青贮玉米是玉米依据用途划分的三大类型之一，常用于饲喂家畜。作为中国“粮改饲”的首推品种，青贮玉米在中国草食畜牧业发展中具有非常重要的作用，直接影响中国畜牧业的可持续发展。青贮是一种将饲料长期保存的贮藏方式，其主要是通过厌氧环境下乳酸菌产酸降低饲料的pH值来达到长时间保存的目的^[1]。将全株玉米青贮后，可最大限度地发挥玉米的营养价值，提高适口性和利用率，并可以在新鲜饲草稀缺的冬春季饲喂家畜，填补鲜草的不足^[2]。但在取用过程中，全株玉米青贮饲料容易发生不同程度的有氧腐败，致使青贮饲料的发酵品质及营养价值达不到最佳效果^[3-4]。

青贮添加剂是提升青贮饲料品质的有效途径。在生产中，乳酸菌制剂是应用最为广泛的一种发酵促进剂^[5]。研究表明：乳酸菌可以根据发酵产酸能力分为2大类，一类是同型发酵乳酸菌，有较高的乳酸产生率，能迅速降低青贮饲料的pH值，限制有害微生物的活动，进而提高青贮饲料的发酵品质；另一类是异型发酵乳酸菌，除了能产生乳酸外，还可产生大量乙酸对真菌进行有效抑制，从而提高有氧稳定性^[6]。傅彤^[7]在研究微生物接种剂对玉米青贮饲料发酵进程及其品质的影响时发现：添加接种剂不会明显影响玉米青贮过程中乳酸菌和酵母菌的数量、pH值和乳酸生成量，但发酵初期霉菌的数量有所增加；刘艳芳等^[8]在青贮时加入乳酸菌制剂，可以快速发酵，产生大量乳酸，迅速降低pH值。可见，现有的一些研究因为乳酸菌种类和添加剂用量等不同而导致结果存在差异^[9-10]。因此，为探讨同型、异型乳酸菌的协同作用，筛选出适用于昆明地区全株玉米青贮的乳酸菌种类及添加量，本研究开展同、异质型乳酸菌的不同配比对全株玉米青贮品质及有氧稳定性的影响研究，研究结果对缓解中国能量饲料资源短缺、促进“粮改饲”政策的推行及畜牧产业的可持续发展等具有重要意义。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试玉米品种为云青2号，购自北京克劳沃种业有限公司。试验用乳酸菌制剂为兰州大学筛选出的植物乳杆菌FE-1菌株(MF 093219，产阿魏酸酯酶菌株，活菌数量>9.0×10¹⁰ CFU/g)和布氏乳杆菌9-2菌株(MN386234，产1,2-丙二醇，活菌数量>1.5×10¹⁰ CFU/g)。

1.2   试验时间和地点

供试玉米于2020年6月7日播种于云南农业大学实习基地(N25°21′，E102°58′)，种植密度为58 000株/hm²。于2020年10月15日玉米蜡熟期(含水量66%)刈割，带回实验室。发酵试验于2020年10月16日—12月16日在云南农业大学云贵高原草地资源与利用实验室进行。

1.3   试验设计与青贮方法

试验设6个处理：① 对照处理(CK)，不添加乳酸菌制剂；② 植物乳杆菌处理(Z)，添加量为6.75×10⁸ CFU/g；③ 布氏乳杆菌处理(B)，添加量为9.0×10⁸ CFU/g；④ m_{植物乳杆菌}∶m_{布氏乳杆菌}=1∶1 (Z₁B₁)，添加植物乳杆菌3.42×10⁸ CFU/g，添加布氏乳杆菌4.50×10⁸ CFU/g；⑤ m_{植物乳杆菌}∶m_{布氏乳杆菌}=5∶1 (Z₅B₁)，添加植物乳杆菌5.58×10⁸ CFU/g，添加布氏乳杆菌1.50×10⁸ CFU/g；⑥ m_{植物乳杆菌}∶m_{布氏乳杆菌}=1∶5 (Z₁B₅)，添加植物乳杆菌1.17×10⁸ CFU/g，添加布氏乳杆菌7.5×10⁸ CFU/g。每个处理3个重复。

将全株玉米刈割后，使用粉碎揉搓机切碎(长约2 cm)、揉搓并混合均匀。将乳酸菌制剂溶于蒸馏水50 mL中，均匀喷洒至混合的青贮原料上，CK处理则添加等量的蒸馏水；混匀后装入规格为5 kg的聚乙烯塑料桶中，压实密封；室温避光贮藏60 d后开封取样，随后开展相关指标的测定。

1.4   测定指标与方法

1.4.1   微生物数量的测定

主要测量乳酸菌、好氧细菌、酵母菌及霉菌的数量。乳酸菌使用MRS培养基，好氧细菌使用营养琼脂培养基，酵母菌及霉菌采用孟加拉红(虎红)培养基。培养条件：乳酸菌和好氧细菌在30 ℃下培养2 d；酵母菌和霉菌在28 ℃条件下培养3~5 d。培养结束后采用平板菌落计数法进行计数，并折算微生物数量^[11-13]。

1.4.2   发酵品质的测定

称取青贮样品10 g，加入蒸馏水90 mL，用粉碎机粉碎成匀浆，先后用4层纱布、定性滤纸过滤，得浸提液后立即用pH计测定pH值。采用高效液相色谱法测定青贮饲料中的乳酸、乙酸、丁酸和丙酸含量(色谱柱Shodex Rspark KC-811，8 mm×300 mm；柱温50 ℃；进样量5 μL；检测波长210 nm；流速1 mL/min)；采用苯酚—次氯酸钠比色法测定氨态氮(ammonia nitrogen，NH₃-N)含量^[14-15]。

1.4.3   常规营养成分的测定

干物质含量采用烘干法测定，先低温烘干，再高温烘至恒量；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量采用范氏法测定；可溶性碳水化合物含量采用蒽酮—硫酸法测定；粗脂肪含量采用残余法测定；粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定^[16-17]。

1.4.4   有氧稳定性的测定

取样品800~1 000 g置于340 mm×450 mm的塑料封口袋中，用牙签在封口袋上扎数个小孔，再套上1个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，用量程为50 ℃的温度计测定温度变化。温度变化每4 h记录1次，当青贮物料温度超过环境温度2 ℃时 (即达到有氧稳定性)停止记录。

1.5   数据统计与分析

采用Excel 2010整理数据，采用SPSS 23.0进行单因素方差分析，采用Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性。数据采用“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

运用模糊数学隶属函数法^[18]对青贮营养价值进行综合评价，若测定的指标与青贮的营养价值呈正相关，则计算公式为R(X_i)=(X_i－X_min)/(X_max－X_min)；若为负相关，则用反隶属函数进行转换，计算公式为R(X_i)=1－(X_i－X_min)/(X_max－X_min)。式中：R(X_i)为某一指标隶属函数值；X_i为该指标的测定值；X_max和X_min分别为该指标所有测定值中的最大值和最小值。对所有指标隶属函数值进行相加，求其平均值，以平均值大小进行排序。

2.   结果与分析

2.1   不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料微生物数量的影响

由表1可知：与自然发酵(CK处理)相比，单独添加植物乳杆菌(Z处理)或布氏乳杆菌(B处理)以及两者配合添加(Z_nB_n处理)均可显著增加乳酸菌数量，且以Z处理的乳酸菌数量最高，较CK处理提高了7.01%；Z处理、B处理和Z_nB_n处理均可显著降低好氧细菌数量，且以B处理的好氧菌数量最少，较CK降低了9.59%；在抑制酵母菌方面，Z处理无显著效果，B处理和Z_nB_n处理则可显著抑制酵母菌滋生；在抑制霉菌方面，所有处理都未检测到霉菌。

表  1  不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料微生物数量的影响

Table  1.  Effects of different ratios of lactic acid bacteria additives on the number of microorganisms in the whole corn silage CFU/g

处理 treatments	乳酸菌 lactic acid bacteria	好氧细菌 aerobic bacteria	酵母菌 yeast	霉菌 mould
CK	6.99±0.05 b	5.32±0.31 a	2.49±0.12 a	ND
Z	7.48±0.00 a	5.12±0.03 b	2.30±0.22 a	ND
B	7.40±0.56 a	4.81±0.32 d	ND	ND
Z1B1	7.44±0.01 a	4.90±0.19 cd	ND	ND
Z5B1	7.30±0.12 a	4.91±0.14 cd	ND	ND
Z1B5	7.27±0.12 a	4.83±0.17 d	ND	ND
注：CK. 自然发酵，Z. 单独添加植物乳杆菌，B. 单独添加布氏乳杆菌，Z1B1. m植物乳杆菌∶m布氏乳杆菌=1∶1添加，Z5B1. m植物乳杆菌∶m布氏乳杆菌= 5∶1添加，Z1B5. m植物乳杆菌: m布氏乳杆菌=1∶5添加；同列数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；ND. 未检测到；下同。 Note: CK. natural fermentation, Z. the addition of Lactobacillus plantarum alone, B. the addition of L. buchneri alone, Z1B1. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 1∶1, Z5B1. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 5∶1, Z1B5. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 1∶5; different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05); ND. not detected; the same as below.

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2.2   不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料发酵品质的影响

由表2可知：不同处理对全株玉米青贮饲料的乳酸、乙酸和NH₃-N含量以及pH值有不同程度的影响。不同处理全株玉米乳酸含量无明显的变化规律，且因全株玉米本身所附着的乳酸菌数量充足(表1)，因此自然发酵就可以产生充足的乳酸；乙酸含量以单独添加布氏乳杆菌(B处理)以及植物乳杆菌和布氏乳杆菌按质量比1∶1和1∶5混合添加(Z₁B₁和Z₁B₅处理)最高，表明添加异型发酵乳酸菌可促进乙酸产生，进而有效抑制酵母菌和霉菌的产生(表1)，提高有氧稳定性；添加乳酸菌对降低NH₃-N含量无明显效果，且全株玉米自然发酵(CK处理)就可以显著抑制微生物和植物蛋白酶对氨基酸以及蛋白质的降解(NH₃-N含量最低)。此外，6个处理下全株玉米pH值均小于4.2，达到了优质青贮饲料的标准。本研究6个处理均未检测到丙酸和丁酸。

表  2  不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料发酵品质的影响

Table  2.  Effects of different ratios of lactic acid bacteria additives on the fermentation quality of whole plant corn silage

处理 treatments	乳酸/(g·kg−1) lactic acid	乙酸/(g·kg−1) acetic acid	丙酸/(g·kg−1) propionic acid	丁酸/(g·kg−1) butyric acid	氨态氮/(g·kg−1 ) NH3-N	pH值 pH value
CK	22.99±0.34 ab	21.36±0.16 bc	ND	ND	1.46±0.05 b	3.75±0.00 a
Z	22.71±0.64 ab	20.38±0.08 c	ND	ND	1.66±0.05 ab	3.54±0.01 b
B	19.24±1.09 c	28.63±0.62 a	ND	ND	1.51±0.14 b	3.55±0.02 b
Z1B1	18.80±1.33 c	27.07±0.47 a	ND	ND	1.94±0.09 a	3.56±0.01 b
Z5B1	20.71±0.18 bc	22.82±1.17 b	ND	ND	1.64±0.13 ab	3.57±0.00 b
Z1B5	23.30±0.49 a	27.77±0.31 a	ND	ND	1.56±0.00 b	3.77±0.01 a

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可见，全株玉米青贮时，不需要添加乳酸菌制剂也可以获得优质的青贮饲料；但从乙酸含量和有害菌数量测定结果来看，制作全株玉米青贮时，建议添加布氏乳杆菌(B处理)或布氏乳杆菌与植物乳杆菌配合添加(Z₁B₁和Z₁B₅处理)，以产生大量乙酸，进而抑制有害菌的滋生，且在配合添加时，布氏乳杆菌的添加量需占总添加量的一半及以上。

2.3   不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料营养品质的影响

由表3可知：与自然发酵(CK处理)相比，植物乳杆菌与布氏乳杆菌按质量比5∶1添加(Z₅B₁处理)可提高干物质含量，但差异不显著(P>0.05)；单独添加植物乳杆菌(Z处理)或Z₅B₁处理可显著提高粗蛋白含量(P<0.05)；单独添加布氏乳杆菌(B处理)可显著降低中性洗涤纤维含量(P<0.05)，较CK降低了5.71%；B处理可显著提高粗脂肪含量，较CK增加了16.81%；添加剂处理组的酸性洗涤纤维含量显著提高(P<0.05)，可溶性碳水化合物含量降低(P>0.05)或显著降低(P<0.05)。

表  3  不同配比的乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料中营养成分的影响

Table  3.  Effects of different ratios of lactic acid bacteria additives on the nutrient composition of whole plant corn silage %

处理 treatments	干物质 dry matter	粗蛋白 crude protein	可溶性碳水化合物 water soluble carbohydrates	中性洗涤纤维 neutral detergent fiber	酸性洗涤纤维 acid detergent fiber	粗脂肪 crude fat
CK	27.09±3.39 a	7.03±0.05 b	1.29±0.12 a	54.79±5.42 d	28.63±0.38 c	2.20±0.11 bc
Z	26.36±0.25 ab	7.29±0.22 a	1.01±0.06 cd	58.08±1.06 b	29.73±0.37 b	2.49±0.02 ab
B	25.26±0.09 c	6.86±0.08 cd	1.17±0.17 c	51.66±0.16 e	32.87±0.02 a	2.57±0.09 a
Z1B1	26.22±0.21 b	6.90±0.14 c	0.96±0.06 d	59.01±4.99 a	30.53±0.05 b	1.88±0.05 d
Z5B1	27.42±0.35 a	7.29±0.40 a	1.22±0.01 b	57.74±4.39 c	29.80±0.45 b	2.04±0.10 cd
Z1B5	25.86±0.26 bc	6.74±0.28 d	1.25±0.10 ab	54.97±0.00 d	32.67±0.10 a	2.32±0.14 abc
注：粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗脂肪含量为占干物质的百分比。 Note: The content of crude protein, water soluble carbohydrates, neutral detergent fiber, acid detergent fiber and crude fat are the percentage in dry matter.

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2.4   不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料有氧稳定性的影响

由图1可知：与自然发酵 (CK处理) 相比，乳酸菌添加剂显著增加了全株玉米青贮饲料的有氧稳定性(P<0.05)。各处理青贮玉米有氧稳定性排序为：Z₁B₁>B>Z₅B₁>Z₁B₅>Z>CK，以布氏乳杆菌和植物乳杆菌按质量比1∶1配合添加(Z₁B₁处理)及单独添加布氏乳杆菌(B处理)青贮饲料的有氧稳定性最好，分别达到425和419 h，比CK处理提高了约4.6倍。

图  1  不同处理达到有氧稳定性的时间

注：CK. 自然发酵，Z. 单独添加植物乳杆菌，B. 单独添加布氏乳杆菌，Z₁B₁. m_{植物乳杆菌}: m_{布氏乳杆菌}=1∶1添加，Z₅B₁. m_{植物乳杆菌}: m_{布氏乳杆菌}=5∶1添加，Z₁B₅. m_{植物乳杆菌}: m_{布氏乳杆菌}=1∶5添加；下同。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Figure  1.  Time of reaching aerobic stability under different treatments

Note: CK. natural fermentation, Z. the addition of Lactobacillus plantarum alone, B. the addition of L. buchneri alone, Z₁B₁. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 1∶1, Z₅B₁. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 5∶1, Z₁B₅. the addition of L. plantarum and L. buchneri at a mass ratio of 1∶5; the same as below. Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

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2.5   不同配比乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料综合评价的影响

采用模糊数学隶属函数法对不同处理组具有差异的指标进行分析，其中干物质、可溶性碳水化合物、乳酸、乙酸、粗脂肪和粗蛋白含量以及乳酸菌数量为正相关指标，NH₃-N、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量以及好氧细菌和酵母菌数量为负相关指标。依据指标的平均隶属函数值进行排序，综合营养价值从高到低为B=Z₁B₅>Z>Z₅B₁>CK>Z₁B₁ (图2)。

图  2  不同处理的综合营养价值

Figure  2.  Comprehensive nutritional value of different treatments

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3.   讨论

3.1   乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料微生物数量及发酵品质的影响

青贮是由多种微生物参与的发酵过程，主要是乳酸菌在厌氧环境下发挥作用，而厌氧环境一旦被破坏，酵母菌和霉菌等有害微生物剧烈活动会引起青贮饲料腐败^[19-20]。研究表明：乳酸菌制剂的添加可有效增加青贮饲料中的乳酸菌数量，促进乳酸菌发酵产生大量乳酸，有利于将青贮饲料的pH值稳定在较低范围内，抑制有害微生物，提高发酵品质^{[4, 21]}。本研究中，所有处理的pH值均低于4.2，且各处理均未检测到霉菌、丙酸和丁酸，达到了优质青贮饲料的标准。添加剂处理组的乳酸菌数量及乙酸含量有所增加，好氧细菌和酵母菌得到了有效抑制。据报道，添加植物乳杆菌往往仅产生乳酸，而布氏乳杆菌是异型发酵乳酸菌，除了产生乳酸外，还产生乙酸等物质^[22]。本研究中，添加布氏乳杆菌的青贮玉米乙酸含量显著高于CK处理，而部分添加剂组的乳酸含量显著低于CK处理、NH₃-N含量显著高于CK处理，这与苗芳等^[12]的研究结果相类似，分析其原因可能与青贮原料最初附着的乳酸菌类型、数量以及外源乳酸菌添加剂的接种效果有关。外源乳酸菌添加剂可能对附着的乳酸菌具有拮抗作用，从而使其在青贮原料中无法正常发挥作用^[23]。

3.2   乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲料营养成分及有氧稳定性的影响

青贮饲料营养价值的评价指标主要有干物质、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗脂肪和粗蛋白含量等。大多数研究显示：青贮中添加乳酸菌制剂不会显著影响青贮后的干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量^[19]。本研究中，部分添加剂处理组的粗蛋白和粗脂肪含量有所提高；添加布氏乳杆菌可以降低中性洗涤纤维含量，而添加植物乳杆菌却可增加中性洗涤纤维含量，这与和立文^[15]和毛翠等^[5]的研究结果类似。而与CK处理相比，添加剂处理的酸性洗涤纤维含量显著提高，这与张相轮等^[10]和翁玉楠等^[19]的研究结果类似，分析其原因可能是乳酸菌的加入增加了青贮过程中细胞壁某些物质的分解，留下难以降解的成分，从而导致酸性洗涤纤维等难以消化成分的质量分数增加^[24]。

青贮饲料的有氧稳定性，即青贮饲料暴露在空气中后，核心温度上升到高于外界温度2 ℃所需的时间^[25]。青贮罐开封后，厌氧环境变为有氧环境，好气微生物便开始活动，酵母菌和霉菌利用青贮饲料发酵产生的乳酸和剩余营养物质不断释放热量，从而导致青贮饲料变质^[26]。研究表明：异型乳酸菌发酵时产生的乙酸可防止二次发酵，从而提高青贮饲料的有氧稳定性^[18]。本研究中，添加乳酸菌制剂均可提高全株玉米青贮饲料的有氧稳定性，其中，以单独添加布氏乳杆菌以及布氏乳杆菌和植物乳杆菌按1∶1配合添加处理的有氧稳定性最好。

4.   结论

单独添加植物乳杆菌或布氏乳杆菌以及二者配合添加均可有效抑制有害微生物，增加乳酸菌数量，改善全株玉米的发酵品质并提高有氧稳定性，提高营养价值；但在配合添加时，为达到更好的效果，建议布氏乳杆菌的添加量占总添加量的一半及以上。以综合营养价值为依据，推荐单独添加布氏乳杆菌或植物乳杆菌、或植物乳杆菌与布氏乳杆菌按质量比1∶5混合添加。