浅色黄姑鱼Ⅰ型胶原蛋白α2 (COL1A2)基因的克隆及表达分析
通过克隆浅色黄姑鱼(Nibea coibor) Ⅰ型胶原蛋白α2 (COL1A2) 基因，分析其分子特征、组织分布及表达差异，为鱼类胶原蛋白代谢机制研究奠定理论基础。
通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术获得浅色黄姑鱼COL1A2基因全长序列，利用生物信息学分析方法对其进行系统分析，探讨其分子特征及组织表达谱。
COL1A2 cDNA序列长5 826 bp，编码1 352个氨基酸。BLAST 同源性比对和系统进化树分析表明：浅色黄姑鱼与大黄鱼(Larimichthys crocea)同属石首鱼科(Sciaenidae)，亲缘关系最近，且两者COL1A2的氨基酸序列同源性最高(96.60%)。生物信息学分析显示：COL1A2多肽链包含脊椎动物Ⅰ型胶原蛋白的所有特征，如相同的信号肽、C-前肽和N-前肽结构域以及三重螺旋结构域等。qRT-PCR结果显示：鱼鳔中COL1A2基因的表达显著高于其他组织(P<0.05)，且胶原蛋白在不同组织中的分布规律与其一致。
本研究首次克隆了浅色黄姑鱼COL1A2基因(GenBank登录号：MK641513)，该基因的组织表达特异性是引起胶原蛋白差异化沉积的原因之一。研究结果有助于深入探究胶原蛋白的生物合成途径及调控机制。
Cloning and mRNA Expression Analysis of Type Ⅰ Collagen Alpha 2 Gene from Chu’s Croaker (Nibea coibor)
This study cloned cDNA of COL1A2 gene from Niber coibor, analyzed the molecular characteristics, tissue distribution and expression of collagen, to lay a theoretical foundation for the study of collagen metabolism mechanism in fish.
The full-length sequence of COL1A2 gene of N. coibor was obtained through rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology, and then systematically analyzed using bioinformatics analysis method to explore its molecular characteristics and tissue expression.
The COL1A2 cDNA was 5 826 bp in full-length and encoded a polypeptide of 1 352 amino acids. BLAST homology comparison and phylogenetic tree analysis revealed that the N. coibor and Larimichthys crocea should belong to Sciaenidae, having the closest relatives, and the amino acid sequence homology of COL1A2 was the highest (96.60%). Bioinformatics analysis showed that COL1A2 contained all the characteristics of type I collagen in vertebrates identified, such as the same signal peptides, C-propeptide and N-propeptide domains, triple helix domains and so on. qRT-PCR results showed that the expression level of COL1A2 in the swim bladder of N. coibor was significantly higher than that in other tissues (P<0.05). It was consistent with the distribution pattern of collagen in different tissues.
The COL1A2 gene of N. coibor (GenBank accession number: MK641513) is cloned for the first time. The tissue expression specificity of this gene is one of the reasons for the differential depositon of collagen. The results of the study will help to further study the collagen biosynthetic pathway and regulation mechanism in N. coibor.
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Keywords:
- Nibea coibor /
- COL1A2 /
- cDNA cloning /
- mRNA expression /
- tissue distribution
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胶原蛋白是一簇具有三重螺旋结构、白色透明、无分支的原纤维细胞外基质蛋白，主要存在于脊椎动物的肉和结缔组织中，是与各组织、器官功能有关的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能[1]。胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，到组织分布和功能等，都具有显著的多样性[2]。截至目前，通过分子生物学和基因克隆等手段对不同类型的胶原蛋白进行克隆、分离和鉴定，已鉴定出28种新型胶原蛋白[3-4]。在胶原蛋白家族成员中，Ⅰ型胶原蛋白在脊椎动物中的分布最广泛，出现在从海绵到人类的各种组织中[3, 5-6]。已有研究从卡特拉鱼(Catla catla)、麦瑞加拉鲮鱼(Cirrhinus mrigala)[7]、红古鱼 (Sciaenops ocellatus )[8]和罗非鱼(Oreochromis sp.)[9]中分离并鉴定了不同类型的胶原蛋白。这表明胶原蛋白在所有多细胞动物中都是保守的。据研究报道：Ⅰ型胶原蛋白由2条α1和1条α2多肽链组成，分别由Ⅰ型胶原蛋白α1 (COL1A1)和Ⅰ型胶原蛋白α2 (COL1A2)基因编码[10]。许多硬骨鱼的Ⅰ型胶原蛋白前体α链基因也相继被报道，如虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[11]、斑马鱼(Danio rerio)[12]、斑鳐(Raja kenojei)[13]和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[10, 14]等。
浅色黄姑鱼(Nibea coibor)俗名白奈、金丝，隶属于鲈形目(Perciformes)石首鱼科(Sciaenidae)黄姑鱼属(Nibea)，该鱼具有较大的鱼鳔，且富含胶原蛋白的鱼鳔干制品(鱼胶)是加工价值较高的水产食用珍品，在市场上供不应求(目前优质白奈鱼胶市场价格为10 000~15 000元/kg)[15-18]。然而，关于浅色黄姑鱼胶原蛋白的研究鲜有报道。课题组前期研究发现：饲料中添加羟脯氨酸和脯氨酸可以上调COL1A1和COL1A2基因的表达，并促进浅色黄姑鱼鱼鳔中胶原蛋白沉积[19-20]，但对Ⅰ型胶原蛋白前体α链基因的分子结构及其调控机制缺乏深入探讨。本研究首次克隆了浅色黄姑鱼COL1A2 基因，分析其结构和功能，并对其鱼鳔等8个组织中胶原蛋白的分布及COL1A2 mRNA在不同组织中的表达谱进行了分析，以期为深入探讨胶原蛋白代谢的分子机制奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
2018年11月在汕头大学南澳试验站采集了6尾浅色黄姑鱼，进行组织样品(肝脏、肌肉、小肠、鱼鳔、鱼皮、鱼鳞、鳍条和脊柱)的采样，1份样品在液氮中速冻，存于−80 ℃，直至开展基因克隆及表达分析；另外1份样品存于−20 ℃，用于开展胶原蛋白含量的测定。
1.2 总RNA的提取和cDNA第1链的合成
根据Trizol (Invitrogen，USA)试剂说明书，使用氯仿—异丙醇法提取肌肉组织中的总RNA，通过1.2%琼脂糖凝胶分析确定其完整性和质量，利用Nanodrop®ND-2000分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop，USA)测定260 nm/280 nm处的吸光度，确定RNA的最终浓度。按照cDNA Synthesis Super-Mix Kit (Trans Gen，北京)说明书将总RNA反转录成cDNA，cDNA样本存储在−20 ℃用于qRT-PCR分析。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书(Clontech，USA)合成cDNA第1链，产物存于−20 ℃，用于cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆。
1.3 引物设计
根据NCBI上检索大黄鱼(Larimichthys crocea)、鳜鱼(Siniperca chuatsi)和鲈鱼(Micropterus salmoides)等的COL1A2 cDNA序列保守区，利用Primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft International，USA)设计目的基因的特异性引物(表1)。
表 1 COL1A2基因克隆及表达分析所需引物序列的信息Table 1. Primer sequence information used for the cDNA cloning and expression analysis of COL1A2用途
use基因名称
gene name引物编号
primer number引物序列 (5′→3′)
primer sequenceRACE-PCR COL1A2 R1-C1A2F GTCTTCAGGGATTCGTTGGT R1-C1A2R GGCGAGATGGTTTATTTGTTC R2-C1A2F GGATTCTGTTGCTGCTTGC R2-C1A2R AGGTCCCTGTTCTCCCTTCT R3-C1A2F GAGTTGTTGGTAATGCTGGTGA R3-C1A2R GTGTTGAGGGACTTGATGGTG 5′/3′RACE COL1A2 C1A2-51 CCCGATTGACATGATGCTAGGTATGAA C1A2-52 CCAACATTGCCGTCAGCACCAC C1A2-31 AGTCCCTCAACACTCAGATCGAGAACCT C1A2-32 GGCAACAGCCGCTTCACCTTCT qRT-PCR COL1A2 Q-COL1A2F CAAGAACAGCGTTGCCTACAT Q-COL1A2R ACGGAGAAGGTGAAGCGG β-actin β-actinF GGTTACTCCTTCACCACCACAG β-actinR TCCGTCGGGCAGCTCATA cDNA synthesis Oligo- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX RACE-PCR UPM (long) CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT UPM (short) CTAATACGACTCACTATAGGGC NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT PCR screening M13F GTAAAACGACGGCCAGT M13R ACAGGAAACAGCTATGAC 注：“X”代表专利SMARTer Oligo序列中未公开的碱基。
Note：“X” represents the undisclosed base in the proprietary SMARTer Oligo sequence.1.4 浅色黄姑鱼COL1A2基因核心片段克隆
根据引物序列及克隆策略，以浅色黄姑鱼肌肉的cDNA为模板，采用应用生物系统VeritiTM热循环仪(Thermo Fisher Scientific，USA)进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增目的基因DNA片段。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳中确认大小，切胶回收与预期片段大小相符的产物，操作步骤依据DNA切胶回收试剂盒说明书。将回收得到的DNA片段与pMD19-T 载体连接，操作步骤参照Takara pMD 19-T Vector Cloning Kit 说明书(Takara)，再转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆送至北京华大基因组研究所(深圳)测序，所得的cDNA序列在NCBI上进行BLAST同源性分析。
1.5 浅色黄姑鱼COL1A2基因cDNA末端快速扩增(RACE)
根据已有基因序列设计5′和3′ RACE反应的基因特异性引物(表1)，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)操作说明书制备5′ RACE-Ready cDNA和3′ RACE-Ready cDNA模板。RACE-PCR分为2轮PCR，第1轮为Touch-down PCR，第2轮为Nest PCR，具体扩增方法和体系按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (Takara)说明书进行。取PCR扩增产物5 μL用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带，将连接和转化后得到的阳性克隆送至北京华大基因组研究所 (深圳) 测序。
1.6 生物信息学分析
采用NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上的BLAST工具对克隆到的部分核心序列、3′ RACE序列和5′ RACE序列进行同源性比对；采用DNAman拼接序列并使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)预测全长序列的开放阅读框；采用Compute pI/Mw tool (http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)预测蛋白质序列等电点和分子量；采用PROTPARAM (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性质；采用PROTSCALE (http://web.expasy.org/protscale/)在线测定蛋白质的疏水性；采用PREDICT PROTEIN软件 (https://www.predictprotein.org/)在线预测蛋白质的二级结构；采用PROSITE在线软件(http://prosite.expasy.org/)预测蛋白的结构和功能域；采用ClustalX2 软件进行多序列比对，再用MEGA 4.0构建系统发育树。
1.7 不同组织中COL1A2基因的表达分析
根据已克隆的COL1A2 全长cDNA 序列设计1对qRT-PCR 特异引物，并以β-actin基因为内参(表1)。按照试剂盒说明书，采用实时荧光定量PCR仪(Roche Light Cycler® 480 System，瑞士)进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。使用ΔΔCt相对量化计算方法进行基因表达量分析，使用内参基因(β-actin)进行归一化处理，具体为：取3个样本，每个样本一式三份用于计算平均Ct，ΔCt= Ct目标基因− Ct内参基因；ΔΔCt=每个样本处理组ΔCt/控制组ΔCt (试验参考)；相对量化的表达式2−ΔΔCt表示为目标基因处理组与控制组的相对表达量。
1.8 不同组织中胶原蛋白含量的测定
由于羟脯氨酸几乎只存在于胶原蛋白中，且因胶原蛋白结构的特殊性，羟脯氨酸在胶原蛋白中的含量相对固定为12.5%，故常用羟脯氨酸的含量计算组织中胶原蛋白的含量。采用试剂盒(Art. No. A030-2，南京建成生物工程研究所，中国南京)对样品进行处理，操作方法参考制造商说明书；使用Infinite® Pro 200酶标仪(Tecan，瑞士)分析样品，测定波长550 nm处的吸光度。由标准品根据公式计算得到羟脯氨酸含量；胶原蛋白含量由羟脯氨酸含量乘以8估算得到[21]。
2. 结果与分析
2.1 COL1A2基因的cDNA和氨基酸序列
从浅色黄姑鱼中克隆到Ⅰ型胶原蛋白α2基因(COL1A2)，并提交至NCBI (GenBank登录号：MK641513)。COL1A2基因的cDNA全长5 826 bp，包括3′非翻译区1 657 bp，5′非翻译区113 bp和开放阅读框4 056 bp，共编码1 352个氨基酸。通过蛋白质结构和疏水性分析预测COL1A2基因蛋白质分子量为126.74 ku，等电点为9.24，其中带负电荷残基总数(Asp+Glu)为106，带正电残基总数(Arg+Lys)为121。计算得到脂质指数为39.70，亲水性的总体均值为−0.713，失稳指数为22.67，蛋白质稳定。
通过对蛋白质的结构域和功能预测，观察到COL1A2原纤维胶原蛋白N-前肽信号肽的裂解位点(1~24)、三重螺旋结构域(71~834)和NC1结构域(847~1 351)。还发现COL1A2蛋白含有24个氨基酸信号肽，位于M1~S24区域(MLSFVDTRILLLLAVTSYLASCQS)。此外，还预测了COL1A2蛋白三重螺旋结构域，在螺旋区观察到19个甘氨酸—脯氨酸—脯氨酸(GPP)重复位点、2个精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)细胞黏附位点和2个分子内部耦合点(GMKGHR，GMKGLR)，COL1A2多肽还在链内或链间形成7个位点的C-propeptide二硫化物键、1个糖基结合站点(NIT)和1个磷酸化(KRGP)位点。
2.2 COL1A2 氨基酸序列的多序列比对和进化树
由表2可知：浅色黄姑鱼COL1A2氨基酸序列具有较高的保守性，与其他鱼种之间的相似性均大于80%，且浅色黄姑鱼COL1A2的氨基酸序列与大黄鱼(Larimichthys crocea)的相似度最高，达到96.60%。多序列比对结果(图1)显示：浅色黄姑鱼COL1A2与大黄鱼(XP_027142672.1)相似度最高，与人类 Homo sapiens (NP_892013.2)相似度最低。进一步分析发现：整个原纤维胶原NC1结构域在所有物种中都具有较高的相似度，而COL1A2的肽链裂解位点存在一定的差异。
表 2 浅色黄姑鱼COL1A2多肽序列与其他鱼类的相似性Table 2. COL1A2 polypeptide sequence identity of Nibea coibor with other fishes种名
species name基因登录号
accession number
of gene相似度/%
identity种名
species name基因登录号
accession number
of gene相似度/%
identity大黄鱼 Larimichthys crocea XP_027142672.1 96.60 罗非鱼 Oreochromis niloticus NP_001269826.1 88.76 黑点青鳉 Oryzias melastigma XP_024154448.1 88.13 美妊丽鱼 Astatotilapia calliptera XP_026011889.1 88.47 半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis XP_008328838.1 90.32 半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis XP_008329548.1 89.13 高体鰤 Seriola dumerili XP_022602721.1 91.94 龟壳攀鲈 Anabas testudineus XP_026203436.1 91.42 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus ATI25517.1 92.09 眼斑海葵鱼 Amphiprion ocellaris XP_023133230.1 91.86 青鳉 Oryzias latipes XP_023815576.1 87.61 多刺棘光鳃鲷 Acanthochromis polyacanthus XP_022069293.1 91.57 电鳗 Electrophorus electricus XP_026867852.1 81.73 红树林鳉鱼 Kryptolebias marmoratus XP_017279795.1 88.09 弹涂鱼 Boleophthalmus pectinirostris XP_020795826.1 85.59 大刺鳅 Mastacembelus armatus XP_026155865.1 89.74 草鱼 Ctenopharyngodon idella ADK48763.1 82.17 花斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus XP_023200744.1 87.56 白鲢 Hypophthalmichthys molitrix AUF74474.1 82.10 虹鳟 Oncorhynchus mykiss NP_001117679.1 81.42 斑马鱼 Danio rerio NP_892013.2 81.21 大鳞大麻哈鱼 Oncorhynchus tshawytscha XP_024296660.1 81.36 银大麻哈鱼 Oncorhynchus kisutch XP_020360620.1 81.29 黑龙江大麻哈鱼 Oncorhynchus keta BAB79229.1 81.80 兰副双边鱼 Parambassis ranga XP_028284246.1 90.90 鲫鱼 Carassius auratus XP_026144583.1 82.69 底鳉 Fundulus heteroclitus XP_012707154.1 85.21 巴丁鱼 Pangasianodon hypophthalmus XP_026785766.1 82.10 贝尔湖红点鲑 Salvelinus alpinus XP_023991358.1 80.18 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus XP_022538957.1 82.32 ![]()
图 1 浅色黄姑鱼和其他物种的COL1A2氨基酸序列注：高、中和低的保守性氨基酸残基分别用黑色、红色和绿色阴影显示；黑色虚线代表间隔。Figure 1. Amino acid sequences of COL1A2 in Nibea coibor and other speciesNote: The high, medium and low conserved amino acid residues are shown in black, red and green shadows, respectively; the black dotted lines represent intervals.由图2可知：COL1A2进化树形成2个明显的分支，第1支主要是硬骨鱼类，包括草鱼(Ctenopharyngodon idella)、白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鲫鱼(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)、大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、浅色黄姑鱼(N. coibor)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)；第2支为高等脊椎动物类，包括原鸡(Gallus gallus)、小白鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、驴(Equus asinus)、野猪(Sus scrofa)、家犬(Canis lupus familiaris)、家猫(Felis catus)、家牛(Bos taurus)和人类(Homo sapiens)；两栖类动物非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis)处在2个分支之间，并被归为第2支。可见，浅色黄姑鱼与大黄鱼同属于石首鱼科，亲缘关系最近。
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图 2 浅色黄姑鱼和其他物种COL1A2蛋白质系统进化树注：数字表示1 000次引导迭代后进化树拓扑所呈现的频率。水平分支长度与每个位点的氨基酸取代率成正比，距离越短，进化关系越近；相反，进化关系越远。Figure 2. Phylogenetic tree of COL1A2 from N. coibor and other speciesNote: Numbers represent the frequencies with which the tree topology presented is replicated after 1 000 bootstrap iterations. The horizontal branch length is proportional to amino acid substitution rate per site, the shorter the distance, the closer the evolutionary relationship; conversely, the evolutionary relationship is the farther.2.3 浅色黄姑鱼COL1A2基因在不同组织中的表达
由图3可知：COL1A2基因在鱼鳔中的表达显著高于其他组织(P<0.05)，其次是脊柱、皮肤和鱼鳞，而肝脏和鳍条中的COL1A2表达量相对较低，小肠中COL1A2基因表达量最低，且显著低于除肝脏和鳍条外的其他组织(P<0.05)。
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图 3 COL1A2基因在浅色黄姑鱼不同组织中的表达分析注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。Figure 3. Expression analysis of COL1A2 gene in different tissues of N. coiborNote: Different lowercase letters indicate significant differences (P< 0.05).2.4 胶原蛋白组织分布的特异性
由表3可知：鱼鳔中的胶原蛋白含量最高，其次是脊柱、鱼鳞和皮肤，肝、肠、肌肉和鳍条中胶原蛋白含量相对较少，且各组织中的胶原蛋白含量均有显著差异(P<0.05)。
表 3 不同组织中羟脯氨酸和胶原蛋白的含量Table 3. Contents of hydroxyproline and collagen in different tissues of N. coiborg/kg 组织 tissue 羟脯氨酸 hydroxyproline 胶原蛋白 collagen 肌肉 muscle 1.42±0.02 b 11.35±0.15 c 鱼鳔 swim bladder 24.48±0.05 g 195.87±0.39 h 肝脏 liver 0.15±0.01 a 1.18±0.09 a 鱼鳞 scale 6.01±0.23 e 48.11±1.80 f 皮肤 skin 4.12±0.11 d 32.97±0.90 e 脊柱 spine 10.91±0.22 f 87.26±1.78 g 鳍条 fin 1.99±0.04 c 15.94±0.31 d 小肠 intestines 0.60±0.01 a 4.81±0.04 b 注：同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Note: In the same column, different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).3. 讨论
3.1 浅色黄姑鱼COL1A2基因序列
Ⅰ型胶原蛋白是脊椎动物细胞外基质的主要成分，且在各类胶原中含量最多，具有重要的生理和机械功能[5]。本研究成功克隆到浅色黄姑鱼COL1A2完整的cDNA序列，全长5 826 bp，包括5′非编码区113 bp、3′非编码区1 657 bp和开放阅读框4 056 bp，编码1 352个氨基酸，与YU等[10]对草鱼的研究结果相似。浅色黄姑鱼的COL1A2三重螺旋区拥有19个甘氨酸—脯氨酸—脯氨酸(Gly-Pro-Pro)重复肽，和已有研究结果类似，如海绵COL1A2三重螺旋区的Gly-Pro-Pro重复肽有11个[22]，海胆有12个[23]，草鱼有23个[10]。研究表明：重复肽对皮肤和肌肉胶原蛋白的稳定性具有重要作用，且被广泛认为是冷血动物的特征[24]。在三重螺旋结构域中还观察到2个交错耦合位点(GMKGHR和GMKGLR)以及2个精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)细胞黏附位点，这些交错耦合域是维持胶原纤维物理化学性质和结构稳定的必要结构[25]。Arg-Gly-Asp序列被认为是三螺旋结构域的潜在细胞结合位点[26-27]，在鳟鱼[11]、斑马鱼[28]和草鱼[10]中也均有发现，表明浅色黄姑鱼COL1A2蛋白具有与这些鱼相似的稳定性和细胞亲和力。此外，浅色黄姑鱼COL1A2的C-前肽区发现7个二硫化物残基(-cys-)。C-前肽参与细胞内形成胶原过程中的链选择和链缔合，在转运至细胞外基质的过程中可维持蛋白的可溶性，且-cys-主要参与形成跨链和链内的二硫桥，对维持胶原α链之间的相互作用具有重要意义[29]。浅色黄姑鱼COLlA2的C-前肽区还发现单一的天冬氨酸—异亮氨酸—苏氨酸(Asn-Ile-Thr)序列(952~955)。Asn-X-Thr具有潜在的碳水化合物附着功能，相似的结果在斑鳐中也有发现，其COL1A1蛋白序列的C-前肽区具有单一的三肽Asn-Ile-Thr序列(1364~1366)[18]。综上所述，浅色黄姑鱼COL1A2原纤维胶原蛋白具有和其他鱼类相同的信号肽、C-前肽/N-前肽结构域和三重螺旋结构域，表明其蛋白质功能是保守的。
胶原蛋白是一类具有相似特征的庞大家族，该家族所有成员共有的分子特征包括高度保守的C端非胶原(NC1)结构域以及约有1 000个氨基酸残基的Triple-helical结构域，且从无脊椎动物到脊椎动物，纤维胶原最保守的部分是NC1结构域[30-31]。本研究也证实了浅色黄姑鱼与其他脊椎动物pro-α2 ( Ⅰ ) 链的Triple-helical域和NC1结构域氨基酸序列高度同源。另外，对浅色黄姑鱼pro-α2 ( Ⅰ ) 链进行系统发育分析显示：COL1A2在所有脊椎动物中存在明显分离，新克隆到的COL1A2与硬骨鱼属于同一类群，并与大黄鱼形成1个单系类群，关系密切，印证了浅色黄姑鱼COL1A2氨基酸序列与大黄鱼最为相似(96.60%)，也印证了胶原蛋白具有保守的蛋白质功能。
3.2 COL1A2基因在不同组织中的差异表达与胶原蛋白组织分布特异性
本研究探讨了COL1A2基因在浅色黄姑鱼不同组织中的表达谱，发现浅色黄姑鱼COL1A2 基因在肌肉、鱼鳔、皮肤、鳞片、鳍条、肝脏、小肠和脊柱中均有表达，尤其在鱼鳔、脊柱和皮肤中的表达量显著高于其他5种组织。此结果与对斑马鱼[28]、草鱼[10]和金鱼[32]的研究结果一致，表明COL1A2在不同组织中广泛表达，尤其是在皮肤、鳃和鳍条中高表达。COL1A2基因的表达差异可能与不同组织中胶原蛋白的生物合成、羟基化程度以及胶原分子类型和交联有关[33-34]，如：骨胶原和结缔组织胶原分子存在很大差异，Ⅳ型胶原是骨胶原的主要成分；而在皮肤中，胶原纤维主要由Ⅰ型胶原(80%~85%)、Ⅲ型胶原(10%~15%)和少量Ⅴ型胶原组成[35]。不同类型的胶原由不同基因编码，胶原蛋白基因的功能还受到许多细胞因子的调控，这也可能是引起COL1A2基因在不同组织中差异表达的重要原因。
有研究报道胶原蛋白在动物组织中广泛分布，但其含量却存在有较大差异[6, 36]。胶原蛋白是实质性器官——基底膜的主要成分，在骨骼中超过80%的有机质是胶原蛋白，它在骨骼与结缔组织中发挥作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性[37-38]。在鱼鳔和皮肤等结缔组织中胶原蛋白的含量也非常高，如鱼鳔中胶原蛋白约占其湿质量的30%，占鱼鳔蛋白总量的70%以上[39]。胶原蛋白的三聚体有很高的抗拉强度，胶原的三螺旋结构域对组织的热稳定性具有重要意义，这可能是由于胶原蛋白定向沉积导致不同组织的功能不同[40]。本研究结果显示：各组织中胶原蛋白的含量存在显著差异，以鱼鳔中的胶原蛋白含量最高，其次是脊柱、鱼鳞和皮肤，肝、肠、肌肉和鳍条中胶原蛋白的含量相对较少。结合组织中COL1A2的表达特异性，结缔组织(鱼鳔、脊柱和皮肤)中COL1A2相对表达量显著高于肝脏和小肠，表明COL1A2在组织中的相关表达量、胶原蛋白含量与组织的生物功能密切相关。
4. 结论
本研究首次克隆了浅色黄姑鱼COL1A2基因，其cDNA序列全长5826 bp，编码1352个氨基酸，与同科的大黄鱼同源性最高。COL1A2蛋白质肽分子量为126.74 ku，具有典型的三重螺旋结构域等特征。不同组织中COL1A2基因表达谱与其胶原蛋白组织分布高度一致。推测不同组织中胶原蛋白含量的差异可能是由于COL1A2基因的分子特征引起组织特异性表达，最终导致不同的生物学效应。研究结果可充实鱼类胶原蛋白研究的基础理论，对今后开展鱼类胶原蛋白代谢及其调控机制的探讨具有重要意义。
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图 1 浅色黄姑鱼和其他物种的COL1A2氨基酸序列
注：高、中和低的保守性氨基酸残基分别用黑色、红色和绿色阴影显示；黑色虚线代表间隔。
Figure 1. Amino acid sequences of COL1A2 in Nibea coibor and other species
Note: The high, medium and low conserved amino acid residues are shown in black, red and green shadows, respectively; the black dotted lines represent intervals.
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图 2 浅色黄姑鱼和其他物种COL1A2蛋白质系统进化树
注：数字表示1 000次引导迭代后进化树拓扑所呈现的频率。水平分支长度与每个位点的氨基酸取代率成正比，距离越短，进化关系越近；相反，进化关系越远。
Figure 2. Phylogenetic tree of COL1A2 from N. coibor and other species
Note: Numbers represent the frequencies with which the tree topology presented is replicated after 1 000 bootstrap iterations. The horizontal branch length is proportional to amino acid substitution rate per site, the shorter the distance, the closer the evolutionary relationship; conversely, the evolutionary relationship is the farther.
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图 3 COL1A2基因在浅色黄姑鱼不同组织中的表达分析
注：不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Figure 3. Expression analysis of COL1A2 gene in different tissues of N. coibor
Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P< 0.05).
表 1 COL1A2基因克隆及表达分析所需引物序列的信息
Table 1 Primer sequence information used for the cDNA cloning and expression analysis of COL1A2
用途
use基因名称
gene name引物编号
primer number引物序列 (5′→3′)
primer sequenceRACE-PCR COL1A2 R1-C1A2F GTCTTCAGGGATTCGTTGGT R1-C1A2R GGCGAGATGGTTTATTTGTTC R2-C1A2F GGATTCTGTTGCTGCTTGC R2-C1A2R AGGTCCCTGTTCTCCCTTCT R3-C1A2F GAGTTGTTGGTAATGCTGGTGA R3-C1A2R GTGTTGAGGGACTTGATGGTG 5′/3′RACE COL1A2 C1A2-51 CCCGATTGACATGATGCTAGGTATGAA C1A2-52 CCAACATTGCCGTCAGCACCAC C1A2-31 AGTCCCTCAACACTCAGATCGAGAACCT C1A2-32 GGCAACAGCCGCTTCACCTTCT qRT-PCR COL1A2 Q-COL1A2F CAAGAACAGCGTTGCCTACAT Q-COL1A2R ACGGAGAAGGTGAAGCGG β-actin β-actinF GGTTACTCCTTCACCACCACAG β-actinR TCCGTCGGGCAGCTCATA cDNA synthesis Oligo- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX RACE-PCR UPM (long) CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT UPM (short) CTAATACGACTCACTATAGGGC NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT PCR screening M13F GTAAAACGACGGCCAGT M13R ACAGGAAACAGCTATGAC 注：“X”代表专利SMARTer Oligo序列中未公开的碱基。
Note：“X” represents the undisclosed base in the proprietary SMARTer Oligo sequence.
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表 2 浅色黄姑鱼COL1A2多肽序列与其他鱼类的相似性
Table 2 COL1A2 polypeptide sequence identity of Nibea coibor with other fishes
种名
species name基因登录号
accession number
of gene相似度/%
identity种名
species name基因登录号
accession number
of gene相似度/%
identity大黄鱼 Larimichthys crocea XP_027142672.1 96.60 罗非鱼 Oreochromis niloticus NP_001269826.1 88.76 黑点青鳉 Oryzias melastigma XP_024154448.1 88.13 美妊丽鱼 Astatotilapia calliptera XP_026011889.1 88.47 半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis XP_008328838.1 90.32 半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis XP_008329548.1 89.13 高体鰤 Seriola dumerili XP_022602721.1 91.94 龟壳攀鲈 Anabas testudineus XP_026203436.1 91.42 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus ATI25517.1 92.09 眼斑海葵鱼 Amphiprion ocellaris XP_023133230.1 91.86 青鳉 Oryzias latipes XP_023815576.1 87.61 多刺棘光鳃鲷 Acanthochromis polyacanthus XP_022069293.1 91.57 电鳗 Electrophorus electricus XP_026867852.1 81.73 红树林鳉鱼 Kryptolebias marmoratus XP_017279795.1 88.09 弹涂鱼 Boleophthalmus pectinirostris XP_020795826.1 85.59 大刺鳅 Mastacembelus armatus XP_026155865.1 89.74 草鱼 Ctenopharyngodon idella ADK48763.1 82.17 花斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus XP_023200744.1 87.56 白鲢 Hypophthalmichthys molitrix AUF74474.1 82.10 虹鳟 Oncorhynchus mykiss NP_001117679.1 81.42 斑马鱼 Danio rerio NP_892013.2 81.21 大鳞大麻哈鱼 Oncorhynchus tshawytscha XP_024296660.1 81.36 银大麻哈鱼 Oncorhynchus kisutch XP_020360620.1 81.29 黑龙江大麻哈鱼 Oncorhynchus keta BAB79229.1 81.80 兰副双边鱼 Parambassis ranga XP_028284246.1 90.90 鲫鱼 Carassius auratus XP_026144583.1 82.69 底鳉 Fundulus heteroclitus XP_012707154.1 85.21 巴丁鱼 Pangasianodon hypophthalmus XP_026785766.1 82.10 贝尔湖红点鲑 Salvelinus alpinus XP_023991358.1 80.18 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus XP_022538957.1 82.32
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表 3 不同组织中羟脯氨酸和胶原蛋白的含量
Table 3 Contents of hydroxyproline and collagen in different tissues of N. coibor
g/kg 组织 tissue 羟脯氨酸 hydroxyproline 胶原蛋白 collagen 肌肉 muscle 1.42±0.02 b 11.35±0.15 c 鱼鳔 swim bladder 24.48±0.05 g 195.87±0.39 h 肝脏 liver 0.15±0.01 a 1.18±0.09 a 鱼鳞 scale 6.01±0.23 e 48.11±1.80 f 皮肤 skin 4.12±0.11 d 32.97±0.90 e 脊柱 spine 10.91±0.22 f 87.26±1.78 g 鳍条 fin 1.99±0.04 c 15.94±0.31 d 小肠 intestines 0.60±0.01 a 4.81±0.04 b 注：同列不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。
Note: In the same column, different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).
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