基于功效成分−药效评价的三七新型饮片质量分析
Quality Analysis of Panax notoginseng New-type Decoction Pieces Based on Functional Ingredients-pharmacodynamic Evaluation
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由茄链格孢菌(Alternaria solani Sorauer)侵染所致的早疫病(early blight)是番茄的重要病害之一[1-3]，其典型病症是在叶片上造成黑斑，黑斑上带有同心圆状的轮纹[4]。该病害普遍发生于番茄的整个生长发育期，严重时造成落叶、落果和断枝，减产35%~80%[5-8]。目前仍以加强田间管理和喷施杀菌剂为主要防治手段[9]，且喷施杀菌剂是在病害发生后最快速、有效的解决方式[10]。
啶菌噁唑(pyrisoxazole，SYP-Z048)是中国沈阳化工研究院开发的新型甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)杀菌剂[11]，其作用位点是C14-脱甲基化酶，通过抑制该酶的活性而抑制细胞膜中甾醇的生物合成[12]，对茄链格孢菌(A. solani)[11]、灰霉病菌(Botrytis cinerea)[13-14]、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)[15]、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)[16]、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)[17]和辣椒炭疽病菌(Colletotrichum scoville)[18]等的生长均具有强烈的抑制作用。DMIs杀菌剂是易产生抗药性的杀菌剂之一，存在中度抗性风险[12]，长期频繁使用会使该类药剂的药效下降，出现抗药性问题，因此，需应加强该杀菌剂的抗药性检测及抗性风险评估，以便于制订抗药性治理策略，延缓抗药性发展。
抗性菌株的适合度是评价其抗性风险的重要参数[19]，代表其生存能力。CHEN等[16]通过诱导获得桃褐腐病菌抗啶菌噁唑菌株，发现该菌株对啶菌噁唑的抗性可稳定遗传，但适合度下降，如生长速率减慢、产孢量下降和致病性降低。何磊鸣[20]检测了2017—2019年灰霉病菌对啶菌噁唑的敏感性，认为啶菌噁唑对山东地区的灰霉病菌仍有很强的抑制作用，但也检测到一些敏感性下降的菌株；这些不敏感菌株的产孢量和菌核量增多，但生长速率和致病性没有发生变化。可见，不同病原菌对啶菌噁唑产生抗性后，适合度的变化并不一致。2019年，在山西省忻州市分离检测到4株对啶菌噁唑存在一定抗性的菌株。目前，只有番茄早疫病菌对啶菌噁唑敏感性的报道[11]，还未见抗性菌株适合度的研究。本研究以2019年检测出的抗性菌株为材料，通过探讨抗性菌株的适合度变化(遗传稳定性、生长速率、产孢量、孢子萌发率、孢子竞争力、产毒量及致病性)评估其抗性风险，为啶菌噁唑的科学使用和防治番茄早疫病用药策略的制订提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试菌株：番茄早疫病菌敏感菌株W-11由山西农业大学农药实验室提供；XW-1、XW-2、XW-3和XW-4菌株于2019年从山西省忻州市番茄设施大棚中患有番茄早疫病的叶片上分离得到，现保藏于忻州师范学院微生物实验室。
供试药剂：91.2%啶菌噁唑(pyrisoxazole)原药(沈阳化工研究院有限公司生产)。
供试马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：将马铃薯200 g切块、煮熟，过滤、去渣后留滤液，依次加入葡萄糖20 g和琼脂粉20 g，煮沸，定容至1 L备用；供试马铃薯葡萄糖培养液(PD)：按照上述PDA配制方法制备，但不加琼脂粉；供试马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)：将马铃薯20 g和胡萝卜20 g切块、煮熟，过滤后留滤液，随后加入琼脂粉20 g，煮沸，定容至1 L备用。
供试仪器：HD-29型净化操作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；SPX-150B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2 抗性菌株对啶菌噁唑的敏感性及抗性水平测定
取啶菌噁唑10.964 9 mg溶于10 mL丙酮溶液中，配成10 000 mg/L的母液；然后用丙酮将母液分别稀释成5 000、1 000、500和100 mg/L的啶菌噁唑溶液；将不同质量浓度的啶菌噁唑溶液与PDA按照体积比1∶1 000混匀，并倒入无菌培养皿中，最终制成质量浓度分别为10.0、5.0、1.0、0.5和0.1 mg/L的含药平板。将供试菌株在PDA上活化，25 ℃黑暗培养4 d，在菌落边缘近1/3处用无菌打孔器制备直径为5 mm的菌饼；将菌饼接种在含药平板中心，每皿1块。以加入相同体积丙酮的PDA平板为对照。每个菌株、每药剂质量浓度重复3次。
25 ℃黑暗培养5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算各质量浓度对菌丝生长的抑制率：抑制率＝[(对照菌落直径−药剂处理菌落直径)/(对照菌落直径−菌饼直径)]×100%。采用DPS软件处理数据，求出毒力回归方程和EC50值；番茄早疫病菌对啶菌噁唑的敏感基线为0.56 mg/L[11]，根据公式计算菌株的抗性倍数(A)：A＝抗性菌株EC50/敏感基线，当A<5时为敏感类型，5≤A<20时为低抗类型，20≤A<100时为中抗类型，A≥100时为高抗类型[10]。
1.3 抗性菌株的遗传稳定性测定
将抗性菌株在PDA上连续继代培养20代。采用1.2节的方法，分别测定第1、5、10、15和20代抗性菌株对啶菌噁唑的敏感性，计算抗性倍数和敏感性变化倍数：敏感性变化倍数=第n代抗性倍数/原代抗性倍数。
1.4 抗性菌株的生长速率测定
将敏感菌株与抗性菌株的5 mm菌饼接种于PDA平板上，25 ℃黑暗培养，于第1、2、3和4天时测量菌落直径，计算菌株的生长速率。每株菌重复3次。
1.5 抗性菌株的产孢量和孢子萌发率测定
将敏感菌株与抗性菌株的5 mm菌饼接种于PCA平板上，置于34 W冷白荧光灯下40 cm处，22 ℃黑暗(16 h)/冷白荧光(8 h)条件下培养7 d，取出皿内培养物置于三角瓶中，加入无菌水50 mL，充分振荡洗下孢子，经4层纱布过滤后留滤液，采用血球计数法测定滤液中的孢子数(个/mL)。每株菌重复3次。
将滤液稀释至1×105 个/mL。取100 μL滴于凹玻片中央，25 ℃保湿培养8 h，显微镜下观察不低于300个孢子的萌发情况，计算孢子萌发率：孢子萌发率=孢子萌发数/观察总数×100%。每株菌重复3次。
1.6 抗性菌株的孢子竞争力测定
参照任璐等[21]的方法将敏感菌株与抗性菌株的孢子液按照体积比1∶1配置成不同的组合：C1为W-11+XW-1，C2为W-11+XW-2，C3为W-11+XW-3，C4为W-11+XW-4。用毛笔将孢子混合液涂抹于经过表面消毒的番茄叶片，25 ℃保湿培养，待发病后用1 cm打孔器将病斑部位打下，并悬浮于5 mg/L啶菌噁唑中继续培养，记录病斑数量并观察其是否扩大，每个处理检测病斑数50个。根据公式计算抗性菌株频率：抗性菌株频率=病斑扩大数量/病斑总数×100%。
1.7 抗性菌株的致病性测定
采用SCHERPERS等[22]的方法。用含0.2%吐温-80的无菌水将啶菌噁唑母液稀释成5 mg/L的溶液，将番茄的健康叶片进行表面消毒，浸入5 mg/L啶菌噁唑药液中10 s，晾干，以浸入无菌水为对照；将番茄叶片制成直径为3 cm的叶盘，将1.5节中制备的滤液孢子数稀释至1×104 个/mL，均匀喷洒在叶盘表面，放入有湿滤纸的空皿中，每皿2片叶盘，每菌株3皿。25 ℃培养5 d，用透明坐标纸统计叶盘的发病面积以评价其致病性强弱。试验重复2次。
1.8 抗性菌株的产毒量测定
将敏感菌株与抗性菌株的5 mm菌饼分别接种于200 mL PD中，每株菌、每瓶培养液接种10块菌饼，于25 ℃ 160 r/min振荡培养20 d。过滤培养液并去除菌丝，3 000 r/min离心15 min取上清液，灭菌，即为粗毒素。分别用体积分数为0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%、25.0%、50.0%和100.0%的粗毒素浸泡30粒番茄种子24 h，25 ℃黑暗培养5 d后测定种子萌发数，以无菌水浸泡种子为对照，计算种子萌发抑制率：种子萌发抑制率=(1−毒素处理种子萌发数/对照种子萌发数)×100%。采用DPS软件，以种子萌发抑制率为y值，粗毒素体积分数l g值为x值，求出萌发抑制中浓度，通过分析萌发抑制中浓度比较菌株的产毒量。试验重复3次。
1.9 统计分析
数据均由DPS 6.0和Excel 2010分析，显著性差异采用Duncan氏新复极差法分析。
2. 结果与分析
2.1 抗性菌株对啶菌噁唑的敏感性及抗性水平
由表1可知：啶菌噁唑对W-11菌株的EC50值为0.51 mg/L，抗性倍数为0.91，故将其分为敏感类型。啶菌噁唑对XW-1、XW-2、XW-3和XW-4的EC50值分别为7.73、12.08、12.00和11.52 mg/L，抗性倍数分别为13.80、21.57、21.43和20.57，可见，XW-1菌株属于低抗类型，XW-2、XW-3和XW-4菌株为中抗类型。
表 1 抗性菌株对啶菌噁唑的敏感性Table 1. Sensitivity of pyrisoxazole-resistant isolates菌株
isolate毒力回归方程
regression equation相关系数
r 2EC50/
(mg·L−1)抗性倍数
resistance ratio抗性水平
resistance levelW-11 y=5.25+0.86x 1.00 0.51 0.91 敏感 sensitive XW-1 y=4.12+0.99x 1.00 7.73 13.80 低抗 low resistant XW-2 y=3.97+0.95x 1.00 12.08 21.57 中抗 moderately resistant XW-3 y=4.05+0.88x 0.99 12.00 21.43 中抗 moderately resistant XW-4 y=4.16+0.79x 0.99 11.52 20.57 中抗 moderately resistant 2.2 抗性菌株的遗传稳定性
由表2可知：在无药培养基上随着培养代数的增加，抗性菌株的EC50变化不大，且各菌株的敏感性变化倍数均大于0.95。第0、10和20代低抗菌株XW-1的抗性倍数分别为13.80、14.27和13.66，在20代时菌株仍处于低抗水平，抗性倍数未发生较大变化；同样，中抗菌株XW-2、XW-3和XW-4在第20代后抗性倍数仍处于中抗水平。可见，抗性菌株对啶菌噁唑的抗性可稳定遗传。
表 2 抗性菌株对啶菌噁唑抗性的遗传稳定性Table 2. Stability of resistance of pyrisoxazole-resistant isolates菌株
isolateEC50/(mg·L−1) 抗性倍数 resistance ratio 敏感性变化倍数 ratio of sensitivity change G0 G1 G5 G10 G15 G20 G10 G20 G10 G20 XW-1 7.73 7.03 6.85 7.99 7.94 7.65 14.27 13.66 1.03 0.99 XW-2 12.08 11.97 12.58 12.15 12.30 11.89 21.70 21.23 1.01 0.98 XW-3 12.00 11.72 12.52 11.62 11.29 11.51 20.75 20.55 0.97 0.96 XW-4 11.52 11.98 11.15 12.08 12.21 11.71 21.57 20.91 1.05 1.02 注：G0、G1、G5、G10、G15和G20分别为继代培养第0、1、5、10、15和20代。
Note: G0, G1, G5, G10, G15 and G20 indicates subculture on the 0, 1st, 5th, 10th, 15th and 20th generation, respectively.2.3 抗性菌株的生长速率
由图1可知：不同菌株的菌丝生长速率有所差异，敏感菌株W-11的生长速率最快，抗性菌株XW-1、XW-2、XW-3和XW-4的生长速率显著慢于W-11 (P<0.05)。各菌株第4天的生长速率与对应EC50值的线性相关分析(图2)可知：相关系数r=0.9063，r0.054 (0.8743)<r<r0.014 (0.9373)，在0.05水平上显著，说明菌丝生长速率与其EC50值呈显著负相关，即：菌株EC50值越大，对啶菌噁唑的抗性越强，生长速率越慢。
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图 1 抗药菌株与敏感菌株菌落生长速率注：不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平下差异显著。Figure 1. Growth rates of pyrisoxazole-resistant and sensitive isolatesNote: Different letters indicate significant difference at P<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.![]()
图 2 菌丝生长速率和菌株EC50的相关性Figure 2. Linear correlation between EC50 values and growth rates2.4 抗性菌株的产孢量和孢子萌发率
由表3可知：敏感菌株W-11的产孢量显著低于抗性菌株的产孢量 (P<0.05)，但它们之间的孢子萌发率无显著差异(P>0.05)，表明抗性菌株的产孢量虽有所增多，但孢子萌发率未发生变化。
表 3 抗性菌株的产孢量、孢子萌发率、致病性及产毒量Table 3. Sporulation, germination rate, pathogenicity, and toxin production of pyrisoxazole-resistant isolates菌株
isolate产孢量×106/
(个·L−1)
sporulation萌发率/%
germination rate致病面积/mm2 pathogenicity area 种子萌发抑制中浓度/%
EC50 of inhibited germination无药处理
no pyrisoxazole treatment啶菌噁唑处理
pyrisoxazole treatmentW-11 1.70±0.60 b 65.91±3.31 a 4.60±0.44 a 0.85±0.10 c 4.89±0.88 d XW-1 2.73±0.27 a 64.84±2.65 a 3.98±0.31 b 2.35±0.42 b 14.36±2.53 c XW-2 2.94±0.51 a 64.55±2.94 a 3.65±0.50 bc 3.19±0.49 a 23.22±2.17 a XW-3 2.91±0.77 a 62.70±1.65 a 3.58±0.45 c 3.27±0.45 a 19.47±1.56 b XW-4 2.99±0.48 a 62.17±7.90 a 3.31±0.57 c 3.31±0.45 a 16.90±1.85 bc 注：同列中不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平下差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at P<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.2.5 抗性菌株的孢子竞争力
由图3可知：在C1~C4组合中，敏感菌株侵染所致的病斑频率均高于抗性菌株的病斑。在组合C1中抗性菌株的竞争力最大，达到40.00%；在组合C3中抗性菌株的竞争力最小，为26.00%。说明抗性菌株孢子的竞争力比敏感菌株弱。
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图 3 抗、感菌株孢子的竞争力注/Note: C1. W-11+XW-1; C2. W-11+XW-2; C3. W-11+XW-3; C4. W-11+XW-4.Figure 3. Spore competitiveness between pyrisoxazole-resistant isolate and sensitive isolate2.6 抗性菌株的致病性
由表3还可知：敏感菌株W-11的发病面积为4.60 mm2，显著大于抗性菌株的发病面积 (P<0.05)；在经过啶菌噁唑处理后，敏感菌株W-11的发病面积仅为0.85 mm2，显著小于抗性菌株的发病面积(P<0.05)。可见，在无药剂压力下抗性菌株的致病性显著降低，但当环境中存在啶菌噁唑时则有利于抗性菌株的侵染。
2.7 抗性菌株的产毒量
由表3可知：敏感菌株W-11所产毒素的种子萌发抑制中浓度为4.89%，抗性菌株所产毒素的种子萌发抑制中浓度介于14.36%~23.22%，显著高于敏感菌株(P<0.05)，表明抗性菌株的产毒量均有所下降。
3. 讨论
在植物病害防治中，对杀菌剂进行抗性风险评估有助于针对不同的抗性风险制订杀菌剂施用策略，以延缓抗药性的发生和发展，延长杀菌剂的使用寿命[22]。在抗性风险评估中，抗性菌株的适合度指标是重要的参数，如遗传稳定性、致病性和竞争力等[19]。当对杀菌剂产生抗性后，病原菌的适合度变化最终会通过群体在田间的反应有所体现。因此，评估适合度对预测未来整个抗性群体的行为和控制病害具有决定性作用[23]。本研究从田间获得的野生抗性菌株对啶菌噁唑处于低抗至中抗水平，且这种抗性可稳定遗传，但这些抗性菌株的抗性越强，生长速率越慢，与CHEN等[16]的报道结果相符。抗性菌株在孢子萌发率不变的情况下，加大了产孢量，说明抗性菌株产生的活性孢子量增多，这可能是其在自然环境中生存的适应性进化，或许也是抗性菌株在环境中较易被检测的原因。然而，这些有活性的孢子竞争力和产毒量均下降，致病性降低，但在啶菌噁唑压力下其致病性强于敏感菌株，可推测当番茄早疫病菌对啶菌噁唑产生抗性后，抗性虽可稳定遗传，但除产孢量和孢子萌发率外，其他适合度指标均下降，生存能力和寄生能力也下降，在与敏感群体的生存竞争中可能会处于劣势；但为了能在竞争中存活，抗性菌株增大产孢量，繁殖能力增强，以期通过数量优势获取更多的生存机会，且当环境中存在啶菌噁唑时，抗性菌株可借助药剂对敏感群体的压制进而壮大抗性菌群。后续还需加强田间抗性监测，进一步深入探究番茄早疫病菌对啶菌噁唑的抗性机制，为延缓啶菌噁唑抗性的发展奠定基础。
4. 结论
番茄早疫病菌在对啶菌噁唑产生抗性后，抗性可稳定遗传，虽然繁殖能力增强，但是孢子的竞争力变弱，菌株用于致病的毒素产量也下降，致病力变弱；当环境中存在啶菌噁唑压力时，其致病力强于敏感菌株。
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图 1 对照品溶液(a)和三七样品提取物(b)的HPLC色谱图
注：1. 三七皂苷R1；2. 人参皂苷Rg1；3. 人参皂苷Re；4. 人参皂苷Rb1；5. 人参皂苷Rd。
Figure 1. HPLC chromatograms of reference solution (a) and Panax notoginseng sample extract (b)
Note: 1. Panax notoginsenoside R1; 2. ginsenoside Rg1; 3. ginsenoside Re; 4. ginsenoside Rb1; 5. ginsenoside Rd.
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图 2 不同三七饮片的抗凝活性
注：APPT. 部分凝血酶时间，PT. 凝血酶原时间，TT. 凝血酶时间；CK. 空白组，HS. 肝素钠组(阳性对照)，AP. 热风干燥粉组，FP. 冻干三七粉组，QP. 鲜三七快干粉组；不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。各试剂盒参照区间不同，肝素钠在APTT中选用剂量为0.05 mg/mL，在PT和TT中选用剂量为1.00 mg/mL。
Figure 2. Anticoagulant activity of different P. notoginseng pieces
Note: APPT. activated partial thrombin time, PT. prothrombin time, TT. thrombin time; CK. blank group, HS. heparin sodium group (positive control), AP. hot air-dried powder group, FP. freeze-dried P. notoginseng powder group, QP. fresh P. notoginseng quick-dried powder group; different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); the same as below. The reference interval of each kit is different, so the dose of heparin sodium in APTT is 0.05 mg/mL, and in PT and TT is 1.00 mg/mL.
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图 3 不同三七饮片的抗炎活性
注：APS. 阿司匹林组(阳性对照)。
Figure 3. Anti-inflammatory activity of different P. notoginseng pieces
Note: APS. aspirin group (positive control).
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图 4 不同三七饮片的镇痛活性
注：RD. 罗通定组(阳性对照)；下同。
Figure 4. Analgesic activity of different P. notoginseng pieces
Note: RD. rotonding group (positive control); the same as below.
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图 5 不同三七饮片的止血活性
注：VK. 维生素K组(阳性对照)。
Figure 5. Hemostatic activity of different P. notoginseng pieces
Note: VK. vitamin K group (positive control).
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图 6 三七总多糖 (TPo) 与总蛋白 (TPr) 的抗凝活性
注：各试剂盒参照区间不同，TPo与TPr选用不同剂量。
Figure 6. Anticoagulant activity of P. notoginseng total polysaccharides (TPo) and total protein (TPr)
Note: The reference interval of each kit is different, and different dose groups are selected for TPo and TPr.
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图 7 三七总多糖 (TPo) 与总蛋白 (TPr) 的镇痛活性
Figure 7. Analgesic activity of P. notoginseng total polysaccharide (TPo) and total protein (TPr)
表 1 3种饮片单体皂苷的含量
Table 1 Content of three kinds of single saponins in decoction pieces
% 处理
treatmentR1 Rg1 Re Rb1 Rd R1+Rg1+Re+Rb1+Rd AP 1.34±0.01 a 3.98±0.01 bc 0.45±0.08 a 3.12±0.02 c 0.68±0.05 bc 9.57±0.04 bc FP 1.19±0.02 bc 4.63±0.07 a 0.46±0.09 a 3.50±0.05 a 0.75±0.03 a 10.53±0.15 a QP 1.20±0.01 b 4.14±0.09 b 0.40±0.04 a 3.26±0.05 b 0.75±0.11 b 9.76±0.13 b 注：AP. 热风干燥粉，FP. 冻干三七粉，QP. 鲜三七快干粉；同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下同。
Note: AP. hot air-dried powder, FP. freeze-dried Panax notoginseng powder, QP. fresh P. notoginseng quick dried powder; different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05); the same as below.
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表 2 3种饮片的非皂苷成分含量
Table 2 Contents of non-saponin components in three decoction pieces
mg/g 处理
treatment总多糖
total polysaccharides总黄酮
total flavonoids总酚
total phenols总蛋白
total proteinAP 8.52±0.16 c 1.29±0.01 a 0.75±0.07 b 40.83±1.64 b FP 12.76±0.80 b 1.18±0.03 b 0.74±0.03 b 50.16±1.64 a QP 32.24±2.44 a 1.32±0.02 a 0.97±0.01 a 42.58±0.82 b
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表 3 不同三七饮片化学成分和抗凝血、镇痛活性的相关性分析
Table 3 Correlation analysis of chemical components and anticoagulant and analgesic activities of different P. notoginseng pieces
指标
indexR1 Rg1 Re Rb1 Rd 5种皂苷总量
sum of five saponins总多糖
total
polysaccharides总黄酮
total flavonoids总酚
total phenols总蛋白
total proteinAPTT −0.808 0.249 −0.795 0.344 0.872 0.188 0.937 0.203 0.846 0.177 PT −0.789 1.000** 0.365 0.997* 0.710 0.996 −0.077 −0.886 −0.281 0.995 TT 0.318 0.356 0.999* 0.262 −0.429 0.415 −0.966 −0.731 −0.999* 0.424 扭体次数
number of twists0.589 0.058 0.942 −0.041 −0.681 0.121 −0.999* −0.492 −0.968 0.131 潜伏时间
latency time−0.762 1.000** 0.404 0.993 0.680 0.999* −0.120 −0.905 −0.321 0.998* 注：APPT. 部分凝血酶时间，PT. 凝血酶原时间，TT. 凝血酶时间；“*”和“**”分别表示在0.05和0.01水平上相关。
Note: APPT. activated partial thrombin time, PT. prothrombin time, TT. thrombin time; “*” and “**” indicate correlation at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.
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