杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)树种的统称，因其生长快、适应性强、用途广而被世界许多国家和地区广泛栽培和利用，是当今世界中纬度地区栽培面积最广、木材产量最多的树种之一^[1-3]。中国具有丰富的杨树种质资源，占世界杨树种类的50%以上，其中白杨派和青杨派中的许多树种均为中国所特有，且分布非常广泛^[4-6]。毛白杨(P. tomentosa)属白杨派(Section Leuce)，为中国优良的速生树种之一，以材质好、生长快、冠形优美等特点而为人们所喜爱，是优良的庭园绿化和行道树种，但硬枝扦插不易成活，限制了其栽培利用^[7-8]。滇杨(P. yunnanensis)为青杨派(Section Tacamahaca)树种，主要分布于云南省中部、北部和南部，贵州省西部及四川省西南部等地区中海拔范围1 300~3 200 m间的山地，具有分布海拔梯度变化大，适应性强，生长迅速，扦插易于生根等优良特性，是典型而稀有的低纬度高海拔南方型杨属树种，可用于插杆造林^[9-11]。

本试验以扦插难以生根的毛白杨和扦插易于生根的滇杨为试材，比较二者插穗生根过程中内源激素生长素(indole-3-acetic acid, IAA)、玉米素(zeatin, ZT)、赤霉素(gibberellin, GA₃)和脱落酸(abscisic acid, ABA)的动态变化，探讨该4种内源激素对2种杨树生根难易程度的影响，为揭示毛白杨扦插不易生根的内部机制奠定研究基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

以前期收集并繁殖保存的滇杨和毛白杨3株优树为母体，剪取截干后1年生长势与粗度相近的滇杨与毛白杨萌生枝用于制作插穗，插穗长度为30 cm，上部保留2~3颗饱满侧芽。参照随机区组试验设计方法，每小区1个基因型，10株小区，按株行距30 cm×40 cm扦插于不添加任何肥料的苗床上，扦插深度约15 cm。树种间各小区相互交错排列。以扦插第0 天为起始，每隔7 d取样1次，至第49天，共取样8次。每次随机选取滇杨和毛白杨3个基因型各1根插穗切取基部皮层提取内源激素，共计3个生物学重复。

1.2   样品处理

采集的插穗样品用清水冲洗干净沙土，再经蒸馏水冲洗，砂布擦干表面水分。用手术刀切取插穗土面以下2 cm至插穗基部端口以上2 cm之间的所有树皮。若插穗已萌生不定根，则去除不定根。液氮充分研磨，−80 ℃保存备用。

1.3   内源激素的提取与检测

参照李佳蔓等^[12]的方法提取IAA、ABA、GA₃和ZT。提取IAA、ABA和GA₃的方法为：称取样品粉末约1.0 g，加入10 mL甲醇4 ℃静置18 h，过滤甲醇冲洗样品，并合并滤液；加入等体积的石油醚分液，萃取2次(弃醚相)，45 ℃减压蒸干；加NaHCO₃ (pH 8.5)溶解，用H₃PO₄调pH至2~3，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并酯相，45 ℃旋转蒸干，1 mL 甲醇定容，0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤，作为供试液保存于4 ℃冰箱。提取ZT的方法为：用提取IAA、ABA和GA₃相同的方法处理样品，调节pH至2~3，Sep-Pak C₁₈小柱分离纯化，依次以纯水、50%甲醇、100%甲醇洗脱，收集50%甲醇洗脱液，45 ℃旋转蒸干；1 mL 甲醇定容，0.45 μm 的有机系微孔滤膜过滤，作为供试液保存于4 ℃冰箱。

于Agilent 1200 Series高效液相色谱仪上采用外标峰面积法进行4种内源激素的定量检测，试验条件为柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL，检测波长：GA₃，210 nm；IAA和ABA，254 nm；ZT，280 nm。

1.4   数据分析

对滇杨和毛白杨插穗基部皮层内4种内源激素的含量测定值分别进行统计分析，比较滇杨和毛白杨4种内源激素含量的变化。所得数据用Excel 2003进行整理，采用SPSS 13.0进行数据分析，应用Origin 8.5软件进行相关图形的绘制。

2.   结果与分析

2.1   滇杨与毛白杨插穗基部生根观测

根据对取样时挖取的插穗基部观测表明：扦插第7天，滇杨插穗开始出现愈伤组织，并在21 d观测到不定根的出现，而毛白杨在21 d出现愈伤组织，但直到49 d都没有形成不定根(图1)。

图  1  滇杨和毛白杨的愈伤组织及不定根

注：a)和b)分别表示扦插第7天和21天的滇杨；c)表示扦插第21天的毛白杨。

Figure  1.  The adventitious root and callus of P. yunnanensis and P. tomentosa

Note: a) and b) were P. yunnanensis at 7 d and 21 d, and c) was P. tomentosa at 21 d.

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2.2   滇杨与毛白杨插穗基部内源激素含量分析

于49 d观测期内，滇杨IAA含量略高于毛白杨，但差异均不显著，且2种杨树均于7 d (滇杨出现愈伤组织)时具有较高IAA含量[滇杨插穗为219.55 μg/g (FW)，毛白杨插穗为200.26 μg/g(FW)]，而21 d时(滇杨不定根形成，毛白杨产生愈伤) IAA含量均较低。前5个观测期内(0、7、14、21和28 d)，滇杨的ZT含量较高，与毛白杨差异仅于0 d时达显著水平，而后3个观测期(35、42和49 d)，毛白杨的ZT含量略高，但差异不显著。毛白杨ABA含量和GA₃含量于整个观测期内均高于滇杨，其中，毛白杨ABA含量在第0、21、28和49天时显著或极显著高于滇杨，而毛白杨GA₃含量于第7~35天共5个时期显著或极显著高于滇杨(图2)。

图  2  滇杨和毛白杨插穗内源激素含量的动态变化

注：*表示差异显著， **表示差异极显著；下同。

Figure  2.  Dynamic changes of endogenous hormones contents in cuttings of P. tomentosa and P. yunnanensis

Note: * stands for the significant difference, and ** stands for the very significant difference; the same as below.

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2.3   滇杨和毛白内源激素含量比值分析

由图3所示：以滇杨为参照，毛白杨的IAA/ZT于0、7 、28和35 d时较高，其余观测期较低，但差异均不显著。IAA/ABA、ZT/ABA、IAA/GA₃和ZT/GA₃比值在整个观测期内均低于滇杨，其中，2种杨树的IAA/ABA和ZT/ABA比值差异于0和14 d时达极显著水平，而IAA/GA₃和ZT/GA₃比值于0、7、14和28 d时差异显著。毛白杨插穗基部的ABA/GA₃结果在观测期内均高于滇杨，但差异不显著。

图  3  滇杨和毛白杨插穗内源激素含量比值的动态变化

Figure  3.  Dynamic changes of endogenous hormones ratios in cuttings of P. tomentosa and P. yunnanensis

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3.   讨论

根是植物长期进化过程中形成的适应陆生生活的重要器官之一，主要分为3种，主根源于种子中的胚根，侧根为主根发育出的分支，这2种根均属于直根系，而不定根属须根系，通常在某种环境胁迫下，由地上部分的器官(如茎)发生而成^[13]。在林木无性繁殖过程中，扦插技术难易程度直接取决于不定根是否发生。不定根的形成由环境和内源激素相互作用、共同调控^[14]。许多研究认为IAA是调节不定根发生和发育的主要内源激素，而其他内源激素主要通过与生长素的互作调节而起作用^[15]。本研究结果显示：滇杨与毛白杨插穗基部皮层中，滇杨的IAA和ZT含量较高，但2个树种之间的差异并不显著，而毛白杨插穗基部皮层的ABA和GA₃则在整个观测期内含量较高，表明IAA或ZT含量的高低并不是影响毛白杨扦插难生根的主要因素，而高浓度的ABA和GA₃可能抑制了毛白杨插穗不定根的形成。

皮层内的IAA主要集中于细胞分裂活动旺盛的形成层区^[16]，其局部富集有助于刺激不定根发生^[17]，是不定根原基起始的必要条件，直到根原基形成后，生长素才会迅速转移至其他生长活跃的部位^[18]。但也有许多研究表明IAA与植物生根难易没有直接关系^[19-20]。董宁光^[21]对杨树嫩茎生根研究表明：低浓度的细胞分裂素促进生根，高浓度则抑制生根。欧阳群芳等^[15]对欧洲云杉生根过程中内源激素检测时发现：GA₃和ZT含量的降低是促进插穗生根的重要原因，高含量是不定根形成的抑制剂。但长白松的扦插试验表明：在组织形成、不定根的产生过程中GA₄含量增加^[18]。关于ABA含量与生根关系也有不同的报道，ABA在白桦插穗根原基发生过程中大幅度下降^[22]，是抑制生根的主要激素，但在鹅掌楸不定根形成前开始上升，促进了插穗的生根^[23]。在白杨派树种生根过程，高浓度ABA在多数试验中均被证实起抑制作用^[24-25]。由此可见，内源激素与生根的关系较为复杂，本研究无论是基于生根时间(滇杨于21 d时IAA和ZT含量低于14 d)，还是基于树种对比(IAA和ZT含量于滇杨和毛白杨中差异不显著)，均表明IAA和ZT与滇杨和毛白杨生根能力差异的关系不明显。同时，毛白杨于整个观测期内并没有形成不定根，而滇杨于21 d可观测到不定根，2种杨树的内源激素随时间的变化趋势相似，进一步表明ABA和GA₃的高浓度富集才是抑制毛白杨生根的主要因素，这与杨树生根过程中内源激素变化研究的较多结果^[26-28]相一致。

内源激素对植物生根过程的调节是十分精细和复杂的，一个简单的生理过程不仅需要单个激素的瞬时调控，更多的是多种激素的共同作用结果^[29-31]，这些激素常以联合体的形式参与植株的生长发育进程^{[13, 32-33]}。因此，杨树插穗生根过程中内源激素动态变化分析时，不仅考虑单个激素的富集与释放，也要考虑激素之间的动态平衡。陈雪梅等^[24]认为：IAA/ABA的比值可以作为杨树插穗生根能力的标准，其比值越高，生根能力越强。本研究发现：滇杨插穗基部皮层内的IAA含量高于毛白杨，而ABA含量显著低于毛白杨。相应地，滇杨插穗基部皮层内的IAA/ABA比值显著高于毛白杨。由此可知：插穗基部皮层内高含量的ABA可能抑制了毛白杨插穗基部不定根的形成。此外，研究结果还显示：ABA与GA₃协同作用抑制了毛白杨插穗不定根的形成，但二者之间如何维持平衡从而抑制毛白杨不定根的产生，有待于进一步深入研究。