隐孢子虫 (Cryptosporidium spp.) 是重要的人兽共患原虫之一，其宿主范围广泛，可感染包括人在内的260种脊椎动物^[1]。人类感染隐孢子虫后，主要症状为腹泻，目前已经被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为人类最常见的6种腹泻病之一^[2]，同时也是继轮状病毒后引起儿童严重腹泻的第二大病原体^[3]。隐孢子虫属已报道有40多个种和70多种基因型^[4-5]，其中人可感染的隐孢子虫虫种有微小隐孢子虫 (C. parvum)、人隐孢子虫 (C. hominis)、鼠隐孢子虫 (C. muris)、安氏隐孢子虫 (C. andersoni)、猫隐孢子虫 (C. felis)、犬隐孢子虫 (C. canis)、火鸡隐孢子虫 (C. meleagridis) 和猪隐孢子虫 (C. suis) 等^[6]，且多为在野生动物上鉴定出的人兽共患隐孢子虫^[7]。隐孢子虫主要通过受污染的水源和食物等途径传播^[8]，已在全球范围内引发多起食源性和水源性隐孢子虫病的暴发^[9-11]。

在国内，王利勤等^[12]对成都动物园圈养野生动物隐孢子虫感染情况进行调查，发现隐孢子虫总感染率为4.19%；宋源等^[7]对贵阳动物园圈养野生动物隐孢子虫的感染流行情况进行调查，结果从该园野生动物体内鉴定出安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、人隐孢子虫和鼠隐孢子虫等4种隐孢子虫，均为人兽共患隐孢子虫虫种，该园隐孢子虫总体感染率达15.50%。可见，对动物园野生动物进行隐孢子虫检测具有重要的公共卫生意义。前期国内对于野生动物寄生虫的研究多基于传统的形态学方法，通过显微镜观察形态对分离到的虫株进行鉴定，随着野生动物对寄生虫的感染和传播问题的加重，中国开始注重对动物园野生动物肠道原虫进行检测，但目前仍缺乏有关袋鼠源隐孢子虫所属的基因型背景资料。本研究通过巢氏PCR技术扩增对云南某动物园袋鼠源隐孢子虫分离株的18S rRNA基因序列进行分析，通过构建系统进化树对该隐孢子虫分离株的种类进行鉴定，以期为深入研究袋鼠源隐孢子虫提供参考。

1.   材料与方法

1.1   虫株

对云南某动物园进行寄生虫感染调查时，从袋鼠粪样中获得虫株样品，将其保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2   粪样处理

取适量样品于烧杯中，加入清水搅拌均匀，用60目铜筛过滤于50 mL离心管中；用高速台式离心机 (Model CF-10，Wise Spin公司生产) 以3000 r/min离心3 min，弃去上清液，保留沉淀并将其振荡混匀；吸取沉淀250 μL于2 mL离心管中，按照OMEGA粪样DNA提取试剂盒 (EZNAR stool DNA Kit试剂盒，USA生产) 说明书进行DNA提取，将获得的DNA置于4 ℃保存，备用。

1.3   PCR扩增

基于小核糖体核苷酸 (18S rRNA) 基因进行巢式PCR扩增，引物序列按照XIAO等^[13]设计的引物合成。第1轮引物：上游5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′，下游5′-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3′，扩增产物片段为1325 bp；第2轮引物：上游5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′，下游5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，扩增产物片段约为830 bp。反应体系包括：dNTP 2.00 μL，MgCl₂ 2.00 μL，10×PCR Buffer (Mg²⁺ free) 2.50 μL，r-Taq DNA聚合酶0.25 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA模板2.00 μL，最后添加灭菌双蒸水至25.00 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；第2轮反应退火温度为58 ℃。

1.4   PCR产物鉴定和测序

将第2轮PCR产物置于1%琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定，电泳完成后取凝胶放置在紫外凝胶成像分析仪 (WGD-30，BAYGENE公司生产) 中观察，若结果出现目的片段大小则将该PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行双向测序。

1.5   系统发育分析

将本研究获得的基因序列在GenBank上进行BLAST搜索，下载不同种隐孢子虫分离株的基因序列，使用DNAMAN和MEGA 7.0等软件将本研究获得的序列与其他种隐孢子虫进行同源性比较和系统进化树分析；用MEGA 7.0软件、以邻接法 (neighbor-joining，NJ) 中的Kimura-2-parameter模型自展值检验 (Bootstrap test) 估计所构建基因树的可靠性，并用1000个重复。本研究中，节点支持值低于50%的进行隐藏，支持值大于95%的则认为Bootstrap分析显著。

2.   结果与分析

2.1   PCR产物测序结果

隐孢子虫18S rRNA基因引物成功扩增出袋鼠源隐孢子虫阳性目的条带，长约823 bp，与预期大小一致(图1)。

图  1  袋鼠源隐孢子虫18S rRNA基因PCR扩增产物的检测

注：M. DL2000 Marker；N. 阴性对照； P. 阳性对照；1. 样品。

Figure  1.  Detection of Cryptosporidium 18S rRNA PCR amplification products

Note: M. DL2000 Marker; N. negative control; P. positive control; 1. sample.

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2.2   袋鼠源隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列的同源性分析

由图2可知：在18S rRNA基因位点，袋鼠源隐孢子分离株KMK1与已报道的中国猴源鼠隐孢子虫 (登录号：GU319782)、华盛顿骆驼源鼠隐孢子虫 (登录号：AF093497) 和日本褐家鼠鼠隐孢子虫 (登录号：AB089284) 无碱基差异，序列相似度为100%，且该袋鼠源隐孢子虫与鼠隐孢子虫的序列同源性最高。

图  2  基于18S rRNA基因的袋鼠源隐孢子虫分离株（KMK1）与其他源隐孢子虫同源性比较

Figure  2.  Homology comparison of Cryptosporidium kangaroo isolate (KMK1) based on 18S rRNA gene with other Cryptosporidium sources

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2.3   基于18S rRNA基因序列的种系发育分析

由图3可知：种系发育树形成2个主要大分支，上半部分支为肠道寄生的隐孢子虫，包括维瑞隐孢子虫、人隐孢子虫、微小隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、猪隐孢子虫、犬隐孢子虫、猫隐孢子虫、牛隐孢子虫、芮氏隐孢子虫和鹿隐孢子虫基因型 ；另一分支则是胃寄生隐孢子虫，包括龟隐孢子虫、蛇隐孢子虫、安氏隐孢子虫、鼠隐孢子虫和本研究分离得到的袋鼠源隐孢子虫分离株KMK1。KMK1与鼠隐孢子虫处于同一进化分支，亲缘关系最近，节点支持值显著 (96%)，属于胃寄生隐孢子虫中的鼠隐孢子虫。

图  3  基于邻接法构建的隐孢子虫18S rRNA基因核苷酸序列种系发育进化树

Figure  3.  Evolutionary relationships among Cryptosporidium inferred by neighbor-joining analysis of 18S rRNA nucleotide sequences

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3.   讨论

隐孢子虫主要寄生于人或其他动物胃肠道和呼吸道上皮细胞中，感染后能引起人兽共患隐孢子虫病。1907年TYZZER^[14]首次从试验小鼠体内分离发现该虫，至今包括禽类、哺乳类、爬行类和两栖类等几乎所有脊椎动物体内均发现有隐孢子虫感染。目前，隐孢子虫属已报道40多个种和70多种基因型^[4-5]，且已经在人类中检测到至少20个种和5种基因型^[15-16]。隐孢子虫种类繁多，卵囊较小，不同虫种之间形态相似，传统的显微镜观察法难以通过形态进行准确鉴定。随着分子生物学技术的发展，越来越多的学者开始使用分子生物学方法鉴定隐孢子虫虫种。目前用于隐孢子虫分类的基因主要有核糖体小亚基RNA (18S rRNA)、卵囊壁蛋白 (COWP)、70 ku热休克蛋白 (HSP70) 和肌动蛋白 (Actin) 等基因位点^[17]。其中，18S rRNA基因位点具有多拷贝特性，存在可用于构建系统进化树的保守区和区别物种的多态性区域，能够设计特异性引物，已被广泛应用于人、其他动物和水源性隐孢子虫的虫种鉴定和基因分型研究^[18]。本研究依据XIAO等^[13]报道的隐孢子虫18S rRNA基因引物对袋鼠源隐孢子虫阳性样品DNA进行扩增，获得了长约823 bp的目的片段，测序获得的袋鼠源隐孢子虫基因序列经BLAST在线比对后发现其与鼠隐孢子虫 (C. muris，GU319782、AF093497和AB089284) 无差异碱基，同源性高达到100%。同时，从种系发育进化树中也可以看出，本研究的分离株和鼠隐孢子虫亲缘关系最近，处于同一进化分支。综上所述，该袋鼠源隐孢子虫分离株鉴定为鼠隐孢子虫(C. muris)。

研究表明：野生动物在将疾病向人类传播的过程中扮演了重要角色^[19-20]，而动物园中的野生动物因其与人类接触更频繁，所以将传染病如寄生虫等传播给人类的可能性更大^[21]，因此，研究野生动物和动物园圈养动物体内的人兽共患寄生虫具有重要的公共卫生意义。目前，隐孢子虫在野生动物中的发现和报道越来越多，已成为常见寄生虫种之一。据MICHELLE^[22]统计：袋鼠可以感染多种隐孢子虫，隐孢子虫卵囊已经在16种有袋动物体内被发现，主要检测出费氏隐孢子虫 (C. fayeri)、袋鼠隐孢子虫 (C. macropodum)、鼠隐孢子虫 (C. muris)以及负鼠隐孢子虫基因型(Opossum genotypes I、Opossum genotypes II、Brushtail possum genotypes I和Brushtail possum genotypes II)，其中费氏隐孢子虫和鼠隐孢子虫具有人兽共患性，可广泛存在于家养动物和野生动物中^[19]。鼠隐孢子虫可感染人、鼠、岩狸、双峰驼、野生白山羊、犬、猫、狗、猴和猪等多种哺乳动物。在中国，已有很多对动物园野生动物寄生虫的调查，但多基于常规的显微镜检测，且对于袋鼠相关疾病的研究较少，尚未有袋鼠感染鼠隐孢子虫的报道。本研究通过PCR方法检测发现：云南某动物园中一袋鼠源隐孢子虫虫种为鼠隐孢子虫，不仅提示了袋鼠具有传播人兽共患隐孢子虫的潜在风险，也丰富了中国袋鼠可感染隐孢子虫种类，为中国袋鼠源隐孢子虫流行病学研究提供了基础资料。在今后的研究中可进一步扩大检测样本的数量和地区，以进一步确定袋鼠源隐孢子虫的感染情况、种系发育和人兽共患风险。

4.   结论

本研究从云南某动物园袋鼠中分离到的1株隐孢子虫分离株KMK1与先前报道的鼠隐孢子虫 (C. muris) 同源性达 100%，且在种系发育进化树中也与鼠隐孢子虫处于同一小分支，Bootstrap分析显著，表明该袋鼠源隐孢子虫分离株为鼠隐孢子虫。鼠隐孢子虫属于人兽共患寄生虫，说明云南地区袋鼠具有潜在传播人兽共患隐孢子虫的风险。