喷施外源EBR和H2O2对烤烟幼苗抗低温胁迫的影响
Effect of Spraying Exogenous EBR and H2O2 on the Resistance of Tobacco Seedlings to Low Temperature Stress
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杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)树种的统称，因其生长快、适应性强、用途广而被世界许多国家和地区广泛栽培和利用，是当今世界中纬度地区栽培面积最广、木材产量最多的树种之一[1-3]。中国具有丰富的杨树种质资源，占世界杨树种类的50%以上，其中白杨派和青杨派中的许多树种均为中国所特有，且分布非常广泛[4-6]。毛白杨(P. tomentosa)属白杨派(Section Leuce)，为中国优良的速生树种之一，以材质好、生长快、冠形优美等特点而为人们所喜爱，是优良的庭园绿化和行道树种，但硬枝扦插不易成活，限制了其栽培利用[7-8]。滇杨(P. yunnanensis)为青杨派(Section Tacamahaca)树种，主要分布于云南省中部、北部和南部，贵州省西部及四川省西南部等地区中海拔范围1 300~3 200 m间的山地，具有分布海拔梯度变化大，适应性强，生长迅速，扦插易于生根等优良特性，是典型而稀有的低纬度高海拔南方型杨属树种，可用于插杆造林[9-11]。
本试验以扦插难以生根的毛白杨和扦插易于生根的滇杨为试材，比较二者插穗生根过程中内源激素生长素(indole-3-acetic acid, IAA)、玉米素(zeatin, ZT)、赤霉素(gibberellin, GA3)和脱落酸(abscisic acid, ABA)的动态变化，探讨该4种内源激素对2种杨树生根难易程度的影响，为揭示毛白杨扦插不易生根的内部机制奠定研究基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以前期收集并繁殖保存的滇杨和毛白杨3株优树为母体，剪取截干后1年生长势与粗度相近的滇杨与毛白杨萌生枝用于制作插穗，插穗长度为30 cm，上部保留2~3颗饱满侧芽。参照随机区组试验设计方法，每小区1个基因型，10株小区，按株行距30 cm×40 cm扦插于不添加任何肥料的苗床上，扦插深度约15 cm。树种间各小区相互交错排列。以扦插第0 天为起始，每隔7 d取样1次，至第49天，共取样8次。每次随机选取滇杨和毛白杨3个基因型各1根插穗切取基部皮层提取内源激素，共计3个生物学重复。
1.2 样品处理
采集的插穗样品用清水冲洗干净沙土，再经蒸馏水冲洗，砂布擦干表面水分。用手术刀切取插穗土面以下2 cm至插穗基部端口以上2 cm之间的所有树皮。若插穗已萌生不定根，则去除不定根。液氮充分研磨，−80 ℃保存备用。
1.3 内源激素的提取与检测
参照李佳蔓等[12]的方法提取IAA、ABA、GA3和ZT。提取IAA、ABA和GA3的方法为：称取样品粉末约1.0 g，加入10 mL甲醇4 ℃静置18 h，过滤甲醇冲洗样品，并合并滤液；加入等体积的石油醚分液，萃取2次(弃醚相)，45 ℃减压蒸干；加NaHCO3 (pH 8.5)溶解，用H3PO4调pH至2~3，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并酯相，45 ℃旋转蒸干，1 mL 甲醇定容，0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤，作为供试液保存于4 ℃冰箱。提取ZT的方法为：用提取IAA、ABA和GA3相同的方法处理样品，调节pH至2~3，Sep-Pak C18小柱分离纯化，依次以纯水、50%甲醇、100%甲醇洗脱，收集50%甲醇洗脱液，45 ℃旋转蒸干；1 mL 甲醇定容，0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤，作为供试液保存于4 ℃冰箱。
于Agilent 1200 Series高效液相色谱仪上采用外标峰面积法进行4种内源激素的定量检测，试验条件为柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL，检测波长：GA3，210 nm；IAA和ABA，254 nm；ZT，280 nm。
1.4 数据分析
对滇杨和毛白杨插穗基部皮层内4种内源激素的含量测定值分别进行统计分析，比较滇杨和毛白杨4种内源激素含量的变化。所得数据用Excel 2003进行整理，采用SPSS 13.0进行数据分析，应用Origin 8.5软件进行相关图形的绘制。
2. 结果与分析
2.1 滇杨与毛白杨插穗基部生根观测
根据对取样时挖取的插穗基部观测表明：扦插第7天，滇杨插穗开始出现愈伤组织，并在21 d观测到不定根的出现，而毛白杨在21 d出现愈伤组织，但直到49 d都没有形成不定根(图1)。
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图 1 滇杨和毛白杨的愈伤组织及不定根注：a)和b)分别表示扦插第7天和21天的滇杨；c)表示扦插第21天的毛白杨。Figure 1. The adventitious root and callus of P. yunnanensis and P. tomentosaNote: a) and b) were P. yunnanensis at 7 d and 21 d, and c) was P. tomentosa at 21 d.2.2 滇杨与毛白杨插穗基部内源激素含量分析
于49 d观测期内，滇杨IAA含量略高于毛白杨，但差异均不显著，且2种杨树均于7 d (滇杨出现愈伤组织)时具有较高IAA含量[滇杨插穗为219.55 μg/g (FW)，毛白杨插穗为200.26 μg/g(FW)]，而21 d时(滇杨不定根形成，毛白杨产生愈伤) IAA含量均较低。前5个观测期内(0、7、14、21和28 d)，滇杨的ZT含量较高，与毛白杨差异仅于0 d时达显著水平，而后3个观测期(35、42和49 d)，毛白杨的ZT含量略高，但差异不显著。毛白杨ABA含量和GA3含量于整个观测期内均高于滇杨，其中，毛白杨ABA含量在第0、21、28和49天时显著或极显著高于滇杨，而毛白杨GA3含量于第7~35天共5个时期显著或极显著高于滇杨(图2)。
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图 2 滇杨和毛白杨插穗内源激素含量的动态变化注：*表示差异显著， **表示差异极显著；下同。Figure 2. Dynamic changes of endogenous hormones contents in cuttings of P. tomentosa and P. yunnanensisNote: * stands for the significant difference, and ** stands for the very significant difference; the same as below.2.3 滇杨和毛白内源激素含量比值分析
由图3所示：以滇杨为参照，毛白杨的IAA/ZT于0、7 、28和35 d时较高，其余观测期较低，但差异均不显著。IAA/ABA、ZT/ABA、IAA/GA3和ZT/GA3比值在整个观测期内均低于滇杨，其中，2种杨树的IAA/ABA和ZT/ABA比值差异于0和14 d时达极显著水平，而IAA/GA3和ZT/GA3比值于0、7、14和28 d时差异显著。毛白杨插穗基部的ABA/GA3结果在观测期内均高于滇杨，但差异不显著。
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图 3 滇杨和毛白杨插穗内源激素含量比值的动态变化Figure 3. Dynamic changes of endogenous hormones ratios in cuttings of P. tomentosa and P. yunnanensis3. 讨论
根是植物长期进化过程中形成的适应陆生生活的重要器官之一，主要分为3种，主根源于种子中的胚根，侧根为主根发育出的分支，这2种根均属于直根系，而不定根属须根系，通常在某种环境胁迫下，由地上部分的器官(如茎)发生而成[13]。在林木无性繁殖过程中，扦插技术难易程度直接取决于不定根是否发生。不定根的形成由环境和内源激素相互作用、共同调控[14]。许多研究认为IAA是调节不定根发生和发育的主要内源激素，而其他内源激素主要通过与生长素的互作调节而起作用[15]。本研究结果显示：滇杨与毛白杨插穗基部皮层中，滇杨的IAA和ZT含量较高，但2个树种之间的差异并不显著，而毛白杨插穗基部皮层的ABA和GA3则在整个观测期内含量较高，表明IAA或ZT含量的高低并不是影响毛白杨扦插难生根的主要因素，而高浓度的ABA和GA3可能抑制了毛白杨插穗不定根的形成。
皮层内的IAA主要集中于细胞分裂活动旺盛的形成层区[16]，其局部富集有助于刺激不定根发生[17]，是不定根原基起始的必要条件，直到根原基形成后，生长素才会迅速转移至其他生长活跃的部位[18]。但也有许多研究表明IAA与植物生根难易没有直接关系[19-20]。董宁光[21]对杨树嫩茎生根研究表明：低浓度的细胞分裂素促进生根，高浓度则抑制生根。欧阳群芳等[15]对欧洲云杉生根过程中内源激素检测时发现：GA3和ZT含量的降低是促进插穗生根的重要原因，高含量是不定根形成的抑制剂。但长白松的扦插试验表明：在组织形成、不定根的产生过程中GA4含量增加[18]。关于ABA含量与生根关系也有不同的报道，ABA在白桦插穗根原基发生过程中大幅度下降[22]，是抑制生根的主要激素，但在鹅掌楸不定根形成前开始上升，促进了插穗的生根[23]。在白杨派树种生根过程，高浓度ABA在多数试验中均被证实起抑制作用[24-25]。由此可见，内源激素与生根的关系较为复杂，本研究无论是基于生根时间(滇杨于21 d时IAA和ZT含量低于14 d)，还是基于树种对比(IAA和ZT含量于滇杨和毛白杨中差异不显著)，均表明IAA和ZT与滇杨和毛白杨生根能力差异的关系不明显。同时，毛白杨于整个观测期内并没有形成不定根，而滇杨于21 d可观测到不定根，2种杨树的内源激素随时间的变化趋势相似，进一步表明ABA和GA3的高浓度富集才是抑制毛白杨生根的主要因素，这与杨树生根过程中内源激素变化研究的较多结果[26-28]相一致。
内源激素对植物生根过程的调节是十分精细和复杂的，一个简单的生理过程不仅需要单个激素的瞬时调控，更多的是多种激素的共同作用结果[29-31]，这些激素常以联合体的形式参与植株的生长发育进程[13, 32-33]。因此，杨树插穗生根过程中内源激素动态变化分析时，不仅考虑单个激素的富集与释放，也要考虑激素之间的动态平衡。陈雪梅等[24]认为：IAA/ABA的比值可以作为杨树插穗生根能力的标准，其比值越高，生根能力越强。本研究发现：滇杨插穗基部皮层内的IAA含量高于毛白杨，而ABA含量显著低于毛白杨。相应地，滇杨插穗基部皮层内的IAA/ABA比值显著高于毛白杨。由此可知：插穗基部皮层内高含量的ABA可能抑制了毛白杨插穗基部不定根的形成。此外，研究结果还显示：ABA与GA3协同作用抑制了毛白杨插穗不定根的形成，但二者之间如何维持平衡从而抑制毛白杨不定根的产生，有待于进一步深入研究。
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图 1 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗抗氧化酶活性的影响
注：T1和T5. EBR+低温，T2和T6. H2O2+低温，T3和T7. 蒸馏水+低温，T4和T8. 蒸馏水+常温；不同小写字母表示在0.05水平下显著(P<0.05)。
Figure 1. Effects of different exogenous substances on the antioxidant enzyme activities of two types of tobacco seedlings under low temperature stress
Note: T1 and T5. EBR+low temperature, T2 and T6. H2O2+low temperature, T3 and T7. distilled water+low temperature, T4 and T8. distilled water+normal temperature; different lowercase letters indicate significant at the 0.05 level (P<0.05).
表 1 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗农艺性状的影响
Table 1 Effects of different exogenous substances on the agronomic traits of two types of tobacco seedlings under low temperature stress
品种
variety处理
treatment最大叶长/cm
maximum leaf length最大叶宽/cm
maximum leaf width最大叶面积/cm2
maximum leaf areaK326 T1 17.17±0.53 b 8.83±0.23 a 96.16±3.89 b T2 16.80±0.67 b 8.87±0.63 a 94.46±5.17 b T3 14.75±0.64 c 7.38±0.48 b 69.01±4.95 c T4 20.43±0.72 a 10.03±1.33 a 130.08±18.93 a 湘烟7号
Xiangyan No.7T5 16.25±0.64 b 7.92±1.04 b 81.66±23.18 b T6 15.60±4.81 b 7.53±0.56 b 74.53±15.23 b T7 16.55±1.21 b 7.28±0.71 b 76.45±12.81 b T8 23.90±2.93 a 10.48±1.09 a 158.92±33.99 a 注：T1和T5. EBR+低温，T2和T6. H2O2+低温，T3和T7. 蒸馏水+低温，T4和T8. 蒸馏水+常温；同列不同小写字母表示在0.05水平下差异显著(P<0.05)；下同。
Note: T1 and T5. EBR+low temperature, T2 and T6. H2O2+low temperature, T3 and T7. distilled water+low temperature, T4 and T8. distilled water+normal temperature; in the same column, different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level (P<0.05); the same as below.
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表 2 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟幼苗生物量的影响
Table 2 Effects of different exogenous substances on the biomass of two types of tobacco seedlings under low temperature stress
品种
variety处理
treatment单株鲜质量/g
fresh weight of per plant单株干质量/g
dry weight of per plant根冠比
root-shoot ratio地上部
aboveground根
root地上部
aboveground根
rootK326 T1 7.04±0.04 b 1.06±0.01 b 0.40±0.01 b 0.07±0.00 b 0.18±0.03 ab T2 6.86±0.04 c 0.83±0.02 c 0.37±0.01 b 0.05±0.00 c 0.14±0.02 b T3 6.45±0.03 d 0.67±0.01 d 0.34±0.01 c 0.04±0.00 d 0.09±0.01 c T4 9.02±0.04 a 1.33±0.06 a 0.60±0.00 a 0.12±0.00 a 0.20±0.02 a 湘烟7号
Xiangyan No.7T5 6.93±0.05 b 1.07±0.03 b 0.37±0.02 b 0.07±0.00 b 0.19±0.02 a T6 6.58±0.09 b 0.97±0.01 c 0.34±0.02 c 0.06±0.00 c 0.18±0.03 ab T7 7.03±0.06 b 0.92±0.02 c 0.35±0.02 c 0.06±0.00 c 0.17±0.02 b T8 9.08±0.03 a 1.39±0.05 a 0.61±0.01 a 0.12±0.02 a 0.20±0.01 a
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表 3 不同外源物质对低温胁迫下2种烤烟渗透调节物质和丙二醛含量的影响
Table 3 Effect of different exogenous substances on the osmoregulatory substances and MDA content of two tobacco under low temperature stress
品种
variety处理
treatment可溶性蛋白含量/(mg·g−1)
soluble protein content可溶性糖含量/(mg·g−1)
soluble sugar content脯氨酸含量/(μg·g−1)
proline content丙二醛含量/(μmol·kg−1)
MDA contentK326 T1 0.15±0.01 a 46.91±2.22 a 30.56±4.01 a 1.26±0.14 b T2 0.15±0.02 a 40.86±1.06 b 33.69±3.15 a 1.05±0.11 c T3 0.13±0.01 b 26.51±2.99 d 24.87±0.45 b 1.84±0.12 a T4 0.14±0.01 b 33.45±2.70 c 25.10±1.69 b 1.73±0.14 a 湘烟7号
Xiangyan No.7T5 0.14±0.01 c 36.64±0.78 a 39.50±7.04 a 1.34±0.28 a T6 0.13±0.02 c 38.53±1.79 a 46.12±12.17 a 1.18±0.17 ab T7 0.15±0.01 b 36.79±2.63 a 47.95±14.29 a 1.26±0.31 a T8 0.17±0.01 a 30.33±0.79 b 26.62±8.07 b 1.01±0.13 b
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