马瑟兰葡萄体细胞胚再生体系的建立
Establishment of Somatic Embryogenesis System in Vitis vinifera L. cv. ‘Marselan’
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Keywords:
- grape /
- Marselan /
- somatic embryogenesis /
- plant regeneration /
- callus suspension
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魔芋(Amorphophallus konjac)是天南星科(Araceae)魔芋属(Amorphophallus Blume)多年生草本块茎植物[1]。魔芋球茎富含葡甘聚糖，具有很好的加工和推广价值，广泛种植于南方各省山地丘陵区[2]。魔芋作为乡村振兴特色产业之一，在种植面积不断扩大的同时，其规模化种植和产业化开发一直被各种病害所困扰。其中造成魔芋减产最严重的病害是细菌性软腐病，俗称魔芋的“癌症”[3]。软腐病在魔芋换头到块茎膨大的阶段极易发生，这一时期组织相对柔嫩，容易遭受损伤，形成伤口[4]。一旦魔芋感染了软腐病，可迅速造成病害的发展和周围健康植株的感染，球茎在生长、储存或干燥过程中就会腐烂。该病害一般会造成地块减产约30%，严重时可减产70%以上，甚至绝收[5]。
植物经常暴露在细菌、真菌、病毒、线虫和昆虫的生物胁迫下，为了适应这种不利的情况，植物已经进化出完善的机制，帮助感知压力信号并实现最佳的生长反应[6]。植物激素调节植物的各种生物进程，尤其是在帮助植物适应不利环境方面发挥着关键作用。植物体内错综复杂的激素信号网络使它们成为调解防御反应的理想选择[7]。植物对病原菌攻击的反应是在细胞水平上一系列高度协调变化的结果，这些变化部分是由激素信号介导的。越来越多的证据表明：在病原菌致病过程中，尤其注重对寄主激素信号代谢通路的攻击[8]，如病原菌在侵染植物的过程中逐渐进化出不同的策略来破坏水杨酸(salicylic acid，SA)介导的防御反应，通过对SA进行修饰，或与异分支合酶1 (isochorismate synthase 1，ICS1)竞争共同底物异分支酸酶，或直接作用于病程相关基因非表达子1 (nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)等SA信号通路的关键组分，减少SA合成[9]。
本研究针对中抗软腐病魔芋品种的不同生长发育阶段，对其内源激素(生长素、水杨酸、茉莉酸、赤霉素和脱落酸)的含量变化进行测定，并利用RNA-seq测序数据分析激素通路相关基因的表达差异，以期为解析软腐病致病机制和魔芋抗病机制提供参考，也为魔芋软腐病的生物防治研究提供借鉴。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
供试魔芋为中抗魔芋软腐病品种安魔128，由安康市农业科学研究院提供。
1.2 样本准备及前处理
选取感染软腐病的换头期前和换头期后的魔芋叶片作为处理组，以未感染的魔芋叶片作为对照组。每个处理取3株作为混合样品，放入液氮中速冻1 min后，于−80 ℃冰箱中保存备用。
取液氮冷冻样品用研钵均匀研磨粉碎。用天平将预冷的 1.5 mL 或 2.0 mL 离心管在天平上去皮调零，然后称取样品约 100 mg至离心管中，记录样品实际重量。每个处理设置3个重复。
前处理包括提取、纯化和浓缩3步。(1)提取：在研磨后的样品中加入提取液(V乙腈∶V异丙醇∶V水=1∶1∶1) 1.5 mL，超声3 min后置于4 ℃环境，旋转过夜；将样品于4 ℃、13000 r/min 离心10 min，取上清液至新的2.0 mL离心管中；沉淀加入提取液1.0 mL，4 ℃浸提60 min，离心取上清液合并至上述离心管。(2)纯化：分别使用甲醇1.0 mL和水1.0 mL清洗上清液，用50%乙腈进行等压汽液平衡；将提取液加入Oasis HLB柱，收集流出液，然后用30%乙腈进行洗涤。(3)浓缩：流出液用氮气在低温下吹干，然后用30%乙腈300 μL重悬，并用0.22 μm尼龙膜过滤，所得滤液用于质谱分析。
1.3 激素含量测定
采用UHPLC-ESI-MS/MS分析方法对样本中植物激素[ 生长素(growth hormone，IAA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)、赤霉素(gibberellin，GA3)和脱落酸(abscisic acid，ABA) ]进行定性定量检测，质谱系统采用AB Scix Qtrap5500质谱检测系统。用MultiQuant (AB Sciex)软件绘制线性回归标准曲线，在线性方程中代入样品分析物的质谱峰面积，计算样品中激素质量。每个测试样品分别设置3个生物学重复和3个技术重复。
1.4 转录组数据分析
利用实验室前期完成的转录组测序数据，根据KEGG富集通路图，选取与植物激素代谢通路相关的25个合成代谢和信号转导的关键基因，其中IAA、SA、JA、GA3和ABA各选取5个基因，对其FPKM (fragments per kilobase per million)进行表达量分析。
1.5 RT-qPCR验证分析
选取转录组同等处理的魔芋组织，在5个激素代谢通路中各随机选取2个基因(共10个基因)进行RT-qPCR分析，其中IAA通路选取基因ARF和TIR，SA通路选取基因NPR1和TGA1，JA通路选取COI1和MYC2，GA通路选取基因GA20ox和GID1，ABA通路选取基因PYL8和SnRK2。利用RNA提取试剂盒(博日科技)提取魔芋总RNA。利用M-MLV反转录酶(Promega)进行RNA的反转录。使用UltraSYBR Mixture (康为)和实时PCR检测系统(Roche)对RT-qPCR进行定量检测。利用Primer3web 4.0.0设计RT-qPCR的目标基因特异性引物对，以18S基因作为参考基因。使用2−∆∆Ct方法对目标基因的相对表达水平进行归一化处理[10]。所有RT-qPCR反应均设置3个生物学重复和3个技术重复。
1.6 数据分析
采用SPSS 22.0对数据进行统计分析；采用Origin 2017进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 生长素(IAA)含量及相关通路基因的变化
由图1可知：IAA含量在软腐菌侵染的魔芋换头期前显著增加，换头期后IAA含量有所下降，但依然高于对照；IAA代谢通路基因的表达也呈上调表达，其中IAA和ARF基因在换头期前的表达水平最高，随后下降，其变化趋势与IAA含量相同；随着魔芋发育阶段的推进，AUX1、AUX2和TIR基因的表达水平呈逐渐上升的趋势。
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图 1 IAA含量及代谢通路基因的表达分析注：CK. 对照组，T1. 换头期前，T2. 换头期后；“*”表示与CK相比差异显著 (P<0.05)；下同。Figure 1. IAA content and expression analysis of metabolic pathway genesNote: CK. control group, T1. the period before head change, T2. the period after head change; “*” indicates significant differences compared with CK (P<0.05); the same as below.2.2 水杨酸(SA)含量及相关通路基因的变化
由图2可知：SA含量在软腐菌侵染的魔芋换头期前显著增加，换头期后其含量有所下降；SA代谢通路基因NPR1呈上调表达，但表达量较低；NPR3基因的表达量随着魔芋的发育而有所下降；TGA1作为NPR1互作的转录因子，其表达水平显著上调；TGA4基因表达先显著上调再显著下降；PAL是关键的酚类生物合成酶(丙氨酸解氨酶)，其基因表达量也显著上调。
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图 2 SA含量及代谢通路基因的表达分析Figure 2. SA content and expression analysis of metabolic pathway genes2.3 茉莉酸(JA)含量及相关通路基因的变化
由图3可知：随着软腐菌侵染时间的推移，JA含量呈逐渐增加的趋势；异亮氨酸合成酶JAR1基因、茉莉酸-ZIM结构域蛋白JAZ基因和氧化烯合成酶AOS基因的转录表达水平与JA含量的变化趋势相同。
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图 3 JA含量及代谢通路基因的表达分析Figure 3. JA content and expression analysis of metabolic pathway genes2.4 赤霉素(GA3)含量及相关通路基因的变化
由图4可知：GA3含量在软腐菌侵染的魔芋换头期前显著增加，换头期后其含量显著下降；形成GA-GID1-DELLA复合体的GID1和DELLA的表达水平均上调，DELLA蛋白的靶基因PIF3和PIF4也呈现先上调再下调的表达趋势，而GA3合成关键酶基因GA20ox呈现下调表达。
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图 4 GA3含量及代谢通路基因的表达分析Figure 4. GA3 content and expression analysis of metabolic pathway genes2.5 脱落酸(ABA)含量及相关通路基因的变化
由图5可知：ABA含量在软腐菌侵染的魔芋换头期前显著增加，换头期后其含量有所下降；植物激素脱落酸的受体基因PYL8呈先上调表达后下调表达的趋势，SnRK2激酶基因和ABF基因也呈现相同的趋势，ABA合成代谢关键酶基因NCED含量较低，但仍显著上调表达。
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图 5 ABA含量及代谢通路基因的表达分析Figure 5. ABA content and expression analysis of metabolic pathway genes2.6 激素代谢通路基因的RT-qPCR表达分析
由图6可知：IAA通路的ARF和TIR均上调表达，其中ARF在换头期前、后均显著上调表达，TIR的表达在换头期后不显著；SA通路的NPR1和TGA1表达水平上升，其中TGA1在换头期前、后均显著上调表达，NPR1在换头期后变化不显著；JA通路的COI1和MYC2在换头期前、后均显著上调表达；GA通路的GID1表达水平在换头期后显著上调，GA20ox在换头期前、后的表达均不显著；ABA通路的PYL8和SnRK2在换头期前、后均显著上调表达。此外，RT-qPCR表达分析的结果与转录组测序结果基本一致，个别基因在魔芋的不同发育阶段与转录组数据存在差异，可能是由于选取验证的基因表达量偏低所致。
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图 6 激素代谢通路10个基因的表达水平分析Figure 6. Analysis of the expression levels of 10 genes in the hormone metabolic pathway3. 讨论
在植物生长发育和对抗逆境胁迫等生物过程中，植物激素发挥着至关重要的作用。大量研究表明植物激素信号的存在及其在植物体内的转导[11]，更深入的分子研究也阐明了多种植物激素通路，且每种通路都由许多信号成员组成，将特定的激素感知与下游基因的调控联系起来[12-13]。在一些植物与病原体的相互作用中，IAA水平的升高也能促进病害发展[14-15]。IAA信号可以拮抗植物的防御反应，也可以作为微生物信号分子直接影响病菌的生物学特性[16]，如在油菜对芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)感染的早期反应中，推测IAA作为信号分子刺激根毛感染[17]；在棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)感染的棉花根部，游离的IAA含量增加了5倍[18]。在本研究中，软腐病侵染初期魔芋中IAA含量就处于上升状态，这可能是由于病原菌侵染而导致魔芋体内IAA的生物合成增加。
SA的合成是植物建立局部和系统获得性抗性的关键[19]，一旦SA通路在侵染部位被激活，往往会在植物远端部位触发防御反应以保护未受损害的组织[20]。研究表明：施用SA会诱导病原体相关蛋白的积累[21]，其介导的机制可能涉及改变某些酶的活性或合成，以及防御基因表达的增加或自由基的产生[22]。本研究中，随着软腐菌侵染进程，NPR1和TGA1含量均显著增加，调控对病原菌的抗性反应，分析其含量增加的原因是SA的作用依赖PR基因，该基因激活的关键调控元件之一是 NPR1基因，NPR1在细胞核中与TGA类转录因子相互作用，进而促进PR基因表达以及随后的防御反应[23]。
JA可以在植物遭受病原菌入侵时发挥重要的防御作用，捕捉病原菌入侵，通过信号传递使植物对病原菌的胁迫作出积极、主动的反应[24]。一些病原菌如丁香假单孢菌能够同时诱导激活SA和JA途径[25]。还有研究表明：SA诱导的防御多针对生物营养病原菌，JA激活的防御针对创伤和坏死型病原菌，而激活对生物营养病原菌的免疫途径可抑制对坏死型病原菌的防御[26]。这也解释了本研究中JA含量在魔芋换头期后显著上升、JAR1和MYC2显著上调的原因。
活性GA的生物合成途径涉及多种酶类以及多步反应[27]。外界环境胁迫会引发体内GA含量的变化，植物也可以通过调节GA生物合成、信号转导及其生物活性提高对胁迫的耐受性[28]。GA导致DELLA蛋白生长抑制剂降解，可提高活性氧和SA的积累，减弱JA信号的传递[29]。病原菌入侵会破坏植物内源GA的平衡，从而引起GA缺乏，如马铃薯紫顶病原生质体可感染番茄，导致其内源性GA3水平显著下降[30]。本研究中，GA3可能通过DELLA和SA信号途径发挥作用，从而调节魔芋对软腐病侵染的防御反应，这种诱导防御降低了病原菌的含量，并显著减轻了病害症状。
ABA也被证明在植物的生物防御反应中起关键的调节作用。胁迫条件下，植物在不同的器官中合成ABA并启动防御机制，如调节气孔开闭及表达防御相关基因，使其对环境胁迫产生抗性[31]。同时，ABA也成为调节和整合植物免疫反应的核心因素，病原菌可以诱导植物ABA的表达机制以造成病害[32]，如：3种关键的ABA生物合成酶(NCED3、ABA3/LOS5和AAO3)被Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000、Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326和Botrytis cinerea侵染并诱导表达[33]。本研究中，PYL8受体基因被诱导后显著表达，可能被选择用于魔芋抵抗软腐病侵染的ABA信号传递受体，但SnRK2基因作为ABA的关键正调控因子上调表达不显著，可能是由于PYL介导的ABA信号转导拮抗了SnRK2活性。
综上所述，软腐病菌入侵后，魔芋中高含量的JA、SA和ABA提高了其初期的抗病能力，抑制了软腐病菌的继续侵入及症状产生，表明安魔128在抵御软腐病菌的过程中主要通过SA信号途径诱发系统获得性抗性阻止软腐病菌的进一步侵染，同时，JA和ABA信号途径也发挥了一定的作用；换头期后，魔芋体内的激素基础抗性未能进一步阻止软腐病菌的侵染，多个内源防御激素呈现下降趋势，可能被软腐菌劫持或压制。此外，在软腐病菌侵染后，魔芋体内的多个激素可能存在互作或拮抗作用，如SA和JA介导的防御信号通路可能存在拮抗作用，但具体的抗性机制还有待于进一步研究。
4. 结论
魔芋体内IAA、SA、ABA和GA3的含量随着软腐菌侵染而呈先增后减的趋势，而JA含量随着软腐菌侵染而逐渐增加；随着软腐菌的侵染，IAA通路的IAA、AUX1、AUX2和TIR基因显著上调，SA通路的NPR1和TGA1基因显著上调，JA通路的JAR1和AOS基因显著上调，GA3通路的GID1基因显著上调，ABA通路的PP2C和NCED基因显著上调。本研究结果将为科学防控魔芋软腐病提供了理论依据。
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图 1 马瑟兰葡萄花蕾及未成熟种子愈伤组织诱导
注：a)花蕾；b)~c)花蕾愈伤形成；d)分别从花蕾花托、柱头、花丝与花托连接处、花丝与花药连接处产生的愈伤组织；e)继续培养膨大的花蕾愈伤；f)果实与未成熟种子；g)~h)未成熟种子愈伤形成；i)未成熟种子形成水渍状、淡黄色或棕色不透明愈伤组织；j)未成熟种子愈伤进一步发育。
Figure 1. Induction of callus from flower buds and immature seeds of grape Marselan
Note: a) flower buds; b)-c) callus formation of buds; d) callus from bud receptacle, stigma, filament-receptacle junction, filament-anther junction; e) continue to culture the enlarged bud callus; f) fruit and immature seeds; g)-h) callus formation of immature seeds; i) the immature seeds formed watery, light yellow or brown opaque callus; j) further development of callus from immature seeds.
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图 2 马瑟兰未成熟种子体细胞胚诱导与萌发成苗
注：a)胚性愈伤团，b)萌发的体细胞胚，c)完整体细胞胚，d)~g)体细胞胚发育成苗，h)异常萌发的体细胞胚，i)~j)体细胞胚萌发畸形苗；红色箭头表示未萌发的乳白色体细胞胚，白色箭头表示白色不透明胚性愈伤组织，蓝色箭头表示棕色或淡黄色胚性愈伤组织，绿色箭头表示萌发的体细胞胚。
Figure 2. Somatic embryo induction and germination of immature seeds of Marselan
Note: a) embryogenic callus, b) embryonic somatic embryos, c) complete whole embryo, d)-g) somatic embryos develop into seedlings, h) abnormal germination of somatic embryos, i)-j) somatic embryo germination malformed seedlings; the red arrow represents milky white somatic embryos that did not germinate, the white arrow represents white opaque embryonic callus, the blue arrow represents brown or pale yellow embryonic callus, and the green arrow represents germinated somatic embryos.
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图 3 畸形苗循环诱导
注：a)切断的畸形苗叶片；b)~c)叶段萌发不定苗；d)不定苗生根。
Figure 3. Reculture of malformed seedlings
Note: a) cut off malformed seedling leaves; b)-c) adventitious germination of leaf segments; d) rooting of adventitious seedlings.
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图 4 愈伤悬浮培养
注：a)愈伤悬浮培养；b)不同形态的细胞聚合物；c)培养过程中不同形态愈伤；d)绿色疏松愈伤组织镜检；e~h)愈伤持续培养。
Figure 4. Callus suspension culture
Note: a) callus suspension culture; b) aggregation of cells of different forms; c) callus with different morphology during culture; d) microscopic examination of green loose callus; e-h) continuous callus culture.
表 1 供试激素组合
Table 1 Hormone combinations for testing
mg/L 培养基序号 medium codes c2,4-D cm cTDZ c6-BA Fow1 0.6 — 1.8 — Fow2 1.2 — 1.8 — Fow3 2.4 — 1.8 — Fow4 0.6 — 3.6 — Fow5 1.2 — 3.6 — Fow6 2.4 — 3.6 — Ims1 2.0 — — 1.5 Ims2 2.0 — — 3.0 Ims3 2.0 — — 4.5 Ims4 — 0.9 3.0 — Ims5 — 0.9 5.0 — Ims6 — 0.9 7.0 — 注：Fow和Ims分别表示外植体为花蕾和未成熟种子，下同；2,4-D. 2,4-二氯苯氧乙酸，m. 褪黑素，TDZ. 噻苯隆，6-BA. 6-苄氨基嘌呤。Note: Fow and Ims indicate explant is flower and immature seed, respectively, the same as below; 2,4-D. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, m. melatonin, TDZ. thidiazuron, 6-BA. N-(phenylmethyl)-9H-purin-6-amine. 
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表 2 马瑟兰葡萄花蕾与未成熟种子在不同激素组合下的愈伤诱导效果
Table 2 Callus induction effects from flower buds and immature seeds of grape Marselan under different hormon combinations
培养基序号
medium codes接种数
number of inoculation愈伤组织诱导率/%
callus induction rate愈伤组织状态
callus status regulationFow1 200 4.00±0.81 e 花丝与花药连接处微量发生
trace occurrence at the junction of filament and antherFow2 200 14.00±2.76 e 花丝与花药连接处少量发生
occurs sparingly at the junction of filament and antherFow3 200 40.00±6.86 d 花柄切口处大量发生
a large number of flower stalk incisions occurFow4 200 4.00±0.81 e 花柄切口处微量发生
the incision of flower stalk occurred in traceFow5 200 12.00±3.12 e 花柄切口处发生
occurs at the notch of the flower stalkFow6 200 78.00±6.94 a 花柄切口处大量发生
a large number of flower stalk incisions occurIms1 192 52.08±2.39 bc 微小颗粒状愈伤
microscopic granular callusIms2 192 67.19±5.91 a 饱满淡黄色愈伤
full pale yellow callusIms3 192 48.44±2.70 bcd 微白色愈伤
bluish callusIms4 192 44.27±7.04 cd 大量发生，干瘪，不水润
abundant, dry, not moistIms5 192 70.31±7.82 a 大量发生，饱满湿润
abundant and moistIms6 192 56.77±2.39 b 大量发生，微小湿润
occurring in large quantities and slightly moist注：各培养基配方见表1；不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。
Note: The media components of each medium list in Tab. 1; different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05); the same as below.
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表 3 不同激素组合对马瑟兰葡萄未成熟种子体细胞胚的诱导作用
Table 3 Induction effects of different hormone combinations one the somatic embryos from immature seeds of grape Marselan
培养基序号medium codes 体细胞胚诱导率/%induction rate of somatic embryos Ims1 0 e Ims2 2.08±0.90 c Ims3 6.77±0.90 a Ims4 0 e Ims5 3.65±0.90 b Ims6 1.04±0.90 cd
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1. 董博文，朱美如，刘婷，张鹏. PEG处理对山梨种子热休眠的预防作用研究. 西南林业大学学报(自然科学). 2024(06): 21-28 . 
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