紫苏萜类生物合成乙酰辅酶A酰基转移酶基因的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of Acetyl-CoA C-acetyltransferase Gene in Perilla frutescens (L.) Britt.
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Keywords:
- Perilla frutescens L. /
- PfAACT /
- clone /
- terpenoids /
- bioinformatics
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紫苏属(Perilla)植物系唇形科(Lamiaceae)野芝麻亚科(Lamioideae)塔花族(Sature)紫苏亚族(Perillinae)单种属一年生草本植物，原产于东亚地区，在中国、日本和韩国广泛种植[1]。紫苏[Perilla frutescens (L.) Britt.]是中国重要的大宗药材，具有丰富的药用价值和食用价值[2]。据《中国药典》记载：紫苏叶功能主治解表散寒、行气和胃，用于风寒感冒、咳嗽呕恶、妊娠呕吐、鱼蟹中毒；紫苏种子俗称“紫苏子”，具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便的功效，用于痰壅气逆、咳嗽气喘、肠燥便秘。中国是紫苏属植物的起源地之一，有丰富的种质资源和悠久的栽培历史，被认为是紫苏属植物多样性变化的中心[3]。目前，中国紫苏栽培的主要区域是河北、四川、陕西、宁夏、甘肃、黑龙江、辽宁、安徽和湖北等省区，其余省区也有零星种植[4]。紫苏叶中含有丰富的生物活性成分，如挥发油、黄酮、酚酸和色素类等物质，其中紫苏挥发油是紫苏主要的次生代谢产物，由相对较小的简单化合物组成，主要为萜类化合物，绝大多数为单萜物质[5-6]。植物萜类化合物通过2个途径独立合成，即位于细胞质中的甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，MVA)[7]和位于质体中的脱氧木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP)[8]或甲基赤藓醇4-磷酸途径(methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP)。其中，乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyl transferase，AACT)是MVA途径中的第1个关键酶，催化2分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，介导乙酰CoA和乙酰乙酰CoA之间的转变，参与植物萜类和脂质等物质的代谢过程[9]。
现有文献报道AACT基因已从丹参[10]、雷公藤[11]、鱼腥草[12]、白木香[13]和檀香[14]等药用植物中被克隆。SOTO等[15]在苜蓿中过量表达AACT基因，可以增加类异戊二烯化合物的含量，同时也提高了苜蓿的耐盐性；FANG等[16]在灵芝中克隆出AACT基因，在灵芝发育过程中AACT基因的表达与三萜含量呈正相关，当其在农杆菌中过表达时能增加三萜的含量，表明该基因在萜类物质的生物合成中发挥着重要作用。萜类物质是紫苏重要的次生代谢产物，因其结构与功能多样性，具有抗氧化、抗病毒和抗癌等功效。随着高通量测序技术的发展，调控萜类生物合成途径中的关键基因逐渐被发现，研究其作用机制对挖掘萜类物质的生物合成具有重要意义。课题组前期对紫苏品种冀紫1号和冀紫2号进行了转录组学和代谢组学研究工作[17]，结果显示：2个品种间的萜类物质含量不同，并获得了差异表达的AACT基因，表明该基因是紫苏萜类生物合成关键基因。为了研究AACT基因在紫苏萜类合成中的作用，本研究利用基因克隆技术对其进行克隆，并开展生物信息学及特异性表达分析，为下一步构建植物表达载体和验证基因功能奠定基础。通过对紫苏AACT基因的研究，可为紫苏萜类物质的生物合成代谢途径研究提供参考，对紫苏分子辅助育种和品质提升具有重要现实意义。
1. 材料与方法
1.1 材料
紫苏种子播种在营养钵中，当紫苏长出4片真叶时，将紫苏幼苗根、茎、叶样品洗净，并用液氮速冻，用于提取紫苏核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)。
1.2 方法
1.2.1 紫苏RNA的提取及cDNA的合成
使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒[ 目录号：DP432，天根生化科技(北京)有限公司(以下简称“北京天根”) ]提取紫苏总RNA；利用QuantScript RT Kit Quant cDNA第1链合成试剂盒(目录号：KR103，北京天根)合成紫苏的第1链cDNA。
1.2.2 紫苏引物合成
通过紫苏转录组数据，挖掘紫苏AACT的参考基因序列(c107674.graph_c0)，利用Primerer 5.0软件设计该基因的引物：PfAACT-F：5′-ATGGCTTCTGTTGCTGATGA-3′， PfAACT-R：5′-TCACAGCAGAGAGCGTGC-3′。由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部进行引物的合成。
1.2.3 紫苏PfAACT基因克隆
以紫苏cDNA为模板，利用TaKaRa公司高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增PfAACT基因。扩增体系总体积为50 µL，包括： 5×PrimeSTAR Buffer 10.0 µL，dNTP Mixture 4.0 µL，上、下游引物各1.0 µL，模板cDNA 1.0 µL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5 µL，ddH2O 32.5 µL。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增程序为：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶检测：在含有适量核酸染料的琼脂糖凝胶上，以180 V/cm的电压在1×TAE电极缓冲液中电泳，待电泳指示剂溴酚蓝至凝胶的2/3处，取出凝胶置于紫外成像仪中检测。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号：DP209，北京天根)进行PCR产物的回收。PCR回收产物与pMD19-T载体连接转化大肠杆菌感受态DH5α，并挑取阳性单克隆菌液送到生工进行序列测序。
1.2.4 紫苏PfAACT生物信息学分析
利用MEGA 4和DNAMAN软件构建紫苏PfAACT进化树，并进行亲缘关系分析；使用在线软件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam)分析蛋白质的理化性质；使用ExPasy-ProtSCale (https://web.expasy.org/protscale)预测蛋白的亲/疏水性；使用WoLF-PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp)预测亚细胞定位；使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)预测糖基化位点；使用TMHMM Sever v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php) 分析跨膜结构域；使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos) 预测磷酸化位点；使用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)预测蛋白质信号肽；使用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl) 分析蛋白质的二级结构；使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org) 分析蛋白质的三级结构。
1.2.5 紫苏PfAACT基因表达分析
紫苏收获前1.5个月(2020年8月21日)开始收集紫苏叶片样品，每隔10 d为1个时期取1次样，共5个生长时期，每个时期3次生物学重复。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对紫苏根、茎、叶以及5个不同生长时期的紫苏样品进行PfAACT基因表达分析，以紫苏肌动蛋白基因Actin (c86816.graph_c0)为内参对照，引物分别为PfActin-F：5′-TTAACACCCCCGCAATGTAT-3′，PfActin-R：5′-TAGCCTCGCTCCGTCAGTAT-3′；PfAACT-RT-F：5′-GGCCTTTGGGATGTCTACAA-3′， PfAACT-RT-R： 5′-GCGTCGAACTTTCTGAGACC-3′。荧光定量PCR所采用的设备为ABI PRISM 7500 (操作软件为7500 和7500 Fast Real-Time PCR Systems，v2.0.1，USA)；荧光染料为SYBR Green。利用RealMaster Mix (SYBR Green)试剂盒(北京天根)，PCR反应体系总体积为20.0 µL，包括：SYBR Green PCR Master Mix 10.0 µL，上、下游引物各0.5 µL，1.0 ng模板cDNA 2.0 µL，ddH2O 7.0 µL。扩增条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。每个反应3次重复，使用2−ΔΔCt法分析紫苏PfAACT基因表达量。
2. 结果与分析
2.1 紫苏PfAACT基因cDNA克隆与序列分析
对紫苏AACT基因(c107674.graph_c0)进行克隆，扩增获得1条约1200 bp的片段，与参考序列c107674.graph_c0大小一致(图1a)。将PCR产物胶回收连到测序载体pMD19-T上，转化大肠杆菌DH5α进行单克隆测序。对测序信息进行分析，本研究获得紫苏AACT基因开放阅读框(open reading frame，ORF)全长为1254 bp，编码417个氨基酸(图1b)，命名为PfAACT基因。PfAACT氨基酸组成中，苏氨酸(Thr)含量为28.4%，甘氨酸(Gly)含量为27.2%，丙氨酸(Ala)含量为25.4%，半胱氨酸(Cys)含量为19.0%，使用ProtParam预测PfAACT的分子量为42.972 ku，等电点为8.07，分子式为C1 885H3 077N531O576S18，不稳定指数为37.54，归类为稳定蛋白，脂肪族指数为100.19，总平均亲水性为0.250。结合ExPasy-ProtSCale在线软件预测PfAACT蛋白亲/疏水性，结果显示：PfAACT蛋白疏水性最强的位点是第373个氨基酸，疏水最高值为3.000，亲水性最强的位点是第185个氨基酸，亲水性最低值为−2.167，但整个氨基酸预测值分析结果显示该蛋白整体趋向于疏水性，为疏水蛋白(图1c)。
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图 1 PfAACT基因克隆与序列分析注：a) PfAACT基因PCR电泳图；b) PfAACT氨基酸序列；c) PfAACT蛋白质亲/疏水性分析。Figure 1. Cloning and sequence analysis of PfAACT geneNote: a) PCR electrophoretic map of PfAACT gene; b) amino acid sequence of PfAACT; c) hydrophilic/hydrophobic analysis of PfAACT protein.2.2 紫苏PfAACT生物信息学分析
利用NCBI数据库对紫苏PfAACT进行BLAST分析，结果表明：紫苏PfAACT氨基酸与冬凌草IrAACT (Isodon rubescens，ALG00700.1)、丹参SmAACT (Salvia miltiorrhiza，AEZ55671.1)、夏枯草PvAACT (Prunella vulgaris，QEV81803.1)和芝麻SiAACT (Sesamum indicum，XP_011095902.1)的同源性较高，分别为95.44%、94.71%、93.05%和89.69% (图2)，说明紫苏PfAACT蛋白在进化过程中保守性强。通过NCBI蛋白质保守结构域数据库对PfAACT蛋白进行保守结构域预测，结果显示：PfAACT蛋白存在1个典型的硫解酶结构域，属于cond_enzymes 超蛋白家族，含有硫解酶保守结构域位点NVHGGGVSLGHPIGCSG和硫解酶活性结构域位点GVAGICNGGGGASA。利用MEGA 4软件对PfAACT构建进化树并进行亲缘关系分析，结果显示：紫苏PfAACT与冬凌草IrAACT的亲缘关系最近(图3)。
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图 3 紫苏与其他物种AACT的系统发育树分析Figure 3. Phylogenetic relationship of Perilla frutescens with other species AACT families利用在线软件WoLF-PSORT对PfAACT进行亚细胞定位预测，结果显示：PfAACT定位于叶绿体和内质网膜的系数为3，定位于细胞核、细胞质和质膜的系数为2。NetNGlyc 1.0 Server在线软件预测PfAACT蛋白糖基化位点发现：PfAACT含有2个糖基化位点，分别位于氨基酸257和338处(图4a)。TMHMM Sever v.2.0预测PfAACT蛋白跨膜结构域显示：该蛋白整个序列都在膜外，没有跨膜结构域，不属于跨膜蛋白(图4b)。利用NetPhos 3.1 Server预测PfAACT蛋白的磷酸化位点(图4c)发现：预测值大于0.5的磷酸化位点共41个，包括26个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点。SignalP 4.1 Server在线软件预测PfAACT蛋白的信号肽发现：其C值、S值和Y值都低于阈值0.5，表明该蛋白不含有信号肽位点，属于非分泌蛋白(图4d)。
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图 4 PfAACT生物信息学分析注：a) PfAACT糖基化位点分析；b) PfAACT跨膜结构域分析；c) PfAACT磷酸化位点分析；d) PfAACT信号肽分析。Figure 4. Bioinformatics analysis of PfAACTNote: a) PfAACT glycosylation site analysis; b) PfAACT transmembrane domain analysis; c) PfAACT phosphorylation site analysis; d) PfAACT signal peptide analysis.2.3 紫苏PfAACT蛋白质结构预测
利用在线软件SOPMA对PfAACT蛋白质的二级结构进行预测，结果显示：该蛋白二级结构中有α-螺旋179个，占比为42.93%；无规则卷曲131个，占比为31.41%；延伸链65个，占比为15.59%；β折叠42个，占比为10.07%，表明PfAACT蛋白是以α-螺旋和无规则卷曲为主的蛋白二级结构(图5a)。利用在线软件SWISS-MODEL对PfAACT基因编码氨基酸的三级结构进行模型建立，以5xyj.1.A蛋白为模板，用于建立该模型的氨基酸残基范围为12~404位，覆盖范围为95%，序列一致性为51.65%，序列相似度为44% (图5b)。
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图 5 PfAACT氨基酸的二级结构(a)和三级结构(b)预测Figure 5. Secondary structure (a) and tertiary structure (b) prediction of PfAACT2.4 紫苏PfAACT基因qRT-PCR分析
由图6可知：PfAACT基因在紫苏的根、茎、叶中有不同程度的表达，其中在紫苏叶中的表达量高于在根和茎中的表达量，但三者差异不显著；此外，PfAACT基因在紫苏叶不同发育时期的表达量有差异，其中9月20日的紫苏样本表达量最高。
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图 6 PfAACT基因的表达分析注：“*”表示与试验初期(08-21)相比差异极显著(P<0.01)。Figure 6. Expression analysis of PfAACT geneNote: “*” indicates extremely significant difference compared with the beginning of the experiment (08-21) (P<0.01).3. 讨论
紫苏是中国重要的药用植物，是国家卫生健康委员会首批颁布的既是食品又是药品的“药食同源”植物之一，在医药和食品工业上具有广泛的用途[18]。紫苏营养物质丰富，特别是紫苏叶具有天然的独特香味，含有多种维生素、矿物质和次生代谢产物，具有镇静、解毒和祛痰等功效[19]。作为中药材，紫苏的主要药效成分是次生代谢产物，如氨基酸类、黄酮类和萜类等物质[20]。现代药理学研究表明：紫苏具有保护肝脏、降血脂和降血压、抑制血小板聚集、减少血栓形成、预防癌变、提高记忆能力、抗炎、抗过敏及抗微生物等功效[21-23]。紫苏叶含有丰富的挥发油，其主要成分是萜类物质，如紫苏醛和柠檬烯等[24]。萜类化合物是植物次生代谢产物中最大的一个家族，在自然界中广泛分布，它是由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物，至今为止已发现超过40000种萜类化合物[25]。甲羟戊酸途径是植物中合成萜类前体化合物的代谢途径之一，以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸，AACT是该途径中的第1个关键酶，对植物的生长发育和次生代谢产物的生物合成起到重要的作用[26]。
随着分子生物学的发展，大量研究表明：萜类物质生物合成途径中的关键酶对下游萜类物质的合成和积累起决定作用，通过调控相关关键酶基因的表达，可以影响植物中萜类物质的含量。紫苏萜类物质生物合成代谢通路中的相关酶研究鲜有报道，ZHANG等[27]开展了紫苏基因组和群体重测序研究，对紫苏单萜类挥发性化合物进行了深入的遗传学解析，获得了乙酰辅酶A等关键基因信息。本研究基于转录组数据，利用基因克隆技术从紫苏中克隆了AACT基因，其编码417个氨基酸，生物信息学同源分析表明PfAACT蛋白在进化过程中保守性强，存在1个典型的硫解酶结构域，含有硫解酶保守结构域位点和硫解酶活性结构域位点。李贝宁等[28]研究表明：SmAACT基因参与了丹参酮类的生物合成，其表达水平与成分含量的相关系数较高。姚萱航等[29]对2种类型的膜荚黄芪药效成分含量与关键基因表达进行了研究，结果显示：AmAACT、AmFPS、AmHMGS和AmIDI基因与黄芪总皂苷含量显著相关，其表达水平对总皂苷含量具有重要影响。因此，结合已有报道，本研究推测PfAACT基因与紫苏萜类物质的生物合成有关。本研究利用实时荧光定量PCR技术对PfAACT基因在不同组织部位的表达进行分析，结果显示该基因在紫苏叶中的表达量高于在根和茎中的表达量，这与紫苏叶中萜类物质含量高相一致，表明该基因的高表达有利于紫苏萜类物质的积累。PfAACT基因在紫苏不同发育时期的表达量显示该基因在9月中下旬表达量最高，此时期是紫苏叶的收获期，也是萜类物质快速积累期，其表达量与萜类物质积累存在一定的相关性。高表达的PfAACT基因促进了萜类前体化合物的生成，加快紫苏萜类物质的合成。因此，PfAACT基因可能通过提高萜类物质前体化合物的含量参与其生物合成和积累。通过本研究有助于深入了解紫苏萜类物质的生物合成途径及其调控机制，为紫苏萜类物质代谢工程提供候选基因。下一步我们将构建PfAACT基因表达载体，建立紫苏的遗传转化体系，通过农杆菌介导转化紫苏，对其进行遗传改良，以期提高紫苏中萜类物质的含量，为进一步培育高品质的紫苏品种奠定基础。
4. 结论
本研究通过转录测序技术挖掘出紫苏萜类物质生物合成关键基因PfAACT，通过基因克隆技术获得该基因全长为1254 bp，编码417个氨基酸，生物信息学和实时荧光定量PCR分析表明该基因参与了紫苏萜类物质的生物合成。
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图 1 PfAACT基因克隆与序列分析
注：a) PfAACT基因PCR电泳图；b) PfAACT氨基酸序列；c) PfAACT蛋白质亲/疏水性分析。
Figure 1. Cloning and sequence analysis of PfAACT gene
Note: a) PCR electrophoretic map of PfAACT gene; b) amino acid sequence of PfAACT; c) hydrophilic/hydrophobic analysis of PfAACT protein.
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图 3 紫苏与其他物种AACT的系统发育树分析
Figure 3. Phylogenetic relationship of Perilla frutescens with other species AACT families
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图 4 PfAACT生物信息学分析
注：a) PfAACT糖基化位点分析；b) PfAACT跨膜结构域分析；c) PfAACT磷酸化位点分析；d) PfAACT信号肽分析。
Figure 4. Bioinformatics analysis of PfAACT
Note: a) PfAACT glycosylation site analysis; b) PfAACT transmembrane domain analysis; c) PfAACT phosphorylation site analysis; d) PfAACT signal peptide analysis.
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图 5 PfAACT氨基酸的二级结构(a)和三级结构(b)预测
Figure 5. Secondary structure (a) and tertiary structure (b) prediction of PfAACT
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