普通野生稻 (Oryza ruipogon Griff.) 的基因组为AA，是栽培稻的祖先近缘种，在长期野外恶劣环境中蕴含着如抗病、抗虫和抗各种非生物逆境等诸多优良性状，是维系稻种资源种质创新的重要资源库^[1-2]。云南元江普通野生稻生长在海拔780 m的高原，且在其原生境保护点周围5 km范围内从未发现和种植任何稻种资源，是现存世界上分布海拔最高、保存最完整、最原始的普通野生稻居群之一^[3-4]。亚洲栽培稻由普通野生稻进化而来，籼粳分化是亚洲栽培稻分化的主流。籼、粳稻是在自然和人工双重选择压力下经历漫长历史过程演化形成的在基因组及形态性状都发生深刻变化的2个亚种^[5-6]。栽培稻的籼粳亚种分别从已分化的普通野生稻独立演化而来，即普通野生稻在演化成栽培稻之前就已经发生了籼粳分化，因此，探究普通野生稻及其渗入系后代的籼粳属性及分化程度是研究栽培稻籼粳亚种起源的基础^{[1, 7-9]}。

鉴定稻属资源籼粳属性通常采用形态学鉴定和分子标记分类法。形态学鉴定主要采用程侃声等^[10-11]在前人基础上建立的以籼粳亚种间具有明显差别且易于观测的6个形态性状(稃毛、酚反应、第1~2穗节间长、抽穗时壳色、叶毛及谷粒长宽比)为主要指标的“程式指数法”，是广泛应用于育种及农业实践生产的籼粳鉴定方法。近年来，越来越多的分子标记被应用于稻属资源的籼粳分类研究，但早期使用较多的SSR^[12]、RFLP^[13]、RAPD^[14]及ILP^[15]等均不是针对籼、粳稻在DNA水平上的差异而设计的分子标记，故籼粳分类的准确性不高。随着分子生物学技术的迅猛发展，LU等^[16]根据籼稻9311和粳稻日本晴基因组序列比对而设计出可区分籼粳类型的InDel分子标记，在籼粳鉴定方面具有扩增效果好、稳定性高、扩增产物分离效果明显和操作简单等诸多优点，该标记不仅可以定性籼粳属性，还可以精准地量化籼粳分化程度。自上世纪80年代以来，王象坤等^[7]、陈成斌等^[17]、李小湘等^[18]及董轶博^[19]已先后对中国主要普通野生稻居群的籼粳属性进行了鉴定，但有关原始性较高的云南元江普通野生稻籼粳属性的报道相对较少，且这些报道大多仅采取单一的鉴定方法进行籼粳分类，鲜有同时采用2种分类方法对云南元江普通野生稻及其渗入系后代资源的籼粳鉴定报道。本研究首次同时从表观形态学和分子水平探讨云南元江普通野生稻及其渗入系后代的粳籼类型，对普通野生稻籼粳遗传背景的深入研究以及探索普通野生稻在栽培稻起源演化、遗传分化和育种应用等具有重要意义，同时也为充分发掘利用普通野生稻及其渗入系后代奠定科学基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试材料共计356份，包括合系35号1份、云南元江普通野生稻1份及其渗入系代表材料354份 (编号为YN1~YN354)。渗入系代表材料由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所以云南元江普通野生稻为父本、合系35号为母本进行远缘杂交，经胚挽救成苗后回交2次、自交15次，同时结合染色体原位杂交技术和分子标记辅助选择技术获得4 006份渗入系材料，从中通过田间筛选淘汰性状不稳定及综合性状较差的材料后最终获得。以粳稻日本晴和籼稻9311作为对照。

1.2   方法

1.2.1   材料种植

普通野生稻种植于云南省农业科学院玉溪市元江基地普通野生稻保护圃。渗入系和合系35号种植于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所易门实验基地，于2019年3月播种，5月单穴单苗移栽，每份材料种植4行，每行10株，行株距为20 cm×25 cm，田间水肥管理与当地大田生产一致。

1.2.2   形态学鉴定

按照程侃声等^[10-11]的“程式指数法”，每份资源标记中间行生长状态一致的5株，抽穗期调查其主穗抽穗时壳色和叶毛，成熟时取各株的主穗带回实验室调查其稃毛、酚反应、第1和第2穗节间长及谷粒长宽比等指标。

1.2.3   InDel分子标记鉴定

基因组DNA提取及PCR扩增：于分蘖盛期采集356份材料及对照品种的剑叶叶片，参照陈越等^[5]的方法提取DNA及PCR扩增。

InDel引物筛选：以普通野生稻、合系35号及两者渗入系后代中表型差异较大的20份材料与粳稻日本晴和籼稻9311全基因组DNA序列比对获得的45对InDel分子标记^[16]进行筛选，最终筛选出36对用于籼粳鉴定 (表1)。这36对InDel标记均匀分布于水稻的12条染色体，且在云南元江普通野生稻、合系35号以及表型差异较大的20份渗入系后代材料中均带型清晰、容易判读、无杂带。

表  1  用于云南元江稻属资源籼粳鉴定的InDel分子标记

Table  1.  InDel molecular markers used to identify indica-japonica of Oryza L. resources in Yuanjiang, Yunnan Province

标记 marker	扩增长度/bp amplified length		标记 marker	扩增长度/bp amplified length		标记 marker	扩增长度/bp amplified length
R1M7	37		R4M13	32		R8M33	38
R1M20	42		R4M17	51		R8M46	30
R1M30	49		R4M30	40		R9M10	43
R1M37	53		R4M43	34		R9M20	40
R1M47	51		R4M50	33		R9M42	48
R2M10	48		R5M13	32		R10M17	31
R2M26	38		R6M14	34		R10M30	19
R2M37	65		R6M30	34		R10M40	33
R2M50	42		R6M44	34		R11M23	42
R3M10	37		R7M7	67		R11M40	41
R3M23	36		R7M20	66		R12M27	33
R3M53	35		R8M23	36		R12M43	30
注：扩增长度为扩增籼稻9311与粳稻日本晴的差异片段长度。 Note: Amplified length is the length of fragment difference between indica 9311 and japonica Nipponbare.

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1.3   统计分析

程式指数法以稃毛、酚反应、第1~2穗节间长、抽穗时壳色、叶毛及谷粒长宽比等6个性状的综合分值判断356份资源的粳籼属性，总积分≤8为籼型、9~13为偏籼型、14~18为偏粳型、>18为粳型 (表2)。

表  2  程氏指数法鉴别稻属资源籼粳属性的性状及评分标准

Table  2.  Identification of indica-japonica characteristics of Oryza L. resources and scoring standard by Cheng’s index

性状 characters	评分及其标准 score and standard
	0	1	2	3	4
稃毛 lemma hair	短、齐、硬、直、匀 short, neat, hard, straight and even	硬、稍齐、稍长 hard, slightly homogeneous, slightly long	中或较长、不太齐、色略深 medium or long, uneven, slightly dark color	长、稍软、欠齐、不齐 long, slightly soft, uneven, irregular	长、乱、软 long, messy, soft
酚反应 phenol reaction	黑 black	灰黑或褐黑 greyish black or brownish black	灰 gley	微染色 micro staining	不染色 no staining
第1~2穗节间长/cm internode length of the first and second panicle	<2	2.1~2.5	2.6~3.0	3.1~3.5	>3.5
抽穗时壳色 glume color at heading	绿白 green white	白绿 white green	黄绿 yellow green	浅绿 light green	绿 green
叶毛 leaf hair	很多 a lot of	多 many	中 middle	少 few	无 not have
籽粒长宽比 grain length width ratio	>3.5	3.5~3.1	3.0~2.6	2.5~2.1	<2

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InDel分子标记法以粳稻日本晴和籼稻9311扩增产物的带型为标准，条带统计及籼、粳型基因频率的计算方法参考陈越等^[5]的报道；按照LU等^[16]的方法计算并统计356份稻属资源在36对InDel分子标记的籼型或粳型基因频率；按照表3中InDel分子标记籼粳属性的分类标准划分稻属资源的籼粳类别。

表  3  按照基因频率鉴定籼稻或粳稻的InDel分类标准

Table  3.  InDel classification standards based on indica or japonica gene frequencies

类型 type	基因频率 gene frequency
	籼型 indica type	粳型 japonica type
典型粳稻 typical japonica	≥0.10	≤0.90
粳稻 japonica	0.11~0.25	0.75~0.89
偏粳 japonicaclinous	0.26~0.39	0.61~0.74
中间类型 intermediate type	0.40~0.60	0.40~0.60
偏籼 indicaclinous	0.61~0.74	0.26~0.39
籼稻 indica	0.75~0.89	0.11~0.25
典型籼稻 typical indica	≤0.90	≥0.10

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2.   结果与分析

2.1   稻属资源的程式指数法鉴定结果

由图1、2可知：程式指数法的6项指标在普通野生稻、合系35号及来自同一亲本材料的渗入系后代之间差异明显。按照程式指数法的评分标准(表2)分别统计356份稻属资源的分值并对其籼粳类型进行划分，结果显示：普通野生稻6项指标的总分值为11分，属偏籼型；合系35号的总分值为24分，为粳型；在354份渗入系后代资源中有籼型179份，占所有后代材料的50.56%；偏籼型76份，占21.47%；粳型25份，占7.06%；偏粳型74份，占20.90%。程式指数法的鉴定结果表明：354份普通野生稻与合系35号杂交得到渗入系后代资源的籼粳分化明显，但大部分后代材料以籼型稻(籼型和偏籼型)资源为主。

图  1  云南元江普通野生稻和合系35号的程式指数法6个指标形态比较

注：H. 合系35号；Y. 云南元江普通野生稻；a) 稃毛；b) 酚反应；c) 第1~2穗节间的长度；d) 抽穗时壳色；e) 叶毛；f) 籽粒宽度；g) 籽粒长度；下同。

Figure  1.  Comparison of the six indexes of the Cheng’s index of Oryza rufipogon in Yuanjiang, Yunnan Province and Hexi 35

Note: H. Hexi 35; Y. O. rufipogon in Yuanjiang, Yunnan Province; a) lemma hair; b) phenol reaction; c) internode length of the first and second panicle; d) glume color at heading; e) leaf hair; f) grain width; g) grain length; the same as below.

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图  2  部分云南元江普通野生稻渗入系资源的程式指数法的指标形态比较

Figure  2.  Comparison index patterns of the Cheng’s index for some introgression lines of O. rufipogon in Yuanjiang, Yunnan Province

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2.2   稻属资源的InDel分子指数法鉴定结果

筛选出的36对引物均具有较好的籼粳特异性，356份稻属资源均能扩增出1条与日本晴/9311位置一致的带型，或2条位置分别与日本晴和9311一致的杂合带型。部分稻属资源引物扩增结果见图3。亲本资源普通野生稻和合系35号的籼粳类型分别为偏粳型和典型粳稻，其籼型、粳型基因频率依次为0.32、0.68和0.04、0.96。由普通野生稻的PCR扩增电泳结果可知：在36对InDel标记中，R1M30、R1M37、R1M47、R2M26、R2M37、R3M23、R3M53、R4M13、R4M17、R4M30、R6M14、R6M44、R7M7、R8M33、R9M10、R9M42、R10M17、R10M30、R10M40、R11M23、R12M27和R12M43等22对标记扩增出纯合粳型基因型带型，R1M7、R1M20、R2M10、R2M50、R3M10、R4M43、R5M13、R8M23和R8M46等9对标记扩增出纯合籼型基因型带型，而R4M13、R4M50、R7M20、R9M20和R11M40等5对引物则扩增出籼—粳杂合基因型带型，说明普通野生稻已发生一定程度的籼粳分化。

图  3  InDel引物R1M47扩增22份云南元江普通野生稻渗入系的多态性

注：M. DL1000 DNA Marker；N. 粳稻日本晴；9311. 籼稻9311；JJ. 纯合粳稻带型；II. 纯合籼稻带型；IJ. 籼粳杂合带型。

Figure  3.  InDel primer R1M47 amplified polymorphisms of 22 introgression lines of O. rufipogon in Yuanjiang, Yunnan Province

Note: M. DL1000 DNA Marker; N. japonica Nipponbare; 9311. indica 9311; JJ. homozygous japonica banding pattern; II. homozygous indica banding pattern; IJ. heterozygous type of indica-japonica.

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InDel分子标记所划分的7种籼粳类型在354份渗入系后代中均有出现，其中典型籼稻113份、籼稻84份、偏籼36份、中间类型29份、偏粳21份、粳稻24份和典型粳稻47份，普通野生稻渗入系资源中含有籼型血缘的籼型稻数量最多(233份)，表明354份渗入系资源籼粳分化明显，但大部分资源以籼型稻为主。

2.3   程式指数法与InDel分子指数法对稻属资源籼粳分类的比较分析

除普通野生稻和26份渗入系后代外，其他稻属资源经2种籼粳鉴定方法得到的结果基本一致。程式指数法和InDel分子指数法分别将普通野生稻划分为偏籼和偏粳；在鉴定结果不一致的26份渗入系后代中，YN351、YN343、YN334和YN344经程式指数法分别鉴定为粳稻、籼稻、籼稻和籼稻，而InDel分子指数法则将这些资源分别划分为典型籼稻、粳稻、偏粳和偏粳；YN33、YN45、YN56、YN83、YN84、YN91、YN92、YN104、YN105、YN109、YN116、YN123、YN126、YN129、YN208、YN211、YN214、YN293、YN338、YN340、YN348和YN354等22份资源经2种方法鉴定后划分的籼粳类型也都存在不同程度的差异。由此可见，程式指数法和InDel分子指数法的拟合度较高，可达92.42%，进一步表明这2种籼粳属性的鉴定方法都具有较高的准确性。2种籼粳分类方法均在354份渗入系后代中鉴定出较多的籼型稻资源，其中，程式指数法鉴定出籼型稻(籼稻和偏籼) 255份(占所有后代资源的72.03%)，InDel分子指数法鉴定出籼型稻(典型籼稻、籼稻和偏籼) 233份(占所有后代资源的65.82%)，表明在渗入系后代资源中以带有籼型血缘的资源为主。

3.   讨论

栽培稻的籼粳分化是栽培稻经历漫长历史演化后形成的2类在农业生态环境、表观形态以及基因组水平上均存在较大差异的栽培稻类型^{[6, 20]}。稻属资源的籼粳鉴定通常采用形态学鉴定和DNA水平上的分子标记法。目前，形态学鉴定主要采用经典的程式指数法，该法大多适用于遗传背景相对简单的籼型或粳型材料鉴定，具有观测和鉴别简便等优点，是农业育种生产上应用较为广泛的传统方法，但此法对操作者要求较高，需要具有一定经验才能准确判断调查对象的籼粳属性^[20]。随着分子生物学的不断发展，SSR、RAPD、RFLP和ILP等分子标记成为稻属资源籼粳分类的有效方法，但这些标记并非根据籼稻和粳稻的差异而设计，极大影响了鉴定结果的准确性^{[6, 12-15]}。随着粳稻日本晴和籼稻9311全基因组测序的完成，针对籼、粳稻基因组序列的特异性差异而设计的InDel标记为稻属资源的籼粳鉴定提供了成熟、准确的方法，该方法不仅可以准确、高效地鉴定籼粳类型，还可以精准地计算籼粳分化程度^[21-22]。王友林等^[6]、李小湘等^[18]和刘丹等^[23]先后验证了InDel标记在偏籼、偏粳、渗入大量亚种片段的中间型栽培稻、稻属的野生种及近缘种等遗传背景复杂资源籼粳属性鉴定的准确性。程式指数法是根据研究对象6个形态指标的综合分值将其分为籼型、偏籼型、偏粳型和粳型等4种类型；而InDel分子标记则根据研究对象的籼、粳基因频率将其进一步划分为7种类型(典型籼稻、籼稻、偏籼、中间型、偏粳、粳稻及典型粳稻)。本研究采用程式指数法和InDel分子指数法同时对356份稻属资源的籼粳类别进行鉴定，除遗传背景较为复杂、原始性较强的云南元江普通野生稻和极少部分渗入系后代外，其他329份稻属资源经2种籼粳鉴定方法所划分的籼粳类别基本一致，拟合度高达92.42%，证实了程式指数法和InDel分子指数法在鉴定稻属资源籼粳属性上均具有较高的可靠性。此外，InDel分子指数法鉴定籼粳属性时仅需小部分叶片即可分析，鉴定过程不需要经历完整的水稻生育期，受外界环境影响不大；而程式指数法比较简便、易于观测，可广泛应用于田间大规模水稻选育工作。

普通野生稻(O. ruipogon Griff.)是栽培稻的重要野生祖先种，具有极其丰富的变异类型和基因资源，是所有野生稻中研究和育种利用较为广泛和成熟的资源，普通野生稻在水稻起源进化、遗传分化、分类、重要基因发掘及维系稻种资源多样性等方面具有重要地位^[6-9]。近年来，中国主要普通野生稻居群籼粳分化研究工作相继展开。李小湘等^[18]以38对InDel籼粳特异性标记对江永普通野生稻3个不同年份(1982年、2008年及2017年)样本的籼粳属性及籼粳分化程度进行鉴定分析，结果表明：江永普通野生稻居群大部分属于粳稻，少数属偏粳型，且随着年份的增加粳稻逐渐向偏粳型分化。陈芬等^[24]对174份粤北普通野生稻的SSR籼粳特异性鉴定表明：除2份粤北普通野生稻资源为偏籼外，其余172份资源均为偏粳型。崔莹莹等^[14]和尹昭坤等^[25]先后用22对SSR引物和ITS序列克隆测序技术对海南普通野生稻居群的籼粳类型进行划分，结果表明：海南普通野生稻存在一定的籼粳分化。袁平荣等^[26]、孙传清等^[27]及李亚莉等^[4]先后采用RFLP标记、形态特征、同工酶和亲和性及SSR标记对云南元江普通野生稻的籼粳进行鉴定，结果表明：云南元江普通野生稻居群比较纯且原始，已经发生了籼粳分化但不明显，部分群体偏粳。本研究分别采用传统形态学鉴定的程式指数法和InDel分子指数法对云南元江普通野生稻、合系35号及两者杂交得到的354份渗入系后代的籼粳属性进行分析，程式指数法将普通野生稻划分为偏籼，而InDel分子指数法则根据各个InDel位点上的条带位置和籼、粳基因频率将其划分为偏粳，此结果与袁平荣等^[26]以形态特征和同工酶分析得到的结果相似。本研究中普通野生稻经程式指数法鉴定为偏籼而InDel分子标记则将其划分为偏粳，其原因可能是普通野生稻籼粳分化不明显，在形态上部分表型性状籼粳分化进度不一致，但2种籼粳属性的鉴定结果均表明普通野生稻中既有粳型血缘也有籼型血缘，充分体现了云南元江普通野生稻的原始性和分化不彻底性。

本研究中，程式指数法鉴定普通野生稻6项指标的总分值为11分，属偏籼型，合系35号总分值为24分，属粳型；而InDel分子指数法鉴定出的普通野生稻和合系35号的籼型基因频率分别为0.32和0.04，被划分为偏粳和典型粳稻。可见，在2种亲本材料中籼型成分较少。而在354份渗入系后代中，经2种籼粳鉴定分类的结果均是带有籼型血缘的材料居多，其原因可能与354份渗入系资源有关。这354份渗入系是从普通野生稻和合系35号杂交得到的4 006份资源中经多年田间调查筛选后留下的综合性状较优、遗传稳定的渗入系代表材料，即这些材料都经过人工选择，所以才有了亲本籼型成分不多但含有较多籼型材料后代的结果。

4.   结论

云南元江普通野生稻已发生籼粳分化，其形态学特征偏籼，但InDel分子指数法鉴定出的结果总体偏粳，充分说明普通野生稻的原始性和分化不彻底性。程式指数法和InDel分子指数法对其渗入系后代的籼粳鉴定结果基本一致，拟合度高达92.42%，其渗入系后代材料的籼粳分化明显，且以带有籼型血缘的材料居多，此结果与杂交后代筛选时的人工选择有关。