烟草是中国重要的经济作物，上部烟叶占整个烟草植株总产量的30%~40%，但上部烟叶普遍存在化学协调性差、烟气香气量不足和刺激性强等问题，限制了其在卷烟叶组配方中的使用^[1]。研究表明：微生物发酵法可以改善烟叶品质，提升其应用价值。张倩颖等^[2]利用冬虫夏草菌株发酵烟叶，烟叶质体色素降解产物及西柏烷类降解产物含量显著增加，评吸质量提高。薛磊等^[3]筛选得到1株芽孢杆菌用于发酵烟叶，烟叶吸食品质有所改善。酿酒酵母是发酵工业中常用的微生物，应用于烟草加工可增加烟草及其制品的香气成分^[4-5]。龙章德等^[6]利用酿酒酵母对上部烟叶进行混菌发酵，发酵后上部烟叶化学成分趋于协调，香气量有所增加，但烟碱和总氮含量仍处于较高水平。

烟碱对酵母发酵有一定的抑制作用，且烟叶中烟碱含量过高会导致抽吸时烟气刺激性强、劲头大^[7]。研究表明：在简单培养基中添加有机酸会影响微生物对碳源的利用；在青贮饲料中添加适量有机酸也可以促进酵母生长繁殖^[8-9]。此外，在烟丝中添加有机酸，可以减少进入烟气的烟碱，减轻烟气刺激性并调节吸味^[10]。目前，有机酸主要应用于烟草烘烤或卷烟加料等环节^[10-11]，而在烟草发酵过程中添加有机酸对微生物生长及烟草品质的影响鲜有报道。

本研究以改善上部烟叶品质为目的，从化学指标及挥发性物质含量入手，利用酿酒酵母对上部烟叶进行发酵处理，探究添加柠檬酸或苹果酸对酿酒酵母发酵上部烟叶品质的影响，为利用生物技术改善上部烟叶品质提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   试验方法

1.1.1   烟叶发酵及样品制备

以未处理的永州B2F (B1)混打片烟作为对照组，设置发酵组、柠檬酸添加组和苹果酸添加组并配制料液。(1) 对照组(CK)：未添加任何物料；(2) 发酵组(SC)：将1%葡萄糖、0.01%大豆肽和0.06%酿酒酵母(安琪酵母股份有限公司)溶解于30%无菌水中；(3) 柠檬酸添加组(CA-1、CA-3、CA-5和CA-7)：在发酵组的基础上，分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%的柠檬酸；(4) 苹果酸添加组(MA-1、MA-3、MA-5和MA-7)：在发酵组的基础上，分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%的苹果酸。物料用量为物料质量占上部烟叶原料质量的百分比。

取30 g上部烟叶，将料液均匀喷洒于其表面，喷洒完毕后静置10 min，随后装入自封袋中密封，发酵7 d，发酵温度30 ℃，相对湿度60%。发酵完毕的上部烟叶于40 ℃下烘干，研磨并过40目筛，所得烟末用于指标测定。

1.1.2   pH值及常规化学成分的测定

参考YC/T 222—2007^[12]、YC/T 159—2019^[13]、YC/T 160—2002^[14]和YC/T 161—2002^[15]等行业标准，分别测定烟叶pH值及水溶性总糖、总植物碱和总氮含量。

1.1.3   生物碱的测定

准确称取喹啉45 mg，用二氯甲烷—甲醇(V_CH2Cl2∶V_CH3OH=3∶1)溶解后定容至250 mL，得到质量浓度为0.18 mg/mL的内标溶液。样品预处理参考LIN等^[16]的方法；采用气相色谱—质谱联用法进行测定。气相色谱条件：色谱柱HP-5MS UI (30 m×250 μm×0.25 μm)，载气为高纯He，进样体积10 μL，进样口温度250 ℃，分流比100∶1。程序升温条件：初始温度70 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速率升温至250 ℃保持5 min。质谱条件：离子源为电子轰击(EI)，离子源温度230 ℃，扫描模式为选择离子检测(SIM)，质量扫描范围40~500 m/z。

1.1.4   非挥发性有机酸的测定

样品预处理参考易娇等^[17]的方法；采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB AQ-C18 (4.60 mm×250 mm×5 μm)；流动相：0.02 mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 2.70)；流速0.50 mL/min；检测波长214 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；外标法定量；等度洗脱100% KH₂PO₄，40 min。

1.1.5   挥发性物质含量的测定

称取2.50 g烟末装入顶空瓶中，同时加入20 μL 5 mg/mL 乙酸苯乙酯(内标)的二氯甲烷溶液。顶空—固相微萃取条件：萃取头75 μm CAD/PDMS，萃取温度65 ℃，萃取时间45 min，解吸温度250 ℃，解吸时间3 min。气相色谱条件：色谱柱：TR-5 ms (60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯He；流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；采用不分流进样模式。升温程序：起始温度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升至120 ℃保持2 min，再以7 ℃/min的速率升至220 ℃保持5 min。质谱条件：离子源为电子轰击(EI)；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围33~350 m/z；扫描速率3.00 scans/s。

1.2   数据处理方法

采用IBM SPSS Statistics 25与Microsoft Excel 2019进行数据处理、绘图和方差分析；采用Qualitative Analysis B.07.00和NIST谱库对挥发性物质进行定性分析。

2.   结果与分析

2.1   添加有机酸对上部烟叶pH值的影响

由图1可知：发酵前，上部烟叶pH值随有机酸添加量的增加而显著降低(P<0.05)，且同一添加量下，柠檬酸添加组的pH值稍低于苹果酸添加组。发酵后，发酵组上部烟叶pH值显著降低(P<0.05)；添加0.10%~0.70%柠檬酸或0.10%~0.30%苹果酸组的pH值变化不大；添加0.50%~0.70%苹果酸，pH值显著降低(P<0.05)。此外，发酵前后pH值降幅大小依次为发酵组>苹果酸添加组>柠檬酸添加组。

图  1  上部烟叶发酵前后pH值的变化

注：CK. 未添加料液，SC. 酿酒酵母发酵，CA-1~CA-7. 分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%柠檬酸发酵，MA-1~MA-7. 分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%苹果酸发酵；不同字母表示样品间有显著性差异(P<0.05)；下同。

Figure  1.  Changes of pH value in upper tobacco leaves before and after fermentation

Note: CK. without materials, SC. fermented by Saccharomyces cerevisiae, CA-1 to CA-7. fermented with adding 0.10%, 0.30%, 0.50% and 0.70% citric acid, respectively, MA-1 to MA-7. fermented with adding 0.10%, 0.30%, 0.50% and 0.70% malic acid, respectively; different letters indicate significant differences among samples (P<0.05); the same as below.

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2.2   添加有机酸对上部烟叶化学成分的影响

由表1可知：与对照组相比，发酵组上部烟叶水溶性总糖含量和糖碱比分别提高17.52%和26.26%，总植物碱和总氮含量分别降低6.86%和4.81%，氮碱比变化不大，化学成分趋于协调。柠檬酸和苹果酸对酿酒酵母发酵上部烟叶化学成分的影响差异较大。添加0.10%~0.30%柠檬酸，水溶性总糖含量和糖碱比分别较发酵组降低8.56%~10.44%和7.56%~13.87%，但总氮含量显著增加(P<0.05)，氮碱比达0.71~0.73；添加0.50%柠檬酸后，糖碱比稍有提高；添加0.50%~0.70%柠檬酸协同发酵，上部烟叶其他化学指标变化不大。添加0.10%~0.50%苹果酸，水溶性总糖含量较发酵组显著增加(P<0.05)，糖碱比提高3.36%~5.46%，其他化学指标变化不大；添加0.70%苹果酸，水溶性总糖含量和糖碱比变化不大，但总氮含量显著增加(P<0.05)。当柠檬酸或苹果酸添加量为0.50%时，糖碱比相对较高。此外，同一添加量下，苹果酸添加组的糖碱比均高于柠檬酸添加组。

表  1  上部烟叶化学成分的变化

Table  1.  Changes of chemical components in upper tobacco leaves

化学成分 chemical components	CK	SC	CA-1	CA-3	CA-5	CA-7	MA-1	MA-3	MA-5	MA-7
水溶性总糖/% water-soluble total sugar	15.41±0.43*	18.11±0.05	16.22±0.15*	16.56±0.64*	18.09±0.15	18.37±0.42	18.96±0.23*	18.71±0.12*	18.86±0.32*	18.36±0.01
总植物碱/% total alkaloid	4.08±0.04*	3.80±0.06	3.95±0.01*	3.77±0.05	3.74±0.06	3.89±0.02	3.85±0.01	3.75±0.04	3.76±0.00	3.86±0.01
总氮/% total nitrogen	2.70±0.02*	2.57±0.02	2.90±0.17*	2.67±0.06*	2.55±0.01	2.62±0.01	2.62±0.02	2.60±0.03	2.59±0.02	2.67±0.03*
糖碱比 sugar-alkali ratio	3.77	4.76	4.10	4.40	4.84	4.72	4.92	4.99	5.02	4.75
氮碱比 nitrogen-alkali ratio	0.66	0.68	0.73	0.71	0.68	0.67	0.68	0.69	0.69	0.69
注：CK. 未添加料液，SC. 酿酒酵母发酵，CA-1~CA-7. 分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%柠檬酸发酵，MA-1~MA-7. 分别添加0.10%、0.30%、0.50%和0.70%苹果酸发酵；“*” 表示与SC处理有显著性差异(P<0.05)；下同。 Note: CK. without materials, SC. fermented by Saccharomyces cerevisiae, CA-1 to CA-7. fermented with adding 0.10%, 0.30%, 0.50% and 0.70% citric acid, respectively, MA-1 to MA-7. fermented with adding 0.10%, 0.30%, 0.50% and 0.70% malic acid, respectively; “*” indicates significant differences with SC treatment (P<0.05); the same as below.

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2.3   添加有机酸对上部烟叶生物碱的影响

由图2可知：酿酒酵母发酵后上部烟叶烟碱含量从32.12 mg/g降低至28.28 mg/g，较对照组降低11.96%。添加柠檬酸或苹果酸协同发酵后，随着添加量的增大，上部烟叶烟碱含量均呈先降低后升高的趋势。当柠檬酸或苹果酸添加量为0.10%~0.30%时，烟碱含量高于发酵组，但仅有添加0.10%柠檬酸时达显著水平(P<0.05)；当柠檬酸或苹果酸添加量为0.50%时，烟碱含量低于其他添加量组，分别较对照组降低14.79%和17.47%。同一添加量下，苹果酸添加组烟碱含量稍低于柠檬酸添加组。

图  2  上部烟叶4种生物碱含量的变化

注：“*” 表示与SC处理有显著性差异(P<0.05)。

Figure  2.  Changes of the content of four alkaloids in upper tobacco leaves

Notes: “*” indicates significant differences with SC treatment (P<0.05).

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由图2还可知：除烟碱外的3种烟草生物碱含量排序为新烟草碱>降烟碱>假木贼碱。经过发酵的上部烟叶降烟碱含量是对照组的1.60~2.65倍，但其含量与是否加入有机酸、有机酸种类及添加量之间无明显规律。此外，对照组、发酵组、柠檬酸添加组和苹果酸添加组的新烟草碱及假木贼碱含量无显著性差异(P>0.05)。

2.4   添加有机酸对上部烟叶非挥发性有机酸的影响

由表2可知：与对照组相比，发酵组草酸含量变化不大，苹果酸含量降低3.92%，柠檬酸含量提高28.19%，非挥发性有机酸总量稍有提高。添加柠檬酸或苹果酸协同发酵对非挥发性有机酸总量的影响稍有差异。柠檬酸添加组的非挥发性有机酸总量高于发酵组，且随柠檬酸添加量的增加而增加；添加0.10%~0.30%苹果酸时非挥发性有机酸总量低于发酵组，而添加0.50%~0.70%苹果酸时该指标高于发酵组。当柠檬酸或苹果酸添加量为0.70%时，非挥发性有机酸总量较高，且添加0.70%苹果酸时的总量高于添加0.70%柠檬酸。此外，柠檬酸添加组和苹果酸添加组的草酸含量变化幅度较小，且草酸含量随着柠檬酸添加量的增加而减少、随着苹果酸添加量的增加而增加；柠檬酸或苹果酸含量均随着对应有机酸添加量的增加而增加；苹果酸添加组的柠檬酸含量较发酵组降低5.80%~13.38%。

表  2  上部烟叶非挥发性有机酸含量的变化

Table  2.  Changes of the content of non-volatile organic acids in upper tobacco leaves mg/g

有机酸 organic acids	CK	SC	CA-1	CA-3	CA-5	CA-7	MA-1	MA-3	MA-5	MA-7
草酸 oxalic acid	5.32±0.15	5.56±0.09	5.54±0.10	5.36±0.13	5.35±0.09	5.23±0.14*	5.27±0.11*	5.35±0.09	5.39±0.10	5.50±0.08
苹果酸 malic acid	47.17±0.15*	45.32±0.05	45.58±0.32	47.07±0.77*	45.83±0.56	45.11±0.74	46.01±0.54	46.73±0.54*	51.89±0.60*	51.74±0.38*
柠檬酸 citric acid	12.24±0.52*	15.69±0.36	15.56±0.55	16.71±0.75	18.46±0.61*	19.63±1.66*	14.78±0.46	13.91±0.45*	13.59±0.26*	14.17±0.57*
总和 total	64.73	66.57	66.69	69.14	69.64	69.97	66.06	65.99	70.87	71.41

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2.5   添加有机酸对上部烟叶挥发性物质含量的影响

对烟末的挥发性物质进行测定，共检测出92种物质，不同处理上部烟叶的挥发性物质组成变化不大，但物质含量差异较大。由表3可知：与对照组相比，发酵组氮杂环类及芳香烃类物质含量降幅较大，酸类、醇类、酮类和醛类物质及新植二烯含量有所提高。柠檬酸添加组中，当添加量为0.10%或0.70%时，酮类物质含量较高；当添加量为0.30%时，酸类、醇类、酮类、酯类和醛类物质含量较低，但氮杂环类物质含量较高。苹果酸添加组中，随苹果酸添加量的增加，酮类、酯类和醛类物质含量呈下降趋势，当添加量为0.50%~0.70%时，酸类物质含量较高。在其他组分中，柠檬酸添加组（除0.30%添加组）和苹果酸添加组的新植二烯含量均高于发酵组。随柠檬酸添加量的增加，新植二烯含量呈先降低后升高的趋势；随苹果酸添加量的增加，新植二烯含量逐渐降低，但变化幅度较小。

表  3  上部烟叶中各类挥发性物质含量占总量的比例

Table  3.  Percentage of volatile substances in upper tobacco leaves %

物质 substance	CK	SC	CA-1	CA-3	CA-5	CA-7	MA-1	MA-3	MA-5	MA-7
酸类 acids	2.38	2.71	2.36	2.31	2.55	2.49	2.95	2.54	3.92	4.49
醇类 alcohols	0.86	1.24	1.11	0.98	1.09	1.05	1.12	0.97	1.02	0.89
酮类 ketones	2.35	3.09	3.36	2.59	3.05	3.12	3.12	2.59	2.57	2.35
酯类 esters	0.17	0.19	0.20	0.16	0.19	0.18	0.18	0.15	0.15	0.13
醛类 aldehydes	0.30	0.45	0.42	0.33	0.38	0.37	0.40	0.29	0.32	0.27
酚类 phenols	0.05	0.05	0.05	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04
烷烃类 alkanes	0.60	0.86	0.91	0.74	0.91	0.93	1.02	0.78	0.76	0.67
氮杂环类 nitrogen heterocycles	89.09	86.30	85.12	87.88	86.11	85.39	84.95	86.97	85.61	85.72
氧杂环类 oxygen heterocycles	0.10	0.14	0.15	0.11	0.16	0.15	0.16	0.12	0.12	0.11
芳香烃类 aromatic hydrocarbons	0.38	0.16	0.14	0.12	0.14	0.14	0.15	0.10	0.10	0.09
新植二烯 neophytadiene	3.70	4.76	6.15	4.69	5.35	6.10	5.85	5.42	5.35	5.22

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3.   讨论

烟叶pH值在一定程度上可以反映其酸碱平衡。酿酒酵母发酵后上部烟叶pH值下降，可能是因为酿酒酵母在降解大分子化合物过程中产生酸性物质，但柠檬酸添加组和苹果酸添加组发酵前后的pH值降幅小于发酵组，可能是因为在发酵过程中酿酒酵母消耗了部分柠檬酸和苹果酸，使烟叶pH值稍有回升^[18]。

酿酒酵母发酵使上部烟叶化学成分趋于协调，添加苹果酸协同发酵使水溶性总糖含量进一步提高。酿酒酵母发酵后，上部烟叶水溶性总糖含量及糖碱比提高，总植物碱及总氮含量降低，与覃明娟等^[19]的研究结果相似。添加有机酸时酿酒酵母发酵上部烟叶化学成分存在差异，可能有两方面原因：一方面，pH值降低，在一定程度上抑制了其他微生物生长，减少微生物对水溶性糖的消耗；另一方面，外源有机酸可以影响酿酒酵母的生长和代谢^[20]。柠檬酸和苹果酸是多种代谢途径的中间产物，可以影响代谢相关酶活性，从而影响微生物对糖或其他物质的利用^[17]。此外，也与有机酸进入细胞的难易程度以及对微生物胞内外化学环境的影响有关^[21-23]。添加0.50%~0.70%柠檬酸协同发酵时水溶性总糖含量较高，可能是因为在此添加量下酵母数量增加，更多大分子碳水化合物被降解，从而使水溶性总糖含量提高^[8]。添加苹果酸协同发酵，上部烟叶水溶性总糖含量进一步提高，可能与苹果酸强化三羧酸循环等代谢途径中的反应有关，可促进菌体生长，使其代谢活动增强^[24]。

添加0.50%~0.70%有机酸协同发酵能进一步降低烟碱含量，提高非挥发性有机酸总量。酿酒酵母无法降解烟碱，但其代谢产生的酸性物质及外源有机酸都能与烟碱结合成盐，使烟碱从游离态转化为结合态。添加有机酸协同发酵，上部烟叶非挥发性有机酸含量发生变化，可能是因为柠檬酸和苹果酸作为代谢中间产物可以影响代谢进行的方向和程度，引起其他中间产物变化^[25-26]。非挥发性有机酸对烟草香味没有明显作用，但可以使烟气更醇和。王颖等^[27]利用酵母菌发酵烟叶，发酵后烟叶非挥发性有机酸总量有所提升，但总植物碱含量变化不大，与本研究结果不完全一致，可能与发酵条件不同有关。上部烟叶有机酸含量低、烟碱含量高，存在酸碱不平衡的问题，添加有机酸协同酿酒酵母发酵有助于改善上部烟叶酸碱平衡。

酿酒酵母发酵后，上部烟叶中酸类、醇类、酮类和醛类等挥发性物质含量有所提高，添加有机酸协同发酵后新植二烯含量明显提高。微生物在不同底物及发酵条件下产生的香气物质种类或含量有所差别，通常与其生长和代谢有关^[28-29]。本研究发现：添加有机酸协同酿酒酵母固态发酵对上部烟叶挥发性物质种类影响不大，对挥发性物质含量影响较大。新植二烯是烟草中最重要的中性香气成分，可减轻烟气刺激性、增强柔和性和细腻程度，对发酵烟叶的感官品质具有显著贡献^[30]。胡志忠等^[31]利用产香酵母对烟叶进行发酵，香气物质含量提高，其中，新植二烯含量从880.42 μg/g提升至958.49 μg/g。本研究结果与其相似，且发现添加有机酸协同发酵，可使上部烟叶的新植二烯含量进一步提高，说明有机酸在烟草醇化过程中有利于提高香气成分含量。

本研究利用酿酒酵母发酵处理上部烟叶，上部烟叶化学成分趋于协调；适当添加有机酸协同发酵，有利于控制烟碱含量、提高非挥发性有机酸及新植二烯含量，整体上有利于改善上部烟叶品质。在烟草发酵方面，混菌发酵和微生物发酵结合酶处理等技术已有相关报道，利用外源有机酸协同微生物发酵处理烟草，在实际生产中易于实现，有较好的应用前景^[6,32]。为了对有机酸协同酿酒酵母发酵进行更全面的评价，后期将对处理后的上部烟叶进行感官评吸。此外，这一协同发酵对改善上部烟叶品质的机理仍不明晰，后续可深入研究柠檬酸和苹果酸对酿酒酵母生长及代谢产物的影响，或是考察其他种类的有机酸是否有类似效果。

4.   结论

酿酒酵母发酵可以使上部烟叶化学成分趋于协调，并增加其香气成分含量；添加柠檬酸或苹果酸均能提升酿酒酵母的发酵效果，尤以苹果酸为佳。