重楼皂苷Ⅰ对紫外损伤的人永生化角质形成细胞(HaCaT)的保护作用研究
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关键词:
- 重楼皂苷Ⅰ /
- 紫外损伤 /
- 人永生化角质形成细胞 /
- 去乙酰化酶
Study on the Protective Effect of PolyphyllinⅠon HaCat Cells Injured by Ultraviolet Ray
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Keywords:
- polyphyllin Ⅰ /
- UV damage /
- HaCaT cell /
- deacetylase
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随着生活水平的提高和医美行业的发展，皮肤外源性老化(如紫外损伤)的问题日益受到关注。日常生活中不可避免的日晒会导致皮肤细胞产生大量的自由基，引发细胞的氧化应激，从而引起DNA损伤、线粒体等细胞器损伤、细胞内生物大分子过氧化和细胞外基质降解，宏观表现为皮肤红肿和晒斑等一系列老化现象，被称为皮肤光老化[1]。过量紫外线刺激角质形成细胞会产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS可诱导转录因子激活蛋白-1 (activator protein 1，AP-1)，进而上调多种基质金属蛋白酶的表达水平从而降解大量的真皮胶原，使皮肤出现褶皱，黯淡无光泽[2-3]；ROS还可以活化核转录因子核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)，进而上调促炎症细胞因子及各种黏附分子的表达，这些细胞因子又会上调AP-1并进一步激活NF-κB通路，从而增强细胞的紫外损伤[4-6]。沉默调节3 (sirtuin3，SIRT3)则可以刺激线粒体超氧化物歧化酶重组蛋白(mitochondrial recombinant superoxide dismutase 2，SOD2)的去乙酰化，进而清除紫外线导致的氧化应激[7]。
重楼属植物是中国西南地区的特有植物资源，常被用于治疗炎症性皮肤病[8-9]，且其醇提物具备体外清除活性氧及抗氧化的功效[10]，重楼皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)作为其主要活性成分可以缓解ROS诱导的细胞自噬以减少细胞的氧化应激[11]，但是对于紫外线诱导的细胞损伤保护作用报道甚少。本研究探讨了PPⅠ对紫外损伤的人永生化表皮角质细胞(HaCaT)的保护作用及分子机制，旨在为深入开发滇重楼资源在日化用品中的应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
HaCaT 细胞株由中国科学院昆明细胞库提供；PPⅠ(C-036-171216)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 细胞培养
HaCaT细胞在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞融合度在90%以上时传代，经0.5%胰蛋白酶消化后，使用高糖DMEM培养基分别以对应的细胞密度将细胞接种于60和90 mm培养皿或96孔细胞培养板中。
1.2.2 HaCaT细胞紫外损伤模型的建立
将HaCaT细胞接种于60 mm细胞培养皿中，待细胞融合80%时，将1根20 W的UVB灯管悬于超净台内对细胞进行照射，辐射剂量参照XU等[7]的研究结果，以HaCaT细胞刚发生增殖抑制的剂量进行后续试验，即UVB辐照剂量为21.6 mJ/cm2。
1.2.3 无毒性PPⅠ的浓度筛选
通过四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测PPⅠ对于细胞生长的毒性作用，进行浓度筛选，以用于后续试验。按1.2.1节所述方法将HaCaT细胞接种于96孔培养板中，当细胞融合80%时，换成含有不同浓度PPⅠ(0、0.125、0.250、0.500和1.000 μmol/L)的培养液。PPⅠ处理细胞24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液。避光于37 ℃培养箱中孵育4 h，吸除上清，每孔加入200 μL DMSO溶液，室温振荡10 min，采用酶标仪于492 nm处读板。
1.2.4 PPⅠ对紫外线损伤HaCaT细胞增殖的影响以及细胞形态观察
通过结晶紫染色法研究不同浓度PPⅠ对紫外线损伤HaCaT细胞增殖的影响。以70万/皿的细胞密度将HaCaT细胞接种至60 mm细胞培养皿中过夜，待细胞贴壁牢固，用PBS清洗1~2次，将培养基换成含有0.250和0.500 μmol/L PPⅠ的无血清培养基；继续培养1 h后用UVB紫外灯管辐射细胞，然后放进细胞培养箱中培养；24 h后缓慢吸除培养基，用PBS清洗2~3次，使用4%多聚甲醛固定20 min；固定结束后用去离子水清洗1次，用0.1%结晶紫染液染色1 min，用超纯水小心清洗3~5次后拍照记录。将细胞置于光学显微镜下，对细胞形态进行观察和拍照记录。
1.2.5 蛋白表达检测
采用蛋白质免疫印迹法(Western-blot，WB)检测凋亡蛋白多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP1)、cleaved-PARP1、乙酰基-赖氨酸、SOD2 (K68)和SIRT3蛋白的表达。采用RIPA高效裂解液裂解细胞，经150 000 r/min离心15 min后取上清得到细胞总蛋白，采用BCA定量法测得蛋白浓度。取样品30 μg进行上样，电泳转膜后将转移到膜上的蛋白质与一抗(β-Tubulin)在4 ℃冰箱过夜孵育，第2天使用与一抗对应的二抗室温孵育1 h，在曝光机中成像并拍照。
1.2.6 数据分析
所有数据均采用GraphPad Prism 5.0软件进行作图和显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 不同浓度PPⅠ对HaCaT 细胞存活率的影响
由图1可知：PPⅠ对 HaCaT 细胞具有一定的毒性。当PPⅠ浓度为0.125、0.250和0.500 μmol/L时，对细胞增殖能力影响不大；当PPⅠ浓度达到1.000 μmol/L时，细胞存活率显著降低，PPⅠ表现出显著的细胞毒性(P<0.001)。考虑到给药浓度小于1.000 μmol/L 时，PPⅠ对细胞增殖能力没有显著影响，故选择0.250和0.500 μmol/L作为后续试验的浓度。
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图 1 不同浓度PPⅠ对HaCaT细胞存活率的影响注：“*”“**”和“***”分别表示处理间在0.05、0.01和0.001水平上差异显著；ns. 无显著差异；下同。Figure 1. Effects of different concentrations of PPⅠ on the cell survival rate of HaCaT cellsNote: “*” “**” and “**” indicate significant differences under 0.05, 0.01, and 0.001 level among treatments, respectively; ns. without significant differences; the same as below.2.2 PPⅠ对紫外损伤HaCaT细胞增殖的影响
由图2可知：与空白对照组相比，UVB照射可显著抑制HaCaT增殖，使之无法形成明显的细胞群落；而PPⅠ的加入则可以缓解由UVB照射引起的细胞增殖抑制，且这种缓解作用随着PPⅠ浓度的增加而增加。
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图 2 不同浓度PPⅠ对紫外线损伤HaCaT细胞增殖的影响注：a) 紫色越深表示细胞存活率越高。b) −. 空白组，+. UVB处理组；下同。Figure 2. Effects of different concentrations of PPⅠ on the proliferation of HaCaT cells damaged by ultraviolet radiationNote: a) the darker the purple, the higher the survival rate of cell. b) −. blank control group, +. UVB treatment group; the same as below.2.3 PPⅠ对UVB诱导细胞凋亡的影响
由图3 可知：UVB 可以显著提高HaCaT 细胞cleaved-PARP1蛋白的表达，从而引起细胞凋亡；PPⅠ 的加入可显著降低其表达水平， 且 0.500 μmol/L PPⅠ的效果优于0.250 μmol/L PPⅠ。此外，相较于空白对照组，UVB处理可使细胞变圆、变亮，表示细胞正在死亡，而PPⅠ处理组细胞虽然也有不同程度的损伤，但是相较于UVB处理组损伤明显减轻。
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图 3 不同浓度PPⅠ对凋亡蛋白cleaved-PARP1表达(a和b)以及HaCaT细胞形态(c)的影响Figure 3. Effects of different concentrations of PPⅠ on the expression of apoptotic protein cleaved-PARP1 (a and b) and the morphology of HaCaT cell (c)2.4 PPⅠ对SIRT3和SOD2表达水平的影响
由图4可知：与空白对照组相比，UVB处理下SIRT3的表达水平显著降低，而加入PPⅠ则可在一定程度上增加紫外损伤HaCaT细胞SIRT3蛋白的表达水平，且0.250 μmol/L PPⅠ的效果优于0.500 μmol/L PPⅠ。
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图 4 不同浓度PPⅠ对SIRT3蛋白表达的影响Figure 4. Effects of different concentrations of PPⅠ on the expression of SIRT3 protein由图5可知：UVB处理使细胞内赖氨酸的乙酰化水平增加，而加入PPⅠ处理后赖氨酸的乙酰化水平降低；UVB照射可以显著诱导SOD2蛋白的K68位点发生乙酰化修饰，PPⅠ的加入则降低了SOD2的乙酰化修饰水平。因此 ，PPⅠ可能是通过SIRT3使SOD2去乙酰化，增强SOD2活性，减轻UVB引起细胞凋亡，从而减缓细胞的紫外损伤。
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图 5 不同浓度PPⅠ对SOD2和乙酰基-赖氨酸蛋白表达的影响Figure 5. Effects of different concentrations of PPⅠ on the expression of SOD2 and acetyl-lysine protein3. 讨论
在皮肤外源老化的诸多诱因中，最主要的便是紫外线引起的细胞氧化应激。皮肤细胞在接受紫外线辐射时会产生高浓度的自由基，使线粒体内的电子传递链发生泄漏，产生活性氧，造成氧化应激，进而导致细胞凋亡[12]。SIRT3是位于线粒体基质中的一类去乙酰化酶，是一种NAD+依赖的脱乙酰基酶，它能够将ADP-核糖从NAD+转移至底物，并去掉底物中赖氨酸残基上的乙酰基，从而生成烟酰胺和去乙酰化的底物肽，许多转录后翻译的蛋白质经去乙酰化修饰可以激活其活性，是细胞能量代谢和氧化还原状态的关键调节器[13-15]。SOD2是位于线粒体基质中的一类超氧化物歧化酶，它以锰离子为活性中心，通过将超氧阴离子转化为毒性较低的过氧化氢使机体免受氧化应激的损伤[16-17]。SOD2的乙酰化水平与其清除自由基的能力息息相关[18]，SOD2作为SIRT3的去乙酰化反应底物之一，SIRT3的激活可进一步增加SOD2的活性，降低细胞的紫外损伤。因此，PPⅠ可能是通过SIRT3使SOD2去乙酰化，增强SOD2活性，减轻UVB引起的细胞凋亡，从而减缓细胞的紫外损伤。
PPⅠ作为甾体皂苷类物质，除了作为供氢体发挥清除自由基的功能外[10]，还能够通过抑制STAT3和VEGF蛋白的表达从而缓解缺氧引起的HaCaT细胞损伤[9]。LI等[19]研究发现：在细胞凋亡前的滞后期，PPⅠ通过有丝分裂促进了细胞的存活，延缓线粒体凋亡，进而降低细胞氧化损伤。这与本研究的结果基本一致，均证明了PPⅠ清除氧化应激的方式是多样的。本研究表明：低浓度的PPⅠ可以通过增加SIRT3和SOD2的表达缓解UVB引起的紫外损伤，降低细胞凋亡水平，但是，SIRT3与PPⅠ是否有直接的相互作用仍不清楚，还需要更加深入的研究。
4. 结论
PPⅠ可以通过增加SIRT3的表达和活化进一步激活SOD2，从而降低细胞内的ROS水平以减轻UVB引起的氧化应激，从而表现出抗氧化作用。本研究可为PPⅠ的抗皮肤紫外损伤机制提供一定的理论依据，同时可为深入开发抗皮肤紫外损伤的功能产品及含PPⅠ的天然产物应用提供新思路。
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图 1 不同浓度PPⅠ对HaCaT细胞存活率的影响
注：“*”“**”和“***”分别表示处理间在0.05、0.01和0.001水平上差异显著；ns. 无显著差异；下同。
Figure 1. Effects of different concentrations of PPⅠ on the cell survival rate of HaCaT cells
Note: “*” “**” and “**” indicate significant differences under 0.05, 0.01, and 0.001 level among treatments, respectively; ns. without significant differences; the same as below.
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图 2 不同浓度PPⅠ对紫外线损伤HaCaT细胞增殖的影响
注：a) 紫色越深表示细胞存活率越高。b) −. 空白组，+. UVB处理组；下同。
Figure 2. Effects of different concentrations of PPⅠ on the proliferation of HaCaT cells damaged by ultraviolet radiation
Note: a) the darker the purple, the higher the survival rate of cell. b) −. blank control group, +. UVB treatment group; the same as below.
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图 3 不同浓度PPⅠ对凋亡蛋白cleaved-PARP1表达(a和b)以及HaCaT细胞形态(c)的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of PPⅠ on the expression of apoptotic protein cleaved-PARP1 (a and b) and the morphology of HaCaT cell (c)
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图 4 不同浓度PPⅠ对SIRT3蛋白表达的影响
Figure 4. Effects of different concentrations of PPⅠ on the expression of SIRT3 protein
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