自云南省德宏州芒市三台山德昂族乡；小鼠RAW264.7巨噬细胞系(KCB 200603YJ)由中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库提供。
高糖 DMEM 培养基、0.25%胰酶[ 含0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)]、dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自ABI公司；LPS (Escherichia coli 055:B5)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和链霉素购自Sigma-Aldrich 公司；小鼠IFN-γ、兔抗IKKα抗体和兔抗IκBα抗体购自Abcam 公司；兔抗β-actin抗体和HRP-山羊抗兔IgG (H+L)二抗购自Proteintech 公司；兔抗Phospho-IKKα/β抗体和兔抗Phospho-IκBα抗体购自CST 公司；总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒和Pro-light HRP化学发光检测试剂购自天根生化科技有限公司；Griess试剂盒购自Promega公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；噻唑兰[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]、高效 RIPA 组织/细胞裂解液和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS) 购自Amresco公司；5×蛋白上样缓冲液购自Biosharp 公司；蛋白预染 Marker购自Fermentas 公司；核酸染料Gelview购自百泰克生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ELX-808多功能酶标仪，美国伯腾公司；Sorvall ST 16R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；NP80Touch超微量分光光度计，德国IMPLEN公司；Bio-RADiCycler 实时荧光定量PCR 仪、Trans-Blot Turbo蛋白转膜仪和Bio-Rad电泳仪，美国Bio-Rad公司；SCIENTZ-18N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHELLAB2406-2型二氧化碳培养箱，美国SHELLAB公司。
1.3 试验方法
1.3.1 德昂酸茶水提物制备及儿茶素含量测定
取德昂酸茶5 g，加入超纯水300 mL煮沸5 min，然后用滤纸过滤，重复3次，混合3次滤液，−20 ℃冻结，−80 ℃真空冷冻干燥，得到德昂酸茶水提物冻干粉，并将其样品送至中国科学院昆明植物研究所检测儿茶素含量。HPLC检测条件为：色谱柱ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长280 nm，进样量5 μL；流动相A：2%甲酸—水溶液，流动相B：乙腈；梯度程序：0~5 min，92% A；5~23 min，92%~75% A；23~25 min，75%~92% A。酸茶提取物中表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的含量分别为57.63、6.28、56.61、33.81和13.86 mg/g。德昂酸茶提取物冻干粉用超纯水配制成质量浓度为31.3、62.5、125.0、250.0、500.0和1 000.0 μg/mL的酸茶水提物溶液，用0.22 μm无菌过滤膜过滤，−20 ℃避光保存待用。
1.3.2 小鼠RAW264.7巨噬细胞培养和分组
将小鼠RAW264.7 巨噬细胞培养于DMEM完全培养基(含体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)中，置于37 ℃、5% CO2 的恒温培养箱中培养。当培养皿中细胞覆盖率至80%时，用 0.25%胰酶消化细胞获得细胞悬液，将细胞悬液接种到细胞培养板中，细胞贴壁后弃去培养基，用DPBS清洗后进行分组处理。以只加DMEM完全培养基为对照组，只加德昂酸茶水提物为酸茶水提物处理组，只加含100 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的DMEM 完全培养基为炎症组，炎症组中加入德昂酸茶水提物为处理组。每组设3个重复孔，分组后细胞在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。
1.3.3 细胞活力检测
将细胞(1×105/孔)接种到96孔细胞培养板中，每孔分别加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基200 μL，以只加DMEM完全培养基为对照组；培养24 h后每孔加入MTT溶液20 μL并继续培养4 h，吸弃上清液，再加入DMSO 150 μL，于摇床上低速振荡 10 min，使蓝紫色结晶物充分溶解；在酶标仪OD490 nm处测定各孔的吸光度，计算细胞活力。
1.3.4 NO含量的测定
将细胞(1×105/孔)接种到96 孔细胞培养板中，处理组每孔加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基200 μL，培养24 h，采用Griess试剂盒检测细胞培养上清液中NO2−的含量，拟合NO反应标准曲线，计算NO含量。
1.3.5 实时荧光定量检测炎症基因及NF-κB信号通路基因的mRNA表达水平
将细胞(1×106/孔)接种到6孔细胞培养板中，用于检测炎症基因mRNA表达水平的处理组每孔加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基2 mL，培养6 h；用于检测NF-κB信号通路基因mRNA表达水平的处理组每孔加入1 000 μg/mL德昂酸茶水提物2 mL，培养6 h。
将上述培养的细胞弃去培养基后用DPBS 洗2遍，收集细胞，利用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并测定RNA纯度及含量，根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。荧光定量反应体系包括2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μL，10 μmol/L正向和反向引物各0.6 μL，cDNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.8 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃变性30 s，40个循环。引物序列见表1。
表 1 RT-PCR引物序列Table 1. RT-PCR sequence of primers基因
genes引物序列
sequence of primersGAPDH F：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′ R：5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′ COX2 F：5′-TCCCTGAAGCCGTACACATCA-3′ R：5′-TCCCTGAAGCCGTACACATCA-3′ INOS F：5′-GGAATGGAGACTGTCCCAGCA-3′ R：5′-GTCATGAGCAAAGGCGCAGA-3′ IL1B F：5′-TGAAGTTGACGGACCCCAAA-3′ R：5′CAGCCACAATGAGTGATACTGCC-3′ IL6 F：5′-TCAATTCCAGAAACCGCTATGAA-3′ R：5′-GGAAGGCCGTGGTTGTCAC-3′ RELB F：5′-GCGTACACATTCTGGGGAGT-3′ R：5′-ACCGAAGCAGGAGCTATCAA-3′ NFKB2 F：5′-TGGCATCCCCGAATATGATGA-3′ R：5′-TGACAGTAGGATAGGTCTTCCG-3′ NFKBIA F：5′-ACAGAGGCCATTGAAGTGA-3′ R：5′-CGTGGAGGAAGACGAGAG-3′ IKBKE F：5′-GCGGAGGCTGAATCACCAG-3′ R：5′-GAAAGCCCGAACGTGTTCTCA-3′ TNFAIP F：5′-GGCTCAGTTGCCATAGAGACTC-3′ R：5′-CCCACAGCCTACCAAACATC-3′ 1.3.6 蛋白质免疫印迹(Western-blotting)分析
将细胞(1×106/孔)接种到6孔细胞培养板中，加入DMEM完全培养基2 mL培养48 h后，分为对照组、炎症组、处理组和酸茶水提物处理组。处理组为向炎症组中每孔加入含1 000 μg/mL德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基2 mL；酸茶水提物处理组则加入含1 000 μg/mL 德昂酸茶水提物的DMEM完全培养基2 mL，培养15 min。
将培养好的细胞弃去培养基，用DPBS清洗1次，加入细胞裂解液裂解后，4 ℃、10 360 r/min离心5 min，收集上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。使用SDS-PAGE分离蛋白质样品后，转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，用5%脱脂奶封闭1 h，用TTBS洗膜3次，放入加有一抗(兔抗β-actin抗体、兔抗IKKα抗体、兔抗IκBα抗体、兔抗Phospho-IKKα/β抗体和兔抗Phospho-IκBα抗体)的平皿中侧摆摇床4 ℃低速孵育8~12 h；TTBS洗膜3次，然后将漂洗过的PVDF膜放入加有二抗[HRP-山羊抗兔IgG (H+L)]的平皿中，避光室温孵育1 h，TTBS洗膜3次后使用Pro-light HRP化学发光检测试剂进行显色。
1.4 统计学分析
Western-blotting数据采用Image J软件处理，测量条带光密度值，试验数据采用目的蛋白条带光密度值与内参条带光密度值的比值表示。数据采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用Duncan’s分析，基因表达量差异数据采用Student t-test分析。结果用“平均值±标准差”表示，显著水平设置为P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞活力的影响
由图1可知：与对照组相比，各质量浓度的德昂酸茶水提物处理组细胞活力无显著差异(P>0.05)，表明德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞没有细胞毒性作用。
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图 1 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响注：CK. 对照组，DPE. 德昂酸茶水提取物；下同。Figure 1. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the cell viability of murine RAW264.7 macrophagesNote: CK. control group, DPE. aqueous extract of De’ang pickled tea; the same as below.2.2 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞NO产生的影响
由图2可知：与对照组相比，炎症组(L/I)的NO质量浓度显著升高(P<0.05)，31.3、62.5、125.0、250.0、500.0和1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物对NO的抑制率分别为 5.13%、12.13%、25.20%、50.32%、68.94% (P<0.05)和67.80% (P<0.05)，表明德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞NO的产生，且呈剂量依赖性。
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图 2 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞NO 产生的影响注：与炎症组(L/I)比较，“*”表示差异显著 (P<0.05)；下同。Figure 2. Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the NO production by murine RAW264.7 macrophagesNote: Compared with inflammatory treatment group (L/I), “*” indicates significant differences (P<0.05); the same as below.2.3 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症基因mRNA表达水平的影响
由图3可知：与对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7 巨噬细胞INOS、COX2、IL1β和IL6的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)；与L/I组相比，125.0~1 000.0 µg/mL德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞中INOS的mRNA表达量(P<0.05)；1 000.0 µg/mL酸茶水提取物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导的 COX2 和IL1β 的 mRNA 表达量 (P<0.05) ； 500.0~1 000.0 µg/mL酸茶水提取物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导的IL6的mRNA表达量。表明德昂酸茶水提物可抑制LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症因子mRNA表达，并选择1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物开展后续试验。
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图 3 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症基因mRNA表达水平的影响Figure 3. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the mRNA expression level of inflammatory gene in RAW264.7 macrophages of murine2.4 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路基因mRNA表达水平的影响
由图4可知：与对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7 巨噬细胞RELB、NFKB2、NFKBIA、IKBKE和TNFAIP3的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)；与L/I组相比，1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物处理后，LPS/IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路负调控因子NFKBIA和TNFAIP3的mRNA 表达量均显著上升(P<0.05)。表明德昂酸茶水提物可通过上调负调控因子基因的表达抑制LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞NF-κB信号通路活化。
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图 4 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路基因表达的影响Figure 4. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the gene expression of NF-κB signaling pathway in murine RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ2.5 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响
由图5可知：与空白对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7巨噬细胞中pIKKα/IKKα和pIκBα/IκBα蛋白比值显著增加(P<0.05)，而酸茶水提物处理组无显著变化(P>0.05)；与L/I组相比，LPS/IFN-γ+酸茶水提物组的pIKKα/IKKα和pIκBα/IκBα蛋白比值显著降低(P<0.05)。表明德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路上游激酶IKKα蛋白的磷酸化和抑制蛋白IκBα的磷酸化。
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图 5 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠 RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响Figure 5. Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the phosphorylation of key upstream kinases in RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ3. 讨论
巨噬细胞属于一种免疫效应细胞，常处于静止状态，当受到LPS等免疫刺激物刺激后被激活，参与免疫应答[18]。核转录因子NF-κB对来自免疫受体的信号作出反应，并导致快速但短暂的NF-κB活化，NF-κB可高效诱导多种细胞因子(如INOS、COX2、IL1β和IL6等)基因的表达。INOS在机体中可诱导产生炎症调节因子NO，但其过度表达或失调会导致NO含量过高，引起毒性效应，并与感染性休克、心功能不全、疼痛、糖尿病和癌症等疾病相关[19]。因此，调节INOS的表达和NO的合成被认为是治疗炎症疾病的重要途径[20]。COX2是产生前列腺素的关键酶[21]，在组织损伤和炎症等情况下表达增强，促进前列腺素的产生，前列腺素通过激活酪氨酸激酶受体促进肿瘤增殖、血管生成和最终转移[22]。在炎症反应中，促炎因子IL1β和IL6表达增强，可以增加诱发类风湿性关节炎、哮喘和炎症性肠病的风险[23]。本研究显示：31.3~1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物可显著降低LPS/IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞产生NO；1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症因子INOS、COX2、IL1β和IL6基因表达，并增加NF-κB信号通路负调节因子NFKBIA和TNFAIP3的基因表达。表明德昂酸茶水提物可以通过调控炎症基因和NF-κB信号通路关键基因的表达发挥抗炎作用。
为了进一步研究德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用机制，对NF-κB信号通路关键上游激酶蛋白和抑制蛋白的表达进行了检测。经典NF-κB细胞内信号传导途径的第1步是激活TGFβ1，然后又激活三聚体IκB激酶(IκB kinase，IKK)复合物，IKK复合体会磷酸化IκBα或其他IκB家族成员，磷酸化的IκB家族成员发生泛素化和蛋白酶体降解，导致NF-κB家族成员的释放和核易位，引发炎症反应[24-26]。本研究显示：1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物可降低LPS/IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞 pIκBα/IκBα蛋白和pIKKα/IKKα蛋白比值，表明德昂酸茶水提物可以通过抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞IκBα和IKKα的磷酸化阻断NF-κB信号通路活化。
对德昂酸茶儿茶素含量的测定中发现德昂酸茶儿茶素含量显著高于普洱茶中儿茶素含量[11]，儿茶素可能是德昂酸茶发挥抗炎作用的重要成分。LYU等[27]研究发现：表没食子儿茶素对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞产生的NO有抑制作用，且效果优于表没食子儿茶素没食子酸酯，而表儿茶素可降低LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB表达，且呈剂量依赖性[28]。
4. 结论
德昂酸茶水提物能够调控LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞的NF-κB信号通路，通过抑制IκBα磷酸化降解和IKKα活化以及增加NF-κB信号通路负调控因子基因表达，降低炎症因子的基因表达水平，进一步抑制NO产生，减轻炎症反应。本研究可为功能性德昂酸茶产品的进一步开发利用提供理论依据。
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图 1 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响
注：CK. 对照组，DPE. 德昂酸茶水提取物；下同。
Figure 1. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the cell viability of murine RAW264.7 macrophages
Note: CK. control group, DPE. aqueous extract of De’ang pickled tea; the same as below.
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图 2 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞NO 产生的影响
注：与炎症组(L/I)比较，“*”表示差异显著 (P<0.05)；下同。
Figure 2. Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the NO production by murine RAW264.7 macrophages
Note: Compared with inflammatory treatment group (L/I), “*” indicates significant differences (P<0.05); the same as below.
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图 3 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症基因mRNA表达水平的影响
Figure 3. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the mRNA expression level of inflammatory gene in RAW264.7 macrophages of murine
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图 4 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路基因表达的影响
Figure 4. Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the gene expression of NF-κB signaling pathway in murine RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ
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图 5 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ诱导小鼠 RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响
Figure 5. Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the phosphorylation of key upstream kinases in RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ
表 1 RT-PCR引物序列
Table 1 RT-PCR sequence of primers
基因
genes引物序列
sequence of primersGAPDH F：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′ R：5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′ COX2 F：5′-TCCCTGAAGCCGTACACATCA-3′ R：5′-TCCCTGAAGCCGTACACATCA-3′ INOS F：5′-GGAATGGAGACTGTCCCAGCA-3′ R：5′-GTCATGAGCAAAGGCGCAGA-3′ IL1B F：5′-TGAAGTTGACGGACCCCAAA-3′ R：5′CAGCCACAATGAGTGATACTGCC-3′ IL6 F：5′-TCAATTCCAGAAACCGCTATGAA-3′ R：5′-GGAAGGCCGTGGTTGTCAC-3′ RELB F：5′-GCGTACACATTCTGGGGAGT-3′ R：5′-ACCGAAGCAGGAGCTATCAA-3′ NFKB2 F：5′-TGGCATCCCCGAATATGATGA-3′ R：5′-TGACAGTAGGATAGGTCTTCCG-3′ NFKBIA F：5′-ACAGAGGCCATTGAAGTGA-3′ R：5′-CGTGGAGGAAGACGAGAG-3′ IKBKE F：5′-GCGGAGGCTGAATCACCAG-3′ R：5′-GAAAGCCCGAACGTGTTCTCA-3′ TNFAIP F：5′-GGCTCAGTTGCCATAGAGACTC-3′ R：5′-CCCACAGCCTACCAAACATC-3′ 
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